Nationalbibliografie;
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1. Auflage 2012
© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-0
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
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Zur Bedeutung von Peroxisomen im Metabolismus von degenerativen und neoplastischen Lebererkrankungen beim Hund
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Julia Schüttler
geb. Borchert Bad Kreuznach
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen Abteilung Infektionspathologie
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
Tierärztliche Hochschule Hannover Deutsches Primatenzentrum, Göttingen
2. Gutachterin: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pathologie
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2012
Meinem Vater, meiner Mutter und Raimund
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 11
2 Literaturübersicht ... 14
2.1 Das Peroxisom... 14
2.1.1 Morphologie ... 15
2.1.2 Funktion ... 18
2.1.3 Interaktion mit Mitochondrien ... 29
2.2 Kontrolle der Peroxisomenzahl ... 30
2.2.1 Biogenese und Proliferation ... 31
2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie ... 37
2.3 Hepatopathien des Hundes ... 39
2.3.1 Hepatozelluläre Degeneration ... 42
2.3.2 Verhalten der Peroxisomen bei degenerativen Veränderungen der Hepatozyten ... 48
2.3.3 Hepatitiden ... 49
2.3.4 Lebertumoren ... 51
3 Eigene Untersuchungen ... 57
3.1 Material und Methoden ... 57
3.1.1 Einleitung ... 57
3.1.2 Patienten ... 57
3.1.3 Lichtmikroskopische Untersuchung ... 63
3.1.4 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie ... 63
3.1.5 Auswertung und Dokumentation ... 65
3.1.6 Statistik ... 68
3.2 Ergebnisse ... 68
3.2.1 Zusammensetzung der Patientengruppen ... 69
3.2.2 Veränderungen der labordiagnostischen Leberwerte ... 72
3.2.3 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse ... 76
3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungsergebnisse ... 95
4 Diskussion ... 123
4.1 Lichtmikroskopische Untersuchungen ... 123
4.2 Elektronenmikroskopische Untersuchung ... 127
4.2.1 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche ... 128
4.2.2 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche/Alter ... 133
4.2.3 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche/Rasse... 133
4.2.4 Morphologische Untersuchungen ... 134
4.3 Beeinflussung der Peroxisomenzahl durch Medikamente ... 140
5 Zusammenfassung ... 142
6 Summary ... 145
7 Literaturverzeichnis ... 148
8 Abbildungsverzeichnis ... 166
9 Tabellenverzeichnis ... 172
10 Anhang ... 174
10.1 Protokolle für die Histologie ... 174
10.1.1 Fixierlösungen... 174
10.1.2 Färbungen ... 176
10.1.3 Laborprotokolle für Einbettungen ... 181
10.2 Anhangstabellen ... 182
Abkürzungsverzeichnis
ALT Alaninaminotransferase
ALKP Alkalische Phosphatase
AST Aspartataminotransferase
ATG autophagy-related genes
ß-Oxidation Beta-Oxidation
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CuZn SOD Kupfer-Zink Superoxiddismutase
d Tag
DNA Desoxyribonucleic acid
Elmi Elektronenmikroskopie
ggr. geringgradig
GLDH Glutamatdehydrogenase
GS Gallensäuren
HWZ Halbwertzeit
h Stunde
H2O2 Wasserstoffperoxid
hgr. hochgradig
IBD Inflammatory bowel disease
IL Interleukin
IFN γ Interferon gamma
JRT Jack Russel Terrier
KGW Körpergewicht
m/mk männlich/männlich kastriert
MDV Mitochondria derived vesicles
MAPL Mitochondria-anchored protein ligase
mgr. mittelgradig
M. Morbus
NASH non alcoholic steatohepatitis
nm Nanometer
NO Stickstoff
PD/PU Polydipsie/Polyurie
PEX Peroxin
PTS Peroxisomal targeting signal
PPO Peroxisomenproliferatoren
PPARs Peroxisome proliferator activated receptors
Px Peroxisom
rER raues (rough) Endoplasmatisches Retikulum
RHT Rauhaardackel
ROS Reactive oxygen species
sER glattes (smooth) Endoplasmatisches Retikulum
s Sekunde
SOD Superoxiddismutase
TGF β Transforming growth factor
TNFα Tumor necrosis factor alpha
vak. vakuolär
VLDL Very long density lipoprotein
WHWT Westhighland White Terrier
w/wk weiblich/weiblich kastriert
µm² Quadratmikrometer
1 Einleitung
Peroxisomen haben eine außerordentliche Bedeutung erlangt, da sie Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen in der Humanmedizin sind. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die Peroxisomen an zahlreichen humanen kongenitalen Erkrankungen beteiligt sind. „Lorenzo´s oil“ ist der Titel eines Filmes, der sehr eindrücklich das Leben eines Jungen erzählt, der an einer unerklärlichen Erkrankung leidet. Gleichgewichtsstörungen und letztlich schwere Hirnschädigungen sind Folgen dieser Erkrankung, bei der es sich um die „Adrenoleukodystrophie“
handelt. Intensive wissenschaftliche Untersuchungen der letzten Jahrzehnte führten zu der Erkenntnis, dass kleine Zellorganellen, Peroxisomen, die Ursache dieser Erkrankung sind. Das Zellweger Syndrom und die „Refsum disease“ sind weitere kongenitale peroxisomale Erkrankungen. Durch die Entdeckung der Peroxisomen 1954 durch RHODIN und die weiteren wissenschaftlichen Untersuchungen des belgischen Wissenschaftlers DE DUVE (1966) erlangte diese kleine Organelle eine immer größere Bedeutung. Ihre Beteiligung innerhalb komplexer physiologischer Vorgänge, wie Einbindung in den Wasserstoffperoxidstoffwechsel, die ß-Oxidation langer bis sehr langer Fettsäuren, die Synthese komplexer Substrate wie Cholesterine, Plasmalogene und Gallensäuren, sowie die Fähigkeit sich in Anwesenheit sogenannter Peroxisomenproliferatoren zu vermehren, machten sie zu einem spannenden Forschungsgebiet, vor allem in der Humanmedizin. Während sich die ersten Arbeiten mit den kongenitalen Erkrankungen der Peroxisomen befassten, folgten durch DE CRAEMER (1995) wissenschaftliche Untersuchungen zum Verhalten der Peroxisomen bei erworbenen Erkrankungen, wie Steatose, Hepatitis und Zirrhose, hervorgerufen durch verschiedene Noxen wie Alkohol, Viren und diverse Medikamente. Weitere Untersuchungen folgten zum Verhalten der Peroxisomen bei cholestatischen Prozessen der Leber, Hepatomen und extrahepatischen Tumoren mit oder ohne Lebermetastasen.
Die wissenschaftlichen Erkenntnisse über Peroxisomen in der Veterinärmedizin sind bis dato sehr gering. LAGING et al. (1988) untersuchten vergleichend das Verhalten
der Peroxisomen in Leber und Niere von Hunden der Rasse Beagle und Dalmatiner bei purinreicher und purinarmer Ernährung. Sie kamen zu der Erkenntnis, dass Dalmatiner unabhängig von der Ernährung größere und zahlreichere Peroxisomen haben als Beagle. Eine weitere Untersuchung von CENTER und Mitarbeitern (1993) befasste sich mit dem Verhalten der hepatischen Peroxisomen in an Lipidose erkrankten Katzen. CENTER et al. (1993) vermuteten dabei, dass eine Abnahme der Peroxisomen mit dem Krankheitsbild der hepatischen Lipidose einhergeht. Die ersten elektronenmikroskopischen Daten zur Morphometrie der hepatozellulären Peroxisomen des Hundes wurden 1973 erhoben. Dies erschien notwendig, da der Hund immer häufiger für pharmakologische und toxikologische Studien als Modell für humane Lebererkrankungen herangezogen wurde (HESS et al. 1973).
Elektronenmikroskopische und biochemische Untersuchungen aus der Humanmedizin zum Verhalten von Peroxisomen bei tumorösen und degenerativen Erkrankungen der Leber (HRUBAN 1979; DE CRAEMER et al. 1993) ergaben, dass bei degenerativen Erkrankungen, z.B. aufgrund von hepatischer Lipidose/Steatose und entzündlichen Prozessen, im Rahmen eines erhöhten oxidativen Stresses für die Hepatozyten, die Zahl der Peroxisomen ansteigt. Tumoröse Veränderungen der Leber, seien sie nun primären oder sekundären Ursprunges, führten dagegen in der Mehrzahl der Fälle zu einer Verminderung der Peroxisomen. Weiterhin haben Untersuchungen gezeigt, dass unter dem Einfluss des Tumornekrosefaktors die Bildung von Radikalen erheblich ansteigt. In einem solchen Fall ist die Kapazitätsgrenze der Peroxisomen erreicht, und es kommt zu einem Abbau dieser Organelle infolge zunehmender Zellzerstörung (YASMINEH et al. 1991). Es kann deshalb vermutet werden, dass die Anzahl der Peroxisomen in einem Verhältnis zum Grad der Malignität zu sehen ist. Weiterhin kann vermutet werden, dass therapeutische Maßnahmen, welche zu einer Peroxisomenvervielfältigung führen über eine Beeinflussung des oxidativen Stresses und Veränderungen bei der Energiegewinnung einen Einfluss auf die Leberzelle haben könnten. Angesichts dieser Informationen aus der Humanmedizin ist es Ziel dieser Arbeit, das Verhalten der hepatozellulären Peroxisomen im Metabolismus von Lebererkrankungen des Hundes elektronenmikroskopisch zu untersuchen. Dabei wurde insbesondere auf
quantitative und qualitative Unterschiede zwischen degenerativen und entzündlichen Veränderungen einerseits und malignen Tumoren der Leber andererseits eingegangen, um zu überprüfen, ob die von CRAEMER et al. (1993) bzw. HRUBAN (1979) gewonnenen Erkenntnisse auch auf den Hund übertragbar sind.
2 Literaturübersicht
2.1 Das Peroxisom
Peroxisomen kommen sowohl im Pflanzen- als auch im Tierreich vor. Es wurde von ihrem Vorkommen in Amphibien, Insekten, Schnecken, Würmern und Protozoen berichtet (MASTERS u. CRANE 1995).
Die Peroxisomen wurden erstmals 1954 durch RHODIN in Nierentubuluszellen von Ratten entdeckt, er gab diesen Zellorganellen zunächst den Namen „Microbodies“
(RHODIN 1954). Im Jahre 1956 wurden Zellorganellen, die den bereits beschriebenen „Microbodies“ der Niere sehr ähnlich waren, in Hepatozyten von Rattenlebern gefunden (Abbildung 2-1) (LAZAROW u. FUJIKI 1985).
Weitere Aufklärung haben in den 60iger Jahren die biomedizinischen Experimente von DE DUVE und BAUDHUIN (1966) erbracht, in denen Peroxisomen von Rattenlebern isoliert und deren enzymatische Ausstattung näher differenziert wurde.
Diese biochemischen Erkenntnisse führten dazu, dass der morphologisch geprägte Name „Microbody“ der funktionellen Bezeichnung „Peroxisom“ wich.
Die Isolierung der Peroxisomen und die anschließende zentrifugale Fraktionierung ihrer einzelnen Komponenten, wie das peroxisomale Core oder Nukleoid, die peroxisomale Matrix und die peroxisomale Membran, ermöglichten eine detaillierte Aufschlüsselung der enzymatischen Ausstattung der Peroxisomen. Darüber hinaus diente die Elektronenmikroskopie, insbesondere die zytochemische Färbung und die immunhistochemische Elektronenmikroskopie, der Aufklärung der Funktion, der Art und der Lokalisation der einzelnen peroxisomalen Enzyme und der Aufklärung der verschiedenartigen morphologischen Erscheinungsbilder (MASTERS u. CRANE 1995).
Im Folgenden wird vor allem auf den Aufbau der Peroxisomen und deren enzymatische Ausstattung im Hinblick auf die verschiedenen Funktionen eingegangen. Außerdem wird kurz das Peroxisom im Zusammenspiel mit anderen
Zellorganellen betrachtet. Im Anschluss werden die Mechanismen zur Regulation der Peroxisomenzahl in der Zelle besprochen, bevor ein allgemeiner Überblick zu den Hepatopathien des Hundes folgt.
Abbildung 2-1 Aufbau einer idealisierten tierischen Zelle (LÖFFLER et al. 2007)
2.1.1 Morphologie
Peroxisomen sind dynamische Organellen, die in Größe und Aussehen variieren können. Darüber hinaus sind sie in der Lage, ihre räumliche Position in der Zelle entlang des Zytoskelettes zu verändern (SCHRADER et al. 2003). Im Gegensatz zu den Lysosomen, die sich eher perikanalikulär aufhalten, folgt die Lage der Peroxisomen im Leberläppchen keinem festgelegten Muster (NOVIKOFF u.
GOLDFISCHER 1969). In gesunden Hepatozyten liegen die Peroxisomen homogen im Hepatozyten verteilt vor und das Auftreten von Peroxisomen in Gruppen ist üblich (ROELS et al. 1983).
Peroxisomen können eine sphärische bis längliche Gestalt haben (Abbildung 2-2), sich aber auch in Form eines tubulär-retikulären Netzwerkes darstellen, welches häufig mit Fetttropfen assoziiert ist (SCHRADER 2001).
Abbildung 2-2 Elektronenmikroskopische Darstellung eines Peroxisoms (Pfeil) mit Marginalplatte und Nukleoid. (P596-07/K1979), Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).
Peroxisomen besitzen im Zentrum einen dunklen homogenen Kern, der kristalline Strukturen enthält (BERNHARD u. ROUILLER 1956) und nach BAUDHUIN et al.
(1965) als Kern mit „amorpher und fein granulärer Struktur“ beschrieben wird. Der Kern, auch Nukleoid genannt, ist in Abhängigkeit zur Schnittebene des elektronenmikroskopischen Präparates nicht in allen Peroxisomen der Leber sichtbar. Ebenso abhängig von der Schnittebene ist das Erscheinungsbild des Nukleoids: feingranulär oder polytubulär (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Im
Längsschnitt haben die Nukleoide eine längliche rechteckige Gestalt, während sie im Querschnitt rund erscheinen. Sie liegen frei in der Matrix der Peroxisomen. Der Umfang der Nukleoide beträgt 0,69-0,74 µm (LAGING et al. 1988). Allgemein ist das Auftreten der Nukleoide in Leber und Nieren verbunden mit der Anwesenheit von Uratoxidase, so dass Organismen ohne Nukleoide auch nicht über das Enzym Uratoxidase verfügen. Es gibt aber Abweichungen davon, so dass Nieren von Ratten und Hepatozyten des Menschen keine Uratoxidaseaktivität zeigen, jedoch über Nukleoide verfügen und einige Nichtvertebraten, große Mengen an Uratoxidase beherbergen, aber keine entsprechend hohe Anzahl an Nukleoiden aufweisen (MASTERS u. CRANE 1995).
Die Membran der Peroxisomen besteht aus einer trilamellären Struktur, die eine Dicke von 4,5 bis 8 nm aufweist (HRUBAN et al. 1966). Damit ist sie deutlich dünner als die Membran von Lysosomen (MASTERS u. CRANE 1995).
Die Peroxisomen des Hundes sind 0,3-0,9 µm im Diameter und somit etwas kleiner als die Peroxisomen der Ratte. Die Peroxisomen in der Leber von Dalmatinern sind im Vergleich mit denen von Beagle deutlich größer und weisen eine höhere Dichte auf (LAGING et al. 1988). Peroxisomen des Hundes enthalten kristalloide Nukleoide, die aus 3-8 parallel verlaufenden Linien bestehen (SHNITKA 1966). Das Nukleoid des Peroxisoms beim Hund ist Sitz der Urikase (BAUDHUIN et al. 1965; HAYASHI et al. 1976; CHEVILLE 1994a). Peroxisomen in Zellen der kaninen Perianaldrüse (KUHN 1968) sowie der Leber und der Niere (HRUBAN u. RECHCIGL 1969) besitzen eine Marginalplatte, in Form einer elektronendichten Verdickung unter der Membran, die durchschnittlich 0,25-0,39 µm lang ist (LAGING et al. 1988). In diesem Teil des Peroxisoms ist die L-alpha-Hydroxysäureoxidase B lokalisiert (ZAAR 1992).
Die Peroxisomen des Hundes nehmen nur ca. 3,9 % des Zytoplasmas ein, obwohl ca. doppelt so viele in einer Zelle vorhanden sind wie Mitochondrien, die 24 % des zytoplasmatischen Volumens ausmachen (HESS et al. 1973).
Aufgrund ihrer charakteristischen morphologischen Eigenschaften sollen Peroxisomen auch ohne spezielle Färbung eindeutig von den häufig räumlich benachbarten Mitochondrien zu unterscheiden sein (BERNHARD u. ROUILLER
1956). Eine Abgrenzung von Lysosomen ist ebenfalls möglich, da Peroxisomen kleiner sind, ein homogeneres Erscheinungsbild besitzen, häufig zentral ein Nukleoid aufweisen und eng mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziiert sind (SHNITKA 1966). Darüberhinaus sind Lysosomen in der Lage Substrate zu inkorporieren, eine Eigenschaft, die den Peroxisomen fehlt (SHNITKA 1966).
Im Rahmen eines schnellen Zellwachstums können die Peroxisomen sehr verschiedenartige und komplexe Formen annehmen. Dieses Phänomen kann beispielsweise durch eine partielle Hepatektomie, Stimulation mit Wachstumsfaktoren, Zugabe freier Fettsäuren oder freier Radikale provoziert werden (SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999).
2.1.2 Funktion
Die Peroxisomen sind in ein großes Spektrum an Aufgaben und Funktionen in der eukaryontischen Zelle involviert (PLATTA u. ERDMANN 2007). Sie sind besonders an Oxidations- und Detoxifikationsvorgängen beteiligt (CHEVILLE 1994e). Die Aufgaben der Peroxisomen variieren je nach Organismus, Gewebe und der Umgebung, in der sie sich befinden. Daher verfügen sie in den einzelnen Geweben über unterschiedliche Enzymausstattungen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992) mit über 50 verschiedenen Enzymen (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Davon sind die meisten ausschließlich in Peroxisomen lokalisiert, während einige außerdem in Mitochondrien vorkommen (WANDERS u. WATERHAM 2006). Trotz der großen enzymatischen Variation gilt jedoch das Auftreten von Oxidase und Katalase in den Peroxisomen als konstant und dient somit ihrer Charakterisierung und Identifizierung (MASTERS u. CRANE 1995).
Mehr als siebzig Prozent der peroxisomalen Enzyme befinden sich in der Matrix.
Einige wenige Enzyme sind im Nukleoid lokalisiert und der verbleibende Anteil ist in der einfachen Membran der Peroxisomen angesiedelt (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).
Das Aufgabenspektrum ist sehr komplex und umfasst den Peroxidmetabolismus, die ß-Oxidation sowie die Biosynthese von Etherphospholipiden (Plasmalogene), welche
besonders im Nervensystem zu finden sind. Die Synthese von Cholesterol, Gallensäuren, Leukotrienen, Prostaglandinen und der Metabolismus von Xenobiotika obliegt ebenfalls den Peroxisomen. Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil von Membranen und dient als Komponente von Lipoproteinen. Darüber hinaus ist es an der Synthese von Gallensäuren und Steroiden beteiligt (MASTERS u. CRANE 1995).
Da Peroxisomen auch am Abbau insbesondere von sehr langkettigen Fettsäuren beteiligt sind, haben ihre Abwesenheit oder das Fehlen eines ihrer Enzyme, wie Katalase oder Oxidase, metabolische Konsequenzen. Zahlreiche angeborene Erkrankungen, darunter das Zellweger Syndrom, lassen Peroxisomen in den Körperzellen missen und führen dadurch zu schweren körperlichen Anomalien, die mit einem Überleben über das Säuglingsalter hinaus nicht vereinbar sind. Ein anderes Beispiel ist der Urikasedefekt des Dalmatiners, bei dem das dunkle Zentrum des Peroxisomes, als Sitz der Urikase definiert, beim Dalmatiner deutlich kleiner ausgeprägt ist als bei anderen Hunderassen. Das klinische Bild ist durch deutlich erhöhte Harnsäureaussscheidung charakterisiert mit der Gefahr der Uratsteinbildung in den harnbildenden und –ableitenden Wegen (CHEVILLE 1994a).
Im Folgenden werden die wichtigsten Funktionen und Aufgaben der Peroxisomen näher erläutert.
2.1.2.1 Peroxidmetabolismus
Eine der wichtigsten Funktionen der Peroxisomen ist die Neutralisierung von freien Radikalen mit Hilfe enzymatischer Mechanismen, die im Folgenden besprochen werden.
Oxidativer Stress ist ein Zustand der Imbalanz zwischen prooxidativ wirkenden Komponenten (Oxidantien) und antioxidativ wirkenden Abwehrmechanismen (Antioxidantien), der durch einen Überschuss an freien Radikalen gekennzeichnet ist (DJORDJEVIC 2004). Der Redox Status ist dabei ein übergeordneter Begriff, der beide Mechanismen zusammenfasst (WEBB u. TWEDT 2008).
Freie Radikale wirken prooxidativ, da sie ein oder mehrere ungepaarte Elektronen aufweisen (WEBB u. TWEDT 2008). Zu dieser Gruppe gehören das Superoxid- Radikal O2-, das Hydrogen Radikal H•, das Hydroxyl Radikal OH• und das Hydrogen Peroxid Radikal H2O2 (DJORDJEVIC 2004). Diese sind in der Lage, unterschiedliche Biomoleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren (DJORDJEVIC 2004) anzugreifen und in ihrer Funktion schwer zu beeinträchtigen (LÖFFLER et al. 2007).
Die meisten freien Radikale stammen vom Sauerstoff ab, dann bezeichnet man sie auch als reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS=reactive oxygen species). Die Radikalbildung ist unweigerlich an die mitochondriale Energieproduktion gekoppelt (GEROK 1995; MANDELKER 2008; WEBB u. TWEDT 2008). Die Reduktion des Sauerstoffes während der mitochondrialen Atmungskette erzeugt freie Radikale wie das Superoxidradikal (MANDELKER 2008). Die zweite Gruppe der Radikale stammt von Stickstoff ab und wird als Gruppe reaktiver Nitrogenverbindungen (RNS) bezeichnet (MANDELKER 2008). Der gesunde Organismus wandelt ein Viertel des eingeatmeten Sauerstoffes zu Radikalen um. Bei Krankheit werden sogar drei Viertel des inspiratorischen Sauerstoffes in Radikale umgesetzt (DJORDJEVIC 2004).
Freie Radikale sind an der Pathogenese von zahlreichen Krankheitsprozessen beteiligt, beeinflussen das Immunsystem negativ und beschleunigen den Alterungsprozess der Zelle (DJORDJEVIC 2004; MANDELKER 2008; CAMOES et al. 2009). So können zahlreiche unterschiedliche Ursachen wie Toxämien, Infektionen, hypoxisch-ischämische Zustände, Hyperglykämien, die Verstoff- wechslung von Xenobiotika, Hyperlipidämien, Hyperproteinämien, Neoplasien, Entzündungen sowie Immunreaktionen und erhöhte metabolische Raten oxidativen Stress auslösen. Vor allem bei alternden Geweben kann ein zu niedriger ATP Gehalt, bedingt durch eine ungenügende mitochondriale Produktion, zu erhöhtem oxidativen Stress führen (MANDELKER 2008). Außerdem entstehen freie Radikale bei Absorption von Strahlung, dem Metabolismus von Ethanol in Hepatozyten und Lipidperoxidation von ungesättigten Fettsäuren (DJORDJEVIC 2004). Der Vorgang der Lipidperoxidation wird dabei selbst auch durch freie Radikale in Gang gesetzt und dann durch sekundär gebildete Radikale aufrecht erhalten, welche das umliegende Gewebe schädigen und so eine Kettenreaktion auslösen. Von der
Lipidperoxidation sind besonders die sehr empfindlichen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren als Bestandteil von Zellmembranen und intrazellulären Organellen betroffen (DJORDJEVIC 2004).
Die Folge der Lipidperoxidation ist eine Zunahme der Membranpermeabiltät, so dass die Integrität von Zellorganellen wie Peroxisomen, Mitochondrien und Lysosomen herabgesetzt wird. Darüber hinaus werden Enzyme und Rezeptoren inaktiviert.
Letztlich kann die Peroxidation zur Zerstörung aller Lipidmembranen führen (HARMAN 1956). Mit der Zerstörung von Zellorganellen, wie z.B. den Mitochondrien, beginnt der Alterungsprozess der Zelle, da die Energieproduktion abnimmt, vermehrt freie Radikale anfallen und der oxidative Stress zunimmt, was wiederum zu einer weiteren Zellschädigung führt (WALLACE 2001). Zusammenfassend kann also der oxidative Schaden, verursacht durch freie Radikale, entweder die Ursache aber auch die Folge mitochondrialer Dysfunktion sein (MANDELKER 2008).
Der Entstehung von Tumoren liegen Mutationen und unkontrollierte Zellproliferationen zu Grunde. Die chronische Exposition durch oxidativen Stress kann Mutationen der DNA zur Folge haben, die zur Expression modifizierter Gene führen und somit das Wachstum von Tumoren unterstützen. Daher wird dem oxidativen Stress auch eine Beteiligung an der Karzinogenese zugesprochen (DJORDJEVIC 2004; KLAUNIG u. KAMENDULIS 2004).
Antioxidantien
Antioxidative Mechanismen wirken den freien Radikalen entgegen und können in enzymatische und nicht enzymatische Prozesse eingeteilt werden. Im Folgenden werden nur die enzymatischen Antioxidantien besprochen, da diese in Peroxisomen vorkommen. Zu dieser Gruppe gehören die Katalase, als ein Bestandteil der Peroxisomen, die Glutathionperoxidase und die Superoxiddismutase (SOD) (GEROK 1995; SCHRADER u. FAHIMI 2004). Glutathionperoxidasen sind wichtige Bestandteile des antioxidativen Schutzsystems aller Zellen, kommen aber auch im Extrazellularraum vor (LÖFFLER et al. 2007). Das Enzym ist in der Matrix und in den Mitochondrien lokalisiert und kann als ein alternatives Enzym zur Katalase betrachtet werden. Es ist in der Lage, organische Peroxide, wie Lipidperoxide (CHEVILLE
1994b; DJORDJEVIC 2004; LÖFFLER et al. 2007) oder Wasserstoffperoxide abzubauen, wenn die Katalaseaktivität ausgeschaltet ist, wie z.B. im Falle einer Endotoxämie oder des Ischämie-Reperfusionssyndroms (SINGH et al. 1994).
Die Superoxiddismutase (SOD) existiert in verschiedenen Varianten mit unterschiedlichen Metallionen im aktiven Bereich des Enzyms. CuZn SOD findet sich im Zytoplasma, im Kern und in Peroxisomen von Säugetieren (DJORDJEVIC 2004).
Weiterhin existiert eine SOD im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten (MARKLUND 1980). Eine erhöhte Aktivität der SOD wird über Zytokine wie IFN γ induziert, während eine verminderte Aktivität über TNFα und TGF β eingeleitet wird (MARKLUND 1992). Die SOD unterstützt die Beseitigung von Superoxidanion- und Hydroxyperoxidradikalen, indem das weniger reaktionsfähige Wasserstoffperoxid und molekularer Sauerstoff entsteht (GEROK 1995). Das Wasserstoffperoxid dient dann wiederum der Katalase als Substrat (MASTERS u. CRANE 1995;
ANGERMULLER et al. 2009).
Peroxisomen verfügen sowohl über Oxidasen, die Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduzieren können, als auch über Katalasen, die Wasserstoffperoxid zu Wasser reduzieren (BAUDHUIN et al. 1965; DE DUVE u. BAUDHUIN 1966; SHNITKA 1966).
Die Enzyme Katalase und einige Oxidasen sind in der Matrix lokalisiert (BAUDHUIN et al. 1965). Es existieren verschiedene Oxidasen, die ein spezielles Endprodukt und zusätzlich Wasserstoffperoxid produzieren. Zu den peroxisomalen Oxidasen gehören die L-α-Hydroxyacid-Oxidasen A und B. Hydroxyacid-Oxidase A ist in der Matrix und Hydroxyacid-Oxidase B ist in der Marginalplatte lokalisiert. Beide Enzyme finden sich insbesondere in Leber und Niere. Eine weitere Oxidase, die D-Aminoacid-Oxidase, ist außer in den Peroxisomen auch frei im Zytosol der Zelle vorhanden (MASTERS u.
CRANE 1995).
Die Produktion und Reduktion der Wasserstoffperoxide mittels Katalase sowie die Entgiftung anderer reaktiver Sauerstoffradikale schützt Zellen vor oxidativen Schädigungen (TERLECKY et al. 2006). Die Katalase ist ein ubiquitäres Enzym (SHARMA et al. 1989), das 40 % des peroxisomalen Proteins ausmacht (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966) und eine besonders hohe Aktivität in der Leber aufweist. Außer
in Peroxisomen ist das Enzym auch in Mitochondrien lokalisiert, eine für die Zelle günstige Lage, da hier viele Wasserstoffperoxid produzierende Enzyme ansässig sind (SHARMA et al. 1989).
Die Katalase unterstützt sowohl katalytische als auch peroxidative Reaktionen.
Beide Reaktionen benötigen Wasserstoffperoxid. Im katalytischen Fall kommt ein zweites Wasserstoffperoxid zur Reaktion dazu und es entsteht Wasser und Sauerstoff. In der peroxidativen Reaktion reagiert Wasserstoff mit weiteren Wasserstoffdonatoren, wie Alkoholen, Phenolen, Nitriten, Formaldehyd und primären Aminen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; GEROK 1995; MASTERS u.
CRANE 1995).
Katalytische Reaktion: H2O2 + H2O 2H2O + O2
Peroxidative Reaktion: H2O2 + RH2 2H2O + R
Peroxiosmen verfügen über zahlreiche weitere Enzyme. Eine umfassende Übersicht bieten Kapitel 2 („Enzymology“) und Kapitel 3 („Intraparticulate organization of peroxisomal proteins-methodology and topology“) des Buches „The peroxisome: a vital organelle“ von Colin Masters und Denis Crane (MASTERS u. CRANE 1995).
Rolle der Mitochondrien bei oxidativem Stress
Mitochondrien werden ursächlich durch Hypoxie, freie Radikale und Toxinbelastung geschädigt (VIEIRA u. KROEMER 1999).
Neben den vielseitigen, für die Zelle nützlichen Aufgaben, tragen die Mitochondrien aber auch selbst zur Radikalbildung bei (ROTH 1997). O2- und H2O2 reagieren häufig mit Eisen, das sich in den Mitochondrien befindet. Dadurch kann die mitochondriale DNA geschädigt werden. Die Folge dieser Schädigung ist eine Verstärkung des oxidativen Stresses aufgrund Expression veränderter Proteine, die verantwortlich für die Elektronentransportkette sind. Es entsteht ein Circulus vitiosus mit verstärkter
Radikalbildung (LEE u. WEI 1997) Unter physiologischen Bedingungen werden die Radikale durch Antioxidantien neutralisiert (ROTH 1997). Das wichtigste Antioxidans zum Schutz der Mitochondrien ist Glutathion (MANDELKER 2008). Bei Krankheitszuständen, z.B. Sepsis, reichen diese Mechanismen jedoch nicht aus und erschöpfen (ROTH 1997). Oxidativer Stress der Mitochondrien kann zu einer Aktivierung der Mitochondrienexpression führen und damit zu Erhöhung der Organellenanzahl (MANDELKER 2008). Neben dem Enzym Glutathion schützen erhöhte peroxisomale Katalasekonzentrationen die Mitochondrien vor Fehl- funktionen, während niedrige Konzentrationen zu einer mitochondrialen Dysfunktion führen können (KOEPKE et al. 2008).
2.1.2.2 ß-Oxidation
In der Pilz- und Pflanzenzelle ist dieser biochemische Vorgang ausschließlich in den Peroxisomen lokalisiert. In eukaryontischen Zellen findet die ß-Oxidation sowohl in Mitochondrien als auch in Peroxisomen statt, mit dem Ziel, die Lipidhomöostase aufrechtzuerhalten (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).
Das peroxisomale ß-Oxidationssystem dient über etwa fünf hintereinander ablaufende ß-Oxidationszyklen der Verkürzung von sehr langen und toxischen Fettsäuren (REDDY u. MANNAERTS 1994; MASTERS u. CRANE 1995;
HASHIMOTO 1999). Kurze Fettsäuren (<C8) sind kein geeignetes Substrat für Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992). Die peroxisomale Oxidationsrate der Fettsäuren durch die Peroxisomen nimmt bei gleichzeitig sich verkürzender Kettenlänge ab. Ungesättigte Fettsäuren werden dahingegen bevorzugt von den Peroxisomen oxidiert (MASTERS u. CRANE 1995).
Die daraus hervorgehenden kurz- und mittellangen Fettsäuren erreichen dann das ß- Oxidationssystem der Mitochondrien. Diese Verstrickung der Stoffwechselwege zeigt das enge Verhältnis von Mitochondrien und Peroxisomen (LAZAROW 1978;
HASHIMOTO 1987; MASTERS u. CRANE 1995). Der weitaus größte Anteil der langen Fettsäuren wird in Mitochondrien der ß-Oxidation unterzogen. Die Begründung liegt darin, dass die mitochondriale ß-Oxidation im Hinblick auf die
Energiegewinnung um das zweifache effektiver ist als die peroxisomale ß-Oxidation der Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).
Die Enzyme zur peroxisomalen ß-Oxidation befinden sich in der Matrix. Dabei unterliegt die peroxisomale Enzymausstattung einer Dynamik, die von dem Gewebe, der Spezies und den Rahmenbedingungen sowie dem Einfluss von Umweltfaktoren oder Xenobiotika abhängt (MASTERS u. CRANE 1995).
Die eigentliche ß-Oxidation gesättigter Fettsäuren verläuft in vier Schritten (Abbildung 2-3):
1) Acyl-CoA wird mittels Acyl-CoA-Dehydrogenase zu 2-trans-Enoyl-CoA oxidiert, dabei entsteht Wasserstoffperoxid.
2) Hydratationsschritt mittels Enoyl-CoA-Hydratase mit Zwischenprodukt L- Hydroxyl-CoA.
3) Oxidationsschritt mittels L-3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase mit dem Zwischenprodukt 3-Ketoacyl-CoA
4) Aus 3-Ketoacyl-CoA entsteht durch das Enzym ß-Ketoacyl-CoA-Thiolase, mittels der thiolytischen Spaltung des Ketoacyl-CoAs, ein Acetyl-CoA und eine um zwei C-Atome verkürzte aktivierte Fettsäure, die wieder in den ß- Oxidationszyklus einfließen kann (LAZAROW 1978; HASHIMOTO 1987)
Abbildung 2-3 Abbau geradzahliger Fettsäuren durch β-Oxidation (LÖFFLER et al. 2007)
Der Vorgang der ß-Oxidation beginnt mit der Aktivierung der Fettsäure. Die peroxisomale Membran besitzt zwei Acyl-CoA-Synthetasen, die an der Aktivierung von langen (C14-C20) und sehr langen Fettsäuren (>C20) beteiligt sind (MANNAERTS et al. 1982; SINGH u. POULOS 1988; LAZO et al. 1990; LAGEWEG et al. 1991). Zur Aktivierung werden ATP und Coenzyme A benötigt (MASTERS u. CRANE 1995). Da in Peroxisomen vor allem die Oxidation sehr langer Fettsäuren stattfindet, zeigen Patienten mit Peroxisomenmangel eine erhöhte intrazelluläre Anhäufung von sehr langen Fettsäuren (MASTERS u. CRANE 1995).
Im Folgenden werden die wichtigsten Unterschiede zwischen peroxisomaler und mitochondrialer ß-Oxidation in tabellarischer Form aufgezeigt:
Tabelle 2-1 Unterschiede peroxisomaler und mitochondrialer β-Oxidation
Funktion ß-Oxidation
(Peroxisom)
ß-Oxidation (Mitochondrien) Fettsäuretransport in die Organelle
(MANNAERTS et al. 1979; MASTERS u.
CRANE 1995)
membranständiges Transportsystem, Carnithin unabhängig
Carnithin abhängig
Energieweiterverarbeitung (LAZAROW u.
DE DUVE 1976; MANNAERTS et al.
1979)
Abgabe von Wärme
Verknüpfung mit oxidativer
Phosphorylierung/Elektronentransportkette
Ablauf der ß-Oxidation (LAZAROW 1978) unvollständig,
lediglich Verkürzung von Fettsäuren
vollständig
Funktion der ß-Oxidation (LAZAROW 1987; HAYASHI u. MIWA 1989; HAYASHI u. TAKAHATA 1991;
OSMUNDSEN et al. 1991)
Substratbereitstellung für anabole Vorgänge (Cholesterin- u. Gallen- säuresynthese, Phospholipide)
Eliminierung schlecht
verstoffwechselbarer Verbindungen
Bereitstellung von Energie für zelluläre Abläufe
Enzymatische Ausstattung (MASTERS u. CRANE 1995)
3 Enzyme 4 Enzyme
Energiestatus der Zelle
(MASTERS u. CRANE 1995) ATP unabhängig
ATP abhängig
steigt mit sinkendem ATP Gehalt
2.1.2.3 Weitere Funktionen der Peroxisomen
Synthese der Plasmalogene
Die Peroxisomen verfügen über eine enzymatische Ausstattung zur Synthese von Plasmalogenen. Diese werden außer in den Peroxisomen auch im Endoplasmatischen Retikulum hergestellt (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992). Im menschlichen Organismus bilden die Plasmalogene 18 % der gesamten Phospholipide (WANDERS u. WATERHAM 2006) und machen mehr als 80 % des Phospholipidgehaltes der weißen Substanz im Gehirn aus (WANDERS 2004a).
Cholesterinsynthese
Außerdem enthalten Peroxisomen Anteile der enzymatischen Ausstattung zur Bildung des Cholesterols (WANDERS u. WATERHAM 2006). Die Menge des in den Peroxisomen produzierten Cholesterols ist jedoch im Vergleich zur Cholesterol- synthese des Endoplasmatischen Retikulums sehr klein. Die physiologische Rolle
der peroxisomalen Cholesterolsynthese ist bis jetzt unklar (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).
Harnsäurestoffwechsel
Das Enzym Uratoxidase oder auch Urikase ist am Purinkatabolismus beteiligt und findet sich in den meisten Säugetierperoxisomen (USUDA et al. 1988). Dort ist es, wie auch die Xanthinoxidase bevorzugt, im Nukleoid lokalisiert. Es gibt jedoch auch Vertebraten, die eine nennenswerte peroxisomale Aktivität dieses Enzyms aufweisen, ohne Nukleoide zu besitzen (MASTERS u. CRANE 1995). Die Xanthinoxidase verstoffwechselt Xanthin zu Harnsäure, während die Uratoxidase die Oxidation von Urat mit Hilfe von molekularem Sauerstoff zu Allantoin katalysiert (MASTERS u. CRANE 1995). Bei einigen Neuweltaffen und dem Menschen fehlt die Uratoxidase in hepatozellulären Peroxisomen, sodass bei diesen Spezies Harnsäure als Endprodukt des Purinkatabolismus ausgeschieden wird (USUDA et al. 1988;
MASTERS u. CRANE 1995). Primaten verfügen dagegen über eine gewisse Leberuratoxidaseaktivität und zeigen daher nur niedrige Harnsäurespiegel (MASTERS u. CRANE 1995).
Die Gicht des Menschen ist eine Erkrankung in Folge des Mangels an Uratoxidase (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; HAYASHI et al. 2000). Es ist das einzige peroxisomale Enzym, das in der veterinärmedizinischen Literatur für den Hund beschrieben ist und befindet sich in den hepatozellulären Peroxisomen im Nukleoid (LAGING et al. 1988). Der Dalmatiner besitzt im Vergleich zum Beagle eine höhere Anzahl und auch größere Peroxisomen. Es handelt sich hier um einen kompensatorischen Mechanismus, um einer erhöhten Harnsäurekonzentration im Blut vorzubeugen. Die Unfähigkeit der Hepatozyten des Dalmatiners, aus Harnsäure mittels der in den Peroxisomen lokalisierten Urikase Allantoin zu synthetisieren, liegt jedoch nicht an dem bei dieser Rasse vorherrschenden Urikasemangel, sondern aufgrund eines Transportdefektes, an einer verminderten Fähigkeit der Hepatozyten, die Harnsäure in die Hepatozyten hineinzutransportieren (GIESECKE et al. 1985;
LAGING et al. 1988).
2.1.3 Interaktion mit Mitochondrien
Peroxisomen sind Organellen, die nicht isoliert im Zytoplasma liegen, sondern aufgrund metabolischer Zusammenhänge mit anderen subzellulären Strukturen, wie den Mitochondrien, dem Endoplasmatischen Retikulum, Fetttropfen und dem Zytosol assoziiert sind (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).
Wie bereits beschrieben, ist die ß-Oxidation ein grundlegender Mechanismus, der ebenso wie die Thermogenese sowohl in Peroxisomen als auch in Mitochondrien stattfindet (REDDY u. MANNAERTS 1994; WANDERS 2000, 2004b). Darüber hinaus teilen sie sich Komponenten in der Zelle, die zur Organellenteilung notwendig sind (SCHRADER 2006; SCHRADER u. YOON 2007). Vor kurzem wurde ein Transportmechanismus zwischen Mitochondrium und Peroxisom entdeckt (NEUSPIEL et al. 2008), der dazu dienen könnte, Metabolite, Lipide oder Proteine zwischen den beiden Organellen auszutauschen (KOCH et al. 2005). Dazu befindet sich an der äußeren mitochondrialen Membran eine Ligase MAPL (mitochondria- anchored protein ligase), welche ein „RING-Finger Motiv“ umfasst und die Morphologie der Mitochondrien reguliert. Diese MAPL Struktur kann dann in Form von Vesikeln (MDV=mitochondria derived vesicles) von Mitochondrien abschnüren und später mit Peroxisomen verschmelzen. Somit teilen sich Mitochondrium und Peroxisom nicht nur wichtige Regularien zur Teilung, sondern sind auch über metabolische Funktionen eng miteinander verknüpft (NEUSPIEL et al. 2008). Eine andere Funktion der MDV´s könnte der Rücktransport von zu den Mitochondrien fehlgeleiteten peroxisomalen Membranproteinen sein, was häufig unter experimentellen Bedingungen beobachtet wird (SACKSTEDER et al. 2000).
2.2 Kontrolle der Peroxisomenzahl
Die Zelle hat die Fähigkeit auf metabolischen oder umgebungsbedingten Stress zu reagieren, indem sie die Zahl der Peroxisomen erhöht, bei Bedarf jedoch auch überschüssige oder geschädigte Organellen entfernt (YAN et al. 2005).
Peroxisomen sind Zellorganellen, die sich sowohl über Wachstum und Teilung vermehren, als auch aufgrund ihrer engen Assoziation mit dem Endoplasmatischen Retikulum neu gebildet werden können (GRABENBAUER et al. 2000; SCHRADER u. FAHIMI 2006).
Die Peroxisomen sind sehr stark in Hepatozyten vertreten. In einem Hepatozyten finden sich bis zu 1000 Peroxisomen in enger Verbindung zum Endoplasmatischen Retikulum (CHEVILLE 1994e). Weiterhin findet man sie in großer Zahl in renalen Tubuluszellen und in steroidsynthetisierenden Zellen (CHEVILLE 1994e).
Die Verteilung von Peroxisomen innerhalb einer Zelle bzw. im Zellverband bedarf der Bewegung einzelner Organellen. Für diesen Zweck benötigen die Peroxisomen der Säugetiere auf Mikrotubuli basierende Filamente (SCHRADER et al. 2003). Die Motilität der Organelle dient dazu, eine gleichmäßige Verteilung innerhalb der Zelle aufrechtzuerhalten, mit anderen Peroxisomen oder anderen Zellorganellen in Kontakt zu treten oder auch Zellkompartimente zu erreichen, die aufgrund der metabolischen Situation Peroxisomen benötigen (SCHRADER et al. 2003). Es können zwei Bewegungsarten unterschieden werden. Die erste Variante beinhaltet eine langsame, nicht gerichtete Bewegung, der sich ca. 95 % der Peroxisomen bedienen.
Sie benötigt keine Mikrotubuli und ist energieunabhängig. Die zweite Möglichkeit der Bewegung ist eine energieverbrauchende, schnelle, gerichtete Motilität, die an Mikrotubuli gekoppelt ist (WIEMER et al. 1997). Weitere Untersuchungen der Peroxisomenmotilität an kultivierten Zellen ergaben, dass sich elongierte oder retikulär ausgerichtete Peroxisomen langsamer und ohne Mikrotubuli bewegen, während sphärische Peroxisomen deutlich schneller entlang des Mikrotubulisystems ihre Lokalisation verändern können (SCHRADER 2001).
In eukaryontischen Zellen gibt es drei verschiedene Wege, die die Anzahl der Peroxisomen in der Zelle beeinflussen können (YAN et al. 2005).
Einer der drei Mechanismen umfasst die Peroxisomenteilung im Rahmen der Zellteilung mit Aufteilung der Organellen auf die Tochterzellen (VEENHUIS et al.
2003). Der zweite Mechanismus beinhaltet die Autophagie von überflüssigen oder geschädigten Peroxisomen (FARRE u. SUBRAMANI 2004; YAN et al. 2005). Der letzte Vorgang umfasst die übermäßige starke numerische Zunahme von Peroxisomen in kurzer Zeit unabhängig vom Zellzyklus; dieser Vorgang wird allgemein als Peroxisomenproliferation bezeichnet (YAN et al. 2005).
2.2.1 Biogenese und Proliferation
Die Neuentstehung der Peroxisomen war und ist ein ständiger Diskussionspunkt (PLATTA u. ERDMANN 2007) und seit ihrer Entdeckung 1954 gibt es dazu viele Theorien (BERNHARD u. ROUILLER 1956).
Die ersten Untersuchungen, die zur Aufklärung der Biogenese von Peroxisomen in eukaryontischen Zellen beitrugen, wurden an Hefen und Pflanzen durchgeführt und die daraus gewonnenen Erkenntnisse auf die Säugetierzelle übertragen (GOULD u.
VALLE 2000). Dabei zeigte sich, dass die Regulation und Transkription bestimmter Gene, sogenannter PEX-Gene, und die daraus hervorgehenden Proteine, die sogenannten Peroxine, maßgeblich an der Entstehung von Peroxisomen beteiligt sind.
Bis heute sind 32 PEX Gene bekannt, die an drei verschiedenen Schlüsselpositionen der Peroxisomentwicklung involviert sind (VAN DER ZAND et al. 2006): an der Bildung der peroxisomalen Membran, der Peroxisomenproliferation und der Bereitstellung und Positionierung von peroxisomalen Matrixproteinen (PLATTA u.
ERDMANN 2007).
Peroxisomenteilung
Hierbei können zwei grundlegende Teilungsvorgänge unterschieden werden. Zum einen findet während der Zellteilung eine Teilung der vorhandenen Peroxisomen
statt, um eine gleichbleibende Anzahl an Peroxisomen in den Tochterzellen zu gewährleisten. Es handelt sich dann um eine konstitutive Teilung.
Zum anderen kann durch extrazelluläre Stimuli eine intrazelluläre Teilung der Peroxisomen provoziert werden, die eine starke Vermehrung (Proliferation) zur Folge hat. Diese Peroxisomenproliferation ist charakterisiert durch eine numerische Zunahme, erhöhte Volumendichte, zunehmende Größe und gegebenenfalls eine vermehrte Bereitstellung von peroxisomalen Enzymen. Dadurch wird erhöhten metabolischen Anforderungen Rechnung getragen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).
Peroxisomen enthalten keine DNA. Die Informationen zur Herstellung von peroxisomalen Proteinen ist in nukleären Genen verschlüsselt (LAZAROW u. FUJIKI 1985). Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Proteine der Membran und der Peroxisomenmatrix an freien, im Zytosol befindlichen Polyribosomen produziert und posttranslational in bereits bestehende Peroxisomen transportiert werden. Hierauf begründet sich die Theorie, dass die Peroxisomen Organellen sind, die sich wie Mitochondrien und Chloroplasten über Wachstum und Teilung vermehren (LAZAROW u. FUJIKI 1985). Das Wachstum von Peroxisomen wird dabei durch den Import von Membran- und Matrixproteinen gewährleistet. Bei entsprechender Größe kommt es zur Aufteilung der Matrix und der peroxisomalen Membran in mindestens zwei neue Peroxisomen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).
Neuere Untersuchungen am Beispiel von Saccharomyces cerevisiae zeigen, dass peroxisomale Bausteine aus dem Endoplasmatischen Retikulum hervorgehen, insbesondere die peroxisomalen Membranteile, die bei der de-novo Synthese von Peroxisomen benötigt werden (HOEPFNER et al. 2005; VAN DER ZAND et al.
2006).
Ausgehend vom Stadium des reifen Peroxisoms werden für eine Verdopplung folgende Stadien durchlaufen (Abbildung 2-4):
1) Verlängerung und Abschnürung 2) Teilung und Gruppenbildung 3) Trennung der Peroxisomen
4) Wachstum der neu entstandenen Peroxisomen, Wachstum und Reifung durch Matrixproteinimport
Verlängerung/
Abschnürung Teilung/
Gruppenbildung
Trennung
Wachstum/Reifung durch
Matrixproteinimport Reifes Peroxisom
1
2
3
4
Abbildung 2-4 Modell für die Teilung und Proliferation von Peroxisomen (modifiziert nach PLATTA u.
ERDMANN 2007)
Wachstum und Reifung der Peroxisomen
Das Verfahren zur Proteinherstellung gilt sowohl für Matrixproteine als auch für peroxisomale Membranproteine. Die im Endoplasmatischen Retikulum produzierten peroxisomalen Membranproteine werden in das neu entstehende Peroxisom eingebaut. Dadurch findet ein Wachstums- und Reifungsprozess statt, bis es aufgrund der maximalen Größe erneut zu einer Teilung kommt. Damit die neu synthetisierten Proteine die Peroxisomen erreichen, verfügen diese über
„peroxisomale targeting Signale“ (PTS). Zwei dieser Zielsignale sind bekannt unter den Abkürzungen PTS1 und PTS2 (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u. ERDMANN 2007).
Zum besseren Verständnis des peroxisomalen Wachstums kann der gesamte Prozess in wenige wichtige Schritte unterteilt werden (Abbildung 2-5).
Der erste Schritt umfasst die Bindung eines neu synthetisierten, gefalteten Proteins an den PTS1/Pex5-Rezeptor oder den löslichen Pex7-Rezeptor (1). Der überwiegende Anteil der gefalteten Proteine wird über PTS1/Pex5-Rezeptor in das peroxisomale Lumen transportiert, indem der Rezeptor zunächst das Protein zur peroxisomalen Membran leitet (2). Anschließend erfolgt der Übertritt des Rezeptor- Proteinkomplexes auf die luminale Seite der Peroxisomenmembran (3). Daraufhin trennen sich Rezeptor und Protein (4). Das Protein verbleibt im Peroxisom, während der Rezeptor in das Zytosol zurückkehrt, um für weitere peroxisomale Matrixproteinimporte zur Verfügung zu stehen (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u.
ERDMANN 2007). Der Export des Rezeptors aus dem peroxisomalen Lumen zurück ins Zytosol ist ein energieverbrauchender Prozess (OLIVEIRA et al. 2003) und auch das Einschleusen der Proteine ist ATP abhängig. Zuerst werden die Membranproteine synthetisiert, anschließend erfolgt die Synthese der Matrixproteine (MASTERS u. CRANE 1995).
Neues Protein
Neues Protein Neues
Protein Neues
Protein
PTS1/Pex5 Rezeptor
1 2
PTS1/Pex5 Rezeptor
PTS1/Pex5 oder Lösl. Pex7
Rezeptor 3
Neues Protein 4
oder Zytosol
peroxisomale Matrix
Löslicher Pex7 Rezeptor
PTS1/Pex5 Rezeptor
peroxisomale Membran
Abbildung 2-5 Translokation von Proteinen zum Wachstum der Peroxisomen (modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007)
Auslösende Faktoren der Peroxisomenproliferation
Es gibt extrinsische und intrinsische Faktoren, die eine Peroxisomenproliferation induzieren können (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Eine Regeneration der Leber nach einer partiellen Hepatektomie führt zu einer Peroxisomenproliferation in den Hepatozyten (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Auch zahlreiche Chemikalien, Medikamente und Weichmacher, allgemein als Peroxisomenproliferatoren (PPO) bezeichnet, können eine Vermehrung der Zellorganelle bewirken (LAZAROW u. DE DUVE 1976; FAHIMI et al. 1982). Weichmacher, die sich z.B. in Plastikverpackungen von Lebensmitteln befinden, haben in tierexperimentellen Studien gezeigt, dass sie eine Peroxisomenproliferation auslösen können (MASTERS u. CRANE 1995).
Langzeitfütterungsversuche mit Ratten führten darüberhinaus zu der Entwicklung von hepatozellulären Karzinomen (MASTERS u. CRANE 1995). Auch Medikamente, wie Azetylsalizylsäure, anabole Steroide, Clofibrate, Trimethoprim Sulfonamide, Spironolacton und orale Kontrazeptiva führen zu einer Erhöhung der
Peroxisomenzahl (DE CRAEMER 1995). Die Verabreichung von Schilddrüsenhormonen geht beispielsweise mit einer verminderten Katalaseaktivität bei gleichzeitiger Erhöhung der Peroxisomenzahl von verminderter Größe einher (JUST u. HARTL 1983; KERCKAERT et al. 1989). Die Stimulation von kultivierten humanen Hepatozyten mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren oder Sauerstoffradikalen kann ebenfalls eine Peroxisomenproliferation auslösen (SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999). Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass es etwa 60 Xenobiotika gibt, die zu einer Peroxisomenproliferation führen (MOODY et al. 1991). Darüber hinaus können fettreiche Diäten, Hungerperioden, Vitamin E Mangel, Hyperthyreoidismus und Anpassung an Kälte zu einer Proliferation der Peroxisomen führen (MASTERS u.
CRANE 1995). Die Peroxisomenproliferation, herbeigeführt durch PPO, fällt je nach Lokalisation im Leberläppchen sehr variabel aus. In periportalen Hepatozyten finden sich sehr viele elongierte Peroxisomen, während im perizentralen Bereich eher rundliche Peroxisomen vorkommen (FAHIMI et al. 1996). Elongierte Peroxisomen sind ein Zeichen für eine peroxisomale Proliferation und geben somit einen wichtigen Hinweis auf eine stattgefundene Teilungsaktivität der Peroxisomen (SCHRADER et al. 1996; SCHRADER et al. 1998b; KOCH et al. 2004). Vergleicht man diese Beobachtung mit der Proliferation von hepatischen Stammzellen von periportal nach perizentral (ARBER et al. 1988), kann daraus gefolgert werden, dass die Peroxisomen dieser Proliferationsrichtung folgen (SCHRADER u. FAHIMI 2006). Bei Proliferationsvorgängen wird auch eine perinukleäre Verteilung der Peroxisomen beobachtet (ROELS et al. 1983; DE CRAEMER et al. 1993).
Regulation der Peroxisomenproliferation
Die Regulation der Peroxisomenproliferation im Säugetierorganismus erfolgt über nukleäre Transkriptionsfaktoren. Diese Transkriptionsfaktoren gehören zur großen Familie der Steroid-, Thyroid- und Retinoidrezeptoren und werden als „Peroxisome proliferator activated receptors“ (PPARs) bezeichnet (ISSEMANN u. GREEN 1990).
Es werden drei Typen unterschieden: PPAR α, PPAR β und PPAR γ (SCHOONJANS et al. 1996).
PPAR α ist in den Lipidstoffwechsel, die Lipoproteinsynthese und den Ablauf von Entzündungsreaktionen involviert (FEIGE et al. 2006). PPAR α wird stark in der Leber exprimiert (KLAUNIG et al. 2003) und wird besonders bei Nagern durch Lipidsenker sowie mehrfach ungesättigte Fettsäuren aktiviert (BEIER et al. 1992, 1997). PPAR α fungiert als Sensor für den Lipidgehalt der Hepatozyten und reguliert die Genexpression für die mitochondriale und peroxisomale ß-Oxidation (HASHIMOTO et al. 2000). Ein entscheidender Punkt in der Karzinogenese ist die Aktivierung von PPAR α (GONZALEZ et al. 1998). PPAR β bestimmt das Maß des Fettmetabolismus in Skelettmuskeln und Fettgewebe (LUQUET et al. 2005). Die Bedeutung von PPAR γ liegt in der Regulation der Proliferation und Ausdifferenzierung von Fettzellen (LUQUET et al. 2005).
2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie
Im Folgenden wird auf die Abnahme der Peroxisomenzahl in der Zelle eingegangen, was insbesondere über Autophagie reguliert wird.
Autophagische Prozesse sind katabole intrazelluläre Abläufe, die letztendlich in einen lysosomalen Abbau von Zellorganellen münden. Die Autophagie nimmt eine wichtige Stellung ein, zum Beispiel in Hepatozyten, indem die nicht mehr benötigten Zellorganellen abgebaut werden und die Abbauprodukte der Zelle als Nährstoffe wieder zur Verfügung stehen (CUERVO 2004a; MIZUSHIMA 2005).
Es gibt drei verschiedene Formen der Autophagie, die alle ähnliche Funktionen erfüllen: die Makroautophagie, die Mikroautophagie und die „Chaperon-mediierte Autophagie“ (CUERVO 2004a). Diese drei Mechanismen kommen alle in Säugetierzellen vor (CUERVO 2004a).
Bei der Makroautophagie werden die zu entsorgenden Komponenten in eine Doppellamelle, dem Autophagosom, verpackt, welches dann mit dem Lysosom verschmilzt und durch Hydrolasen abgebaut wird (SAKAI et al. 2006). Die Membranen des lysosomalen Systems sowie die lysosomalen Proteine werden im glatten Endoplasmatischen Retikulum (sER) synthetisiert (LÖFFLER et al. 2007).
Im Rahmen der Mikroautophagie wird das zu entsorgende Material von der lysosomalen Membran direkt umschlossen, als sogenanntes „Microautophagic body“, und mittels Hydrolasen abgebaut (SAKAI et al. 1998; LÖFFLER et al. 2007).
Der Prozess der „Chaperon mediierten Autophagie“ beinhaltet die Bindung eines Rezeptors an das zu eliminierende Substrat im Zytosol. Dieser Komplex bindet nun an einen an der lysosomalen Membran befindlichen Rezeptor. Daraufhin erfolgt der Übertritt des Substrates in das lysosomale Lumen, in dem die Degradierung durch Hydrolasen stattfindet (CUERVO 2004b).
Funktion
Der Vorgang der Makroautophagie ist sowohl bei pathologischen, als auch physiologischen Abläufen, wie der Beseitigung von apoptotischen Zellen, während der Embryogenese, der Wiederverwertung von Nährstoffen und der Beseitigung von fehlgefalteten Proteinen, intrazellulären Bakterien und geschädigten Zellorganellen beteiligt (CUERVO 2004a; LEVINE u. KLIONSKY 2004). Es wird angenommen, dass es sich in erster Linie um einen protektiven Mechanismus handelt (LEMASTERS et al. 2002; CUERVO 2004a).
Auch zur Vermeidung von Neoplasien besitzt die Autophagie eine wichtige Schutzfunktion. Durch die Beseitigung von geschädigten Mitochondrien und der Reduktion des oxidativen und metabolischen Stresses wird auch die DNA vor Angriffen durch Radikale geschützt, was Mutationen verhindert und die Stabilität des Genoms wahrt (NELSON et al. 2004; KARANTZA-WADSWORTH et al. 2007;
MATHEW et al. 2007). Eine gestört ablaufende Autophagie führt jedoch zu einer Genamplifikation, die letztlich ein Hauptmechanismus in der Onkogenaktivierung darstellt (LITTLE u. CHARTRAND 2004).
Regulation
Der bedeutendste Faktor, der den Prozess der Autophagie in der Leber einleitet ist Hungern. Hierbei wird in den ersten 48h bei Ratten und Mäusen 25-45 % des zelleigenen Proteins abgebaut (ADDIS et al. 1936). Autophagie scheint dabei einen wichtigen Mechanismus zur alternativen Energieversorgung darzustellen, um
während Hungerperioden durch Recyling von Zellbestandteilen einen normalen Metabolismus zu gewährleisten (JIN u. WHITE 2007). Autophagie trägt dadurch zur Energieversorgung von Zellen in Hungerperioden bei und ist somit an der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase beteiligt (NELSON et al. 2004).
Autophagie ist ein energieverbrauchender Prozess, der bei ATP Mangel zum Erliegen kommt (MEIJER u. CODOGNO 2004). Auch Insulin übt einen inhibitorischen Effekt aus (PFEIFER 1977), während Glukagon Autophagieprozesse fördert (DETER et al. 1967). Die alimentäre Aufnahme von langen und sehr langen Fettsäuren, die den Peroxisomen als Substrat dienen, führt ebenfalls zu einem Abbruch der Pexophagie (LUIKEN et al. 1992).
2.3 Hepatopathien des Hundes
In der Humanmedizin existieren 17 erblich bedingte peroxisomale Erkrankungen, die vor allem auf einer Biogenese- oder Funktionsstörung der Peroxisomen beruhen (WANDERS 2004a). Für den Hund sind weder angeborene noch erworbene peroxisomale Erkrankungen beschrieben. Um jedoch herauszufinden, ob Peroxisomen bei bestimmten degenerativen bzw. neoplastischen Lebererkrankungen eine Rolle spielen, wurden in der vorliegenden Arbeit Hunde mit Hepatopathien untersucht, die im Folgenden hinsichtlich ihres makroskopischen und mikroskopischen Erscheinungsbildes näher erläutert werden sollen.
Die Leber befindet sich zentral im kranialen Abdomen, dem Zwerchfell direkt anliegend. Die Oberfläche ist glatt, da sie von einer serösen Kapsel überzogen ist.
Das Leberparenchym erscheint rotbraun, ist von fragiler Konsistenz und beim Hund in zahlreiche Leberlappen unterteilt, deren Enden im gesunden Zustand scharf konturiert sind (CULLEN 2007a).
Es können zwei Einteilungen hinsichtlich der architektonischen Bauweise der Leber unterschieden werden: Die klassische Einteilung der Leber mit dem Leberläppchen als kleinste anatomische Einheit. Das Leberläppchen bildet eine mehr oder weniger sechseckige Struktur mit der in der Mitte befindlichen Zentralvene, die das Blut der
Lebervene zuführt. An den Ecken des Sechseckes befinden sich die Portalfelder , die auch als Glisson Trias bezeichnet bezeichnet werden. Sie schließen Gallengänge, Zweige der Portalvene, der Leberarterie, Nervenfasern und Lymphgefäße ein, gestützt von einem feinen retikulären Bindegewebe (Abbildung 2-6 A). Das Blut wird aus der Leberarterie und Portalvene in die Sinusoide geleitet, wo es sich vermischt und eng an den Hepatozyten vorbeifließt, bevor es über die Zentralvene in die V.
hepatica abgeführt wird (CULLEN 2007a).
Bei der funktionalen Einteilung der Leber nach RAPPAPORT (1980) stellt das Portalgebiet den zentralen Punkt des sogenannten Leberazinus dar, da dort das sauerstoffreiche Blut über die Arterie ankommt und zu den in der Peripherie gelegenen Lebervenen abgeführt wird. Dabei nimmt der Sauerstoffgehalt von Zone 1 (periportal oder zentroazinär) über Zone 2 (mittzonal) nach Zone 3 (periazinär) kontinuierlich ab (Abbildung 2-6 B) (CULLEN 2007a).
Abbildung 2-6 Schematische Darstellung der funktionellen Organisation der Leber (CULLEN 2007a)
Die Hepatozyten sind in einschichtigen Zellreihen angeordnet und radiär zur Zentralvene ausgerichtet. Die Zellreihen werden durch besondere Kapillaren, die sogenannten Sinusoide, getrennt. Sie besitzen keine typische Basalmembran und sind durch ein diskontinuierliches Endothel ausgekleidet. Hier befinden sich auch die Lebermakrophagen (Kupffer-Sternzellen), die der Kontrolle des sinusoidalen Blutes dienen (CULLEN 2007a).
Die Hepatozyten besitzen zu der das Lumen der Sinusoide begrenzenden Seite zahlreiche Mikrovilli, die der Oberflächenvergrößerung, der Aufnahme von Substanzen aus dem Plasma und der Sekretion von Produkten dienen. An den basolateralen Seiten der Hepatozyten befinden sich Gallekanälchen, die sich aus den modifizierten Zellmembranen zweier benachbarter Hepatozyten ergeben. Der Disse´ Raum ist eine besondere anatomische Struktur zwischen den Hepatozyten und den Endothelzellen der Lebersinusoide. Hier findet ein Austausch von Stoffen zwischen Plasma und den mit Mikrovilli besetzten Hepatozyten statt. Eine Schädigung dieser Zone beeinträchtigt die Leberfunktion erheblich. In diesem Raum befinden sich auch fettspeichernde Zellen, sogenannte Ito-Zellen, die unter anderem der Vitamin A-Speicherung dienen. Bei Leberschädigungen sinkt ihr Vitamin A- Gehalt und sie bilden Kollagen, das die Entstehung einer Leberfibrose fördert (CULLEN 2007a).
2.3.1 Hepatozelluläre Degeneration
Die hepatozelluläre Degeneration, früher als Hepatose bezeichnet, umfasst nicht primär entzündlich bedingte Veränderungen der Hepatozyten, beispielsweise durch Sauerstoffmangel oder Stoffwechselstörungen. Die Veränderungen können folgenlos bleiben, in ein von Entzündungsprozessen begleitetes chronisches Stadium übergehen oder in einer chronischen Zerstörung von Lebergewebe mit vergeblichen bindegewebigen Umbau- und Regenerationsprozessen (Zirrhose) enden (KÄUFER- WEISS 2007).
Das Verteilungsmuster der auftretenden degenerativen Veränderungen gibt Aufschluss über die möglichen Ursachen. So wird unterschieden, ob Leberzellen im gesamten Parenchym (diffus), zufällig verteilt (multifokal) oder in bestimmten Zonen (1-3) des Leberazinus geschädigt sind (ROTH u. MEYER 1995).
Hydropische Degeneration
Hepatozyten reagieren bei Störung ihrer Homöostase immer in ähnlicher Weise.
Dabei werden im allgemeinen die Elektrolytkonzentration und der Flüssigkeits- haushalt derart gestört, dass es zu einem Wassereinstrom kommt und die Zelle
anschwillt (CULLEN et al. 2006). Diesen Vorgang nennt man daher auch hydropische Degeneration (CULLEN 2007b).
Mikroskopisch kann sich das zunächst in Form einer trüben Schwellung des Hepatozyten darstellen. Dabei kommt es zu einer Schädigung der Mitochondrien z. B. durch exogene Gifte, Hypoxie und/oder Stoffwechselentgleisungen, was zu einer unspezifischen Leistungsschwäche der Hepatozyten führt (KÄUFER-WEISS 2007). Die ebenfalls durch Wassereinstrom vergrößerten Mitochondrien können lichtmikroskopisch als gleichmäßig in der Leberzelle verteilte Körnchen wahrgenommen werden (KÄUFER-WEISS 2007).
Abbildung 2-7 Hydropische Degeneration von Hepatozyten im Bereich der Zentralvene (Z=Zentralvene;
Rind, Paraffinschnitt, H.E.) (CULLEN 2007a)
Bei fortschreitender hydropischer Schwellung zeigen die Zellen eine sogenannte ballonierende Degeneration. Dabei nimmt der Einstrom von Wasser und Natrium stetig zu. Die Konsequenz ist eine massive Schwellung der gesamten Zelle und deren Organellen, insbesondere der Mitochondrien, der Lysosomen und des Endoplasmatischen Retikulums (KÄUFER-WEISS 2007; STALKER u. HAYES 2007).
Eine Zellschwellung kann reversibel sein, wenn das Ausmaß und die Dauer der schädigenden Noxe begrenzt sind (Abbildung 2-8). Wird dabei jedoch ein kritischer Punkt überschritten, so kommt es in der Folge zum irreversiblen Zelluntergang (CULLEN 2007b)
Abbildung 2-8 Physiologische Zelle und Veränderungen bei reversibler und irreversibler Zellschädigung (CULLEN 2007b)
Auslöser einer hydropischen Degeneration ist im Prinzip immer eine gestörte Zellatmung aufgrund hypoxischer Zustände, die entweder den gesamten Organismus betreffen können oder nur lokal wirken. Eine Vergiftung oder Blockierung mitochondrialer Enzyme führt ebenfalls zu einer gestörten Zellatmung (KÄUFER-WEISS 2007). Daher ist die hydropische Degeneration eine relativ unspezifische Zellveränderung, der viele Ursachen zugrunde liegen können (CULLEN 2009). So können bei Jungtieren, die vom Wachstumsverhalten der Wurfgeschwister abweichen, angeborene Erkrankungen, wie z. B. primäre
Speicherkrankheiten der Leber eine ätiologische Rolle spielen (CULLEN 2009), während bei älteren Tieren zahlreiche erworbene Erkrankungen (z. B. chronische Vergiftungen, hohe Blutkortisolspiegel, Herzinsuffizienz, Adipositas) eine hepatozelluläre Degeneration auslösen können. Im Rahmen einer hepatozellulären Degeneration kommt es häufig zu Einlagerungen bestimmter Substanzen, da der Hepatozyt nicht mehr in der Lage ist, diese angemessen zu verstoffwechseln. Dabei handelt es sich am häufigsten um Fett oder Glykogen (STALKER u. HAYES 2007;
CULLEN 2009).
Glykogenose
Eine übermäßige hepatozelluläre Glykogeneinlagerung (Glykogenose) tritt im Rahmen einer steroidinduzierten Hepatopathie auf und ist induziert durch endogene oder exogene Glukokortikoide bzw. in seltenen Fällen durch Steroidhormone (Progesteron, Aldosteron) (CULLEN et al. 2006; SEPESY et al. 2006). SEPESY et al. (2006) gehen davon aus, dass auch eine stressinduzierte Hyperkortisolämie bei akuten oder chronischen Erkrankungen an der Entstehung einer Glykogenose beteiligt ist. Weiterhin beobachten sie außerdem Glykogeneinlagerungen im Zusammenhang mit hepatischen und nicht hepatischen Neoplasien, auch wenn die Hunde keine exogen zugeführten Glukokortikoide erhielten. Glukokortikoide führen zu einer Anordnung der Peroxisomen um Glykogentropfen, wobei insgesamt die Anzahl der Peroxisomen vermindert ist (PHILLIPS et al. 1987).
Im Falle einer steroidinduzierten Hepatopathie ist die Leber vergrößert und weist eine blassbraune Farbe auf (CULLEN 2007a). Das Bild einer hepatozellulären Glykogeneinlagerung zeigt sich als intrazytoplasmatische Vakuolisierung von Hepatozyten mit überwiegend kleinen verwaschenen Vakuolen. Der Nukleus befindet sich dabei zunächst noch in zentraler Position (CULLEN et al. 2006). Bei zunehmender Glykogeneinlagerung kann es zu einer zwei bis zehnfachen Vergrößerung der Hepatozyten mit Verdrängung des Kernes in die Peripherie kommen. Die Veränderungen beginnen am häufigsten in der Zone 2 (intermediäre Zone) des Azinus, können sich jedoch im weiteren Krankheitsverlauf zunehmend ausbreiten. Im fortgeschrittenen Stadium gehören Zelluntergänge (Nekrosen), sowie
