Morphologische Untersuchungen

Bei der morphologischen Untersuchung wurden die Peroxisomen anhand ihrer Größe (klein/groß), ihres Verteilungsmusters innerhalb der Zelle sowie ihrer morphologischen Veränderungen (Protrusion, Marginalplatte, Nukleoid) beurteilt.

Peroxisomengröße

In Gruppe 1 und 2 konnte aufgrund der vorhandenen degenerativen sowie der Lokalisation der Hepatozyten in unmittelbarer Nachbarschaft zu neoplastischen Prozessen, dem teilweise Vorhandensein von Fetttropfen und dem aus den degenerativen Veränderungen für die Zelle resultierenden oxidativen Stress, erwartet werden, dass dies eine Proliferation von Peroxisomen bei gleichzeitiger Verkleinerung der Peroxisomengröße zur Folge hatte.

Im Rahmen von Proliferationsvorgängen verringern Peroxisomen ihre Größe, während ihre Gesamtzahl zunimmt (DE CRAEMER 1995).

In der vorliegenden Untersuchung konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in den einzelnen Gruppen 1-3 im Hinblick auf das Vorkommen kleiner Peroxisomen festgestellt werden. Da es sich hierbei um eine semiquantitative Auswertung handelte, konnte im vorliegenden Fall keine Aussage über absolute Zahlen getroffen werden, aber es liegt die Vermutung nahe, dass in den untersuchten Zellen keine Proliferation stattgefunden hatte. Diese Feststellung wurde unterstützt durch die Tatsache, dass bei Betrachtung der Gruppen 1-3 ein signifikanter Unterschied

bestand, was das Auftreten von großen Peroxisomen betraf. Große Peroxisomen fanden sich in Zellen, in denen keine Peroxisomenproliferation stattgefunden hatte.

Verteilungsmuster in der Zelle

Hinsichtlich der statistischen Auswertung der Verteilung der Peroxisomen in vier Merkmalen (Nähe Fettropfen, Cluster, panzytär, perinukleär) ergab sich lediglich in einem Merkmal (Cluster) ein signifikantes Ergebnis. Gruppe 1 zeigte das Auftreten der Peroxisomen in Form eines Clusters zu 36,4 %, während Gruppe 2 das Merkmal zu 25 % aufwies und Gruppe 3 zu 100 %. Der Unterschied erwies sich zwischen allen drei Gruppen als signifikant p 0,01233 (p-Wert signifikant ab p <0,05).

Keine der Gruppen 1-3 zeigte ein perinukleäres Auftreten von Peroxisomen, sodass auch diese Untersuchung die Annahme unterstützt, dass keine Proliferationsvorgänge in den untersuchten Hepatozyten stattgefunden hatten.

Unsere Untersuchungen werden von ROELS et al. (1983) und DE CRAEMER et al.

(1991) bestätigt, die ebenfalls bei Proliferationsvorgängen und in pathologisch veränderten Lebern eine perinukeäre Verteilung der Peroxisomen fanden. In der Kontrollgruppe der vorliegenden Studie lagen die Peroxisomen zu 100 % als Cluster vor, was durch die Untersuchung von ROELS et al. (1983) bestätigt wird, der ebenfalls bei gesunden Lebern eine homogene Verteilung der Peroxisomen beobachtet oder die Ansammlung in Form von Gruppen (Cluster). Die degenerativ veränderten Hepatozyten (Untersuchungsgruppe 1 und 2) zeigten deutlich weniger Peroxisomen in Form von Clustern. Die Beobachtung, dass Peroxisomen sich insbesondere in der Nähe von Fetttropfen positionierten (SCHRADER 2001) ließ sich in der vorliegenden Studie nicht bestätigen, was sicherlich daran lag, das nur zwei Patienten K1972/P513/06 (ggr. Leberzelldegeneration) und K1974/P539/07 (hgr.

Leberzelldegeneration) hepatozelluläre Verfettungen im Untersuchungsgut aufwiesen.

Morphologische Veränderungen (Protrusion, Marginalplatte, Nukleoid)

Bei der statistischen Auswertung mit Hilfe des Pearson Chi-Quadrat Testes konnten in keinem Fall signifikante Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen

ermittelt werden (Protrusion p-Wert 0,40036; Marginalplatte p-Wert 0,16792;

Nukleoid p-Wert 0,68960 signifikant ab p<0,05000).

Protrusion:

Das Auftreten von Protrusionen findet man insbesondere bei degenerativen Veränderungen der Hepatozyten in Zusammenhang mit Steatose, Hepatitiden und auch Tumorerkrankungen (DE CRAEMER 1995). Die Formveränderungen findet man ebenfalls bei Proliferationsvorgängen der Peroxisomen. Sie führen zusätzlich zu einer Oberflächenvergrößerung, die einen erhöhten peroxisomalen Metabolismus ermöglichen (ROELS et al. 1991). Auffallend ist, dass die Kontrolltiere annähernd so viele Peroxisomen aufweisen wie die Gruppen 1-2. Eine mögliche Erklärung stellt neben der Lokalisation der Entnahme der Leberprobe auch der Zeitpunkt im Krankheitsverlauf dar, sodass zu Beginn einer degenerativen Veränderung der Impuls zur Peroxisomenproliferation und damit einhergehender Formveränderung stärker ausfällt als im späteren Verlauf und mit zunehmender Dauer der Erkrankung abnimmt, gänzlich schwindet oder auf einem Niveau bleibt. Leider liegen über die Dauer der einzelnen Erkrankungen der Patienten keine Daten vor.

Marginalplatte und Nukleoid:

Die Marginalplatte als elektronendichte Verdickung unter der Peroxisomenmembran und das Nukleoid als elektronendichter Kern zentral im Peroxisom zeigten sich bei allen drei Untersuchungsgruppen in nahezu ähnlichem Umfang. Eine Untersuchung an Katzen, die entweder an einer Lipidose erkrankt waren oder an einer Gallengangsobstruktion, zeigte, dass bei der erstgenannten Gruppe weder Marginalplatten noch Nukleoide und bei den Patienten, die an einer Gallengangsobstruktion litten, beide morphologischen Merkmale vorhanden waren (CENTER et al. 1993). Die Arbeitsgruppe vermutete, dass das komplette Verschwinden der morphologischen Merkmale direkt mit dem Krankheitsbild der Lipidose verbunden ist (CENTER et al. 1993). Bei der quantitativen Erfassung sollte ebenso berücksichtigt werden, dass das Vorhandensein des Nukleoids abhängig von der Schnittebene des Präparates ist (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966).

Degenerative Veränderungen, wie sie bei Gruppe 1 und 2 in unterschiedlichem Schweregrad auftraten, scheinen demnach nicht mit Veränderungen der Marginalplatte oder dem Nukleoid einherzugehen.

Mitochondriale Eigenschaften

Die Mitochondrien wurden hinsichtlich des Auftretens von Schwellungen, lytischen Erscheinungen, parakristallinen Einschlüssen und dem Auftreten von Riesenmitochondrien untersucht. Es bestand kein signifikanter Unterschied in den vier untersuchten Merkmalen zwischen den Gruppen 1-3. Eine Schwellung zeigten nahezu 100 % der Gruppe 3 und in etwa gleichen Anteilen Gruppe 1 und 2 (60-70

%). Hinsichtlich der lytischen Veränderungen zeigten beinahe 80 % der Gruppe 2 dieses Merkmal, während dies bei ungefähr 50 % der Gruppe 1 und 3 zutraf.

Parakristalline Einschlüsse fanden sich bei knapp 40 % der Gruppe 1 und 2 sowie bei knapp 20 % der Gruppe 3. Die Riesenmitochondrien traten zu 80-90 % in Gruppe 1 und 3 auf, während Gruppe 2 zu etwa 50 % das Merkmal aufwies.

Zu den mitochondrialen Veränderungen bei beeinträchtigter Zellhomöostase gehören Schwellung und Lyse der Mitochondrien, parakristalline Einschlüsse und die Bildung von Riesenmitochondrien (CHEVILLE 1994c). Mitochondriale Veränderungen werden dann als bedeutsam betrachtet, wenn sie weitläufig, diffus und immer wiederkehrend auftreten (CENTER et al. 1993). Allerdings muss einschränkend gesagt werden, dass mitochondriale Veränderungen in einer Vielzahl von humanmedizinischen Lebererkrankungen auftreten und diese als unspezifisch betrachtet werden (PHILLIPS et al. 1987). Veränderungen in Form von Schwellungen der Mitochondrien fanden sich ebenfalls in tumorös als auch an den Tumor angrenzenden Lebergeweben (GHADIALLY u. PARRY 1966). Insbesondere die Gruppen 1 und 2 zeigten überwiegend histologisch geringgradige und mittelgradige sowie wenige hochgradige Degenerationen der Hepatozyten.

Die Interpretation der elektronenmikroskopischen Bilder muss immer unter dem Gesichtspunkt der Fixationsmethode betrachtet werden, denn Glutaraldehyd hat einen negativen Einfluss auf Membranen, insbesondere auf die sehr empfindlichen

mitochondrialen Membranen, sodass es leicht zu Artefakten kommen kann (CHEVILLE 1994c).

Die mitochondrialen Größenveränderungen lassen sich nicht in den Hämalaun-Eosin gefärbten Paraffinschnitten erkennen. Dagegen werden sie in den Semidünnschnitten, in Form von intrahepatozellulären kleinen weißen Punkten auf

„blauem Hintergrund“ deutlich. CENTER et al. (1993) beobachteten in ihrer Untersuchung bei den an Lipidose erkrankten Katzen ebenfalls eine starke Größenzunahme der Mitochondrien, die sie als Kompensationsmechanismus für eine verminderte Anzahl an Mitochondrien betrachten.

Lipidtropfen, Glykogengehalt und Myelinfiguren in den Hepatozyten

In Gruppe 1 konnten tendenziell die meisten Lipidtropfen nachgewiesen werden. 30

% der untersuchten Hepatozyten zeigten entsprechende Lipidgehalte. In Gruppe 2 zeigte die Mehrheit der Patienten überhaupt keine Lipidtropfen (62,5 %). Die Kontrollgruppe zeigte minimale Anzeichen einzelner kleiner Lipidtropfen.

Hepatozelluläre Degenerationen sind nicht entzündliche Veränderungen der Hepatozyten, bedingt durch eine Hypoxie oder allgemeine Stoffwechselstörungen (KÄUFER-WEISS 2007). Neben der Einlagerung von Wasser (KÄUFER-WEISS 2007) kann es auch zur Anreicherung von Lipiden oder Glykogen kommen (STALKER u. HAYES 2007; CULLEN 2009). Die Kontrollgruppe zeigte deutlich mehr Lipidtropfen als die Gruppe 2. Ein mögliche Erklärung liegt in einer prähepatischen Ursache wie z.B. Hungern (STALKER u. HAYES 2007). Die Tiere insbesondere der Gruppe 3 wurden vor der Narkose 24h nüchtern belassen. Bei Gruppe 2 konnten die Tiere nicht in allen Fällen nüchtern gelassen werden, da es sich um Notfälle handelte, die der direkten Behandlung (Operation) bedurften. Eine weitere mögliche Erklärung wäre eine Reduktion von Enzymen zur ß-Oxidation in den Peroxisomen der Kontrollgruppe. Um dies beweisen zu können, müsste man in einer Folgeuntersuchung die peroxisomalen Enzyme quantitativ bestimmen.

Die Gruppen 1 und 3 zeigten die größten Mengen an Glykogeneinlagerungen in den untersuchten Hepatozyten. Mögliche Erklärungen finden sich in Gruppe 1 im Hinblick

auf Grunderkrankungen der untersuchten Patienten. So litt Patient K1972 an einer Futtermittelunverträglichkeit/Allergie und bekam regelmäßig Glukokortikoide iatrogen verabreicht. Der Patient mit K1979 war an einem Morbus Cushing erkrankt, sodass er unter endogenem Glukokortikoideinfluss stand. Beide Patienten zeigten bei der Bestimmung der klinisch-chemischen Blutparameter hochgradige ALT und ALKP Erhöhungen (Anhangstabelle 10-1). Die Ursache der starken Glykogeneinlagerung bei den Kontrolltieren könnte darin begründet liegen, dass es sich um gesunde Tiere handelte, die keine Anorexie im Vorfeld aufwiesen, während die anderen Patienten teilweise Anzeichen einer Anorexie als klinisches Begleitsymptom ihrer Erkrankung zeigten. Die Hepatozyten der Gruppe 2, die an den Tumor angrenzend lagen, zeigten überwiegend eine gering- bis mittelgradige Einlagerung von Glykogen.

Myelinfiguren als Einschlüsse in Mitochondrien oder Autophagosomen repräsentieren möglicherweise pathologische Konformationen von Membran-proteinen und Lipoproteinschichten (CASTEJON u. CASTEJON 2008). Die statistische Auswertung aller drei Untersuchungsgruppen ergab kein signifikantes Ergebnis. Die Gruppe 2 zeigte in der elektronenmikroskopischen Untersuchung zu 37,5 % in mittelgradiger und zu 25 % Myelinfiguren in hochgradiger Ausprägung.

Myelinfiguren entstehen durch die Degeneration des Endoplasmatischen Retikulums, aber auch durch andere Organellen. Die Membranen kollabieren, aggregieren und formieren sich neu zu „Myelinfiguren“. Diese finden sich frei im Zytosol (CHEVILLE 1994c, b). Die untersuchten Hepatozyten der Gruppe 2 zeigten besonders auffällig degenerative Veränderungen der Mitochondrien. Damit geht das starke Auftreten der Myelinfiguren einher, so dass davon auszugehen ist, dass die Hepatozyten der Gruppe 2 in dem Tumor angrenzenden Gebiet deutlich stärker degeneriert und in ihrer Funktion beeinträchtigt sind als die Hepatozyten der Gruppe 1 und 3.

Insgesamt lässt sich festhalten, dass die ultrastrukturellen Veränderungen im Bereich der Peroxisomen und angrenzender Strukturen bei Tumorpatienten stärker zu Tage treten als bei den Tieren mit reiner Leberdegeneration und den Kontrolltieren.

4.3 Beeinflussung der Peroxisomenzahl durch