3.2 Ergebnisse
3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungsergebnisse
Neben der histologischen Untersuchung von Leberbiopsien wurden die hepatozellulären Veränderungen der Tiere aus den drei Untersuchungsgruppen ultrastrukturell analysiert und im Hinblick auf morphologische und quantitative Veränderungen der Peroxisomen miteinander verglichen. Für die ultrastrukturelle Untersuchung mittels Elektronenmikroskopie wurden zunächst Semidünnschnitte hergestellt und auf repräsentative Veränderungen der Leberzellen für die spätere Anfertigung von Ultradünnschnitten abgesucht. Dabei zeigte sich, dass im Semidünnschnitt die degenerativen Veränderungen teilweise deutlicher zum Vorschein kamen als in den zuvor untersuchten, mit H.E.-gefärbten histologischen Schnitten, so dass im Folgenden ergänzend einige repräsentative Semidünnschnitte mit charakteristischen hepatozellulären degenerativen Veränderungen dargestellt wurden.
3.2.4.1 Semidünnschnitte
Geringgradige Degeneration
Abbildung 3-19 zeigt, die schon im H.E. Schnitt deutlich erkennbare diffuse hydropische Schwellung der Hepatozyten. Sehr eindrücklich stellt sich im Semidünnschnitt die zusätzliche multifokale gemischttropfige Verfettung dar.
Während es sich bei den weißen Punkten in anderen Schnitten um geschwollene Mitochondrien handelt (Abbildung 3-22), sind es hier eindeutig Fetttropfen. Der Semidünnschnitt lässt deutlich die Zellgrenzen im Gegensatz zum H.E. Schnitt erkennen.
Abbildung 3-19 Gegenüberstellung von Semidünnschnitt und Paraffinschnitt bei einem Fall (K1972) mit geringgradiger hydropischer Leberzelldegeneration mit assoziierter gemischttropfiger Verfettung (Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E.).
Der Patient K1968/1 (Abbildung 3-20) erkrankte an einem hepatozellulären Karzinom mit adenomatöser Gallengangsproliferation. In Abbildung 3-20 ist eine geringgradige hydropische Degeneration im an den Tumor angrenzenden Gewebe dargestellt. Der Semidünnschnitt zeigt sehr deutlich die sich verändernde Anordnung der Leberzellen, die auch schon im H.E. Schnitt (Inset) nicht mehr gegeben ist. Die Hepatozyten weisen eine inhomogene Anfärbung des Zytoplasmas auf.
Abbildung 3-20 Geringgradige hepatozelluläre Degeneration (K1968/1). Der Semidünnschnitt zeigt inhomogene zytoplasmatische Färbungen mit eingelagerten grünlichen Fettvakuolen in den Hepatozyten. Daneben sieht man einen Fetttropfen (Pfeil), der im H.E. Schnitt (Inset) als leere Vakuole erkennbar ist. Im H.E. Schnitt sind zusätzlich Herde mit Hämosiderinablagerungen (Kreis). (Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E.
Färbung).
Mittelgradige hepatozelluläre Degeneration
Im Semidünnschnitt sind im Vergleich zum Paraffinschnitt verschiedene Einzelheiten der jeweiligen hepatozellulären Degeneration besonders sichtbar. Während der Paraffinschnitt eher nur diffuse Veränderungen einer Degeneration mit mittelgradiger Ausprägung aufweist, zeigen die Semidünnschnitte deutlich abgegrenzte Hepatozyten, bei denen die Zellkerne überwiegend noch gut erhalten sind. Im Zytoplasma sind eindeutige Charakteristika der Degeneration sichtbar, z. B.
ausgeprägte Glykogenfelder, die den Hepatozyten im Paraffinschnitt hydropisch geschwollen erscheinen lassen (Abbildung 3-21).
Abbildung 3-21 Mittelgradige hepatozelluläre Degeneration bei einem Hund mit Klarzellkarzinom (K2011/20). Die im Inset sichtbare mittelgradige hydropische Schwellung der Hepatozyten ist im Semidünnschnitt auf eine massive Glykogenablagerung mit einzelnen feinen Fettvakuolen zurückzuführen. (Semidünnschnitt, Methylenblau; Paraffinschnitt, H.E. Färbung).
Hochgradige hepatozelluläre Degeneration vom Pflanzenzelltyp
Auch bei den Fällen mit hochgradigen hepatozellulären Degenerationen lassen sich in Semidünnschnitten von Biopsien der Tiere mit und ohne tumoröse Veränderungen deutlich mehr Einzelheiten als im H.E. gefärbten Paraffinschnitt erkennen (Abbildung 3-22). Da sich die individuellen Zellen deutlich darstellen, ist die ausgeprägte Schwellung sichtbar. Die Zellkerne werden an die Peripherie des Zytoplasmas gedrängt, oft fehlen Anschnitte der Kerne in der Schnittebene oder es fallen Kernuntergangsformen auf. Durch die unterschiedliche Schwellung der Zellen wird die Balkenstruktur der Lobuli sehr unregelmäßig und teilweise aufgelöst. Bei Schwellung der Zellen mit Akzentuierung der Zellwände wird bei einigen Fällen die charakteristische pflanzenzellähnliche Erscheinung der Hepatozyten deutlich, die die Degeneration vom Pflanzenzelltyp lichtmikroskopisch charakterisiert.
Im Vergleich mit Kontrolltieren (Abbildung 3-23) färbt sich das Zytoplasma der Hepatozyten unterschiedlich und inhomogen an. Im Zytoplasma finden sich je nach Art der Degeneration Einschlüsse, die von Fetttropfen über Pigmentablagerungen und ausgeprägten Vakuolisierungen reichen. Grundsätzlich zeigen die mehr oder weniger gut erhaltenen Hepatozyten eine Vielzahl kleiner Vakuolen, bei denen es sich um geschwollene Mitochondrien handelt.
Bei den Tieren mit diffusen hepatozellulären Degenerationen zeigen sich auf lichtmikroskopischer Ebene am Semidünnschnitt keine Unterschiede zu den Tieren mit Tumorerkrankungen, bei denen degenerative Hepatozytenareale in Tumornähe ausgewählt wurden.
F F
F
F G
G
Abbildung 3-22 Ausgeprägte hepatozelluläre Degenerationserscheinungen bei einem Tier (K2025/3) aus der Gruppe 1. Neben Fetttropfen (F) zeigen sich Degenerationserscheinungen durch starke deutliche Schwellung der Hepatozyten (Pfeilspitzen). Andere Hepatozyten zeigen intrazytoplasmatische Pigmentablagerungen (dünne Pfeile) oder sind durch unregelmäßige Glykogenablagerungen (G) charakterisiert. In fast allen Zellen sind kleine Vakuolen zu erkennen, bei denen es sich um geschwollene Mitochondrien handelt (Semidünnschnitt, Methylenblau).
Kontrolltiere
Wie bei der lichtmikroskopischen Auswertung an H.E. gefärbten Paraffinschnitten zeigen auch die Semidünnschnitte der beiden Kontrolltiere an einzelnen Hepatozyten vereinzelte Anzeichen einer hepatozellulären Degeneration. Diese äußern sich in Form von leichten Vakuolisierungen im Zytoplasma oder hydropischen Schwellungen einzelner Hepatozyten. Überwiegend zeigt die Leber der Kontrolltiere einen regulären Aufbau der Leberbälkchen mit Hepatozyten, die ein homogen angefärbtes Zytoplasma aufweisen (Abbildung 3-23).
Abbildung 3-23 Kontrolltier (K2103) mit einzelnen Vakuolen in den ansonsten regelmäßig angeordneten Hepatozyten, die ein homogen gefärbtes Zytoplasma aufweisen (Semidünnschnitt, Methylenblau).
3.2.4.2 Ultradünnschnitte
3.2.4.2.1 Quantitative Unterschiede der Peroxisomenzahl
Nachdem anhand der Semidünnschnitte repräsentative Ultradünnschnitte aus den Leberproben angefertigt wurden, konnten diese im Hinblick auf morphologische sowie quantitative Unterschiede der Peroxisomen zwischen den Gruppen ultrastrukturell untersucht werden.
Für die quantitative Untersuchung der hepatozellulären Peroxisomen und deren Vergleich zwischen den Untersuchungsgruppen sowie in Abhängigkeit von Alter und Rasse/Gewichtsklasse der untersuchten Tiere wurden die Peroxisomen in jeweils sechs Hepatozyten pro Patient ausgezählt und auf die Gesamtfläche der Hepatozyten (µm²) bezogen.
3.2.4.2.2 Morphologische Unterschiede der Peroxisomen
Für die morphologische Untersuchung wurden die hepatozellulären Peroxisomen hinsichtlich ihrer Größe, ihrer Verteilung innerhalb der Zelle sowie ihrer Form (Protrusion, Marginalplatte, Nukleoid) beurteilt. Darüber hinaus wurden die hepatozellulären Mitochondrien beschrieben und die Anwesenheit von Lipidtropfen, Myelinfiguren und der Glykogengehalt semiquantitativ erfasst.
Die Ergebnisse der morphologischen Untersuchungen der hepatozellulären Peroxisomen und Mitochondrien sowie der semiquantitativen Auswertung von hepatozellulären Lipidtropfen, Myelinfiguren und Glykogengehalt sind für Gruppe 1(Tiere ohne Tumor) in Tabelle 3-12, für Gruppe 2 (Tiere mit Tumor) in Tabelle 3-13 und für Gruppe 3 (Kontrolltiere) in Tabelle 3-14 zusammengefasst.
Gruppe 1
Tabelle 3-12 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der Peroxisomen und der Hepatozyten bei Tieren ohne Lebertumoren
(+) vereinzelt (<10 %), + geringgradig (10-30 %), ++ mittelgradig (30-50 %), +++
hochgradig (50-100 %), x vorhanden, - nicht vorhanden, n.b. nicht beurteilbar
Merkmal
Gruppe 2
Tabelle 3-13 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der Peroxisomen und der Hepatozyten bei Lebertumoren
(+) vereinzelt (<10 %), + geringgradig (10-30 %), ++ mittelgradig (30-50 %), +++
hochgradig (50-100 %), x vorhanden, - nicht vorhanden, n.b. nicht beurteilbar
Merkmal
panzytär panzytär panzytär panzytär panzytär Cluster
panzytär panzytär panzytär Cluster
Gruppe 3
Tabelle 3-14 Semiquantitative Beurteilung der Morphologie der Peroxisomen und der Hepatozyten bei Kontrolltieren
(+) vereinzelt (<10 %), + geringgradig (10-30 %), ++ mittelgradig (30-50 %), +++
hochgradig (50-100 %), x vorhanden, - nicht vorhanden, n.b. nicht beurteilbar
Merkmal K 2104-7 K 2104-8 K 2104-9 K 2103-3 K 2103-12 K 2103-15
Unterschiede in der Peroxisomengröße
Bei der ultrastrukturellen Untersuchung der Hepatozyten wurde das Vorkommen von Peroxisomen unterschiedlicher Größe semiquantitativ erfasst, wobei in der Auswertung die Anzahl der Peroxisomen mit keine (0%), vereinzelt (<10 %), geringgradig (10-30 %), mittelgradig (30-50 %) und hochgradig (50-100 %) erfasst wurde. Zusätzlich wurde dabei zwischen kleinen (Durchmesser ca. 555 nm) und großen (Durchmesser ca. 918 nm) Peroxisomen unterschieden.
Es zeigte sich, dass in Gruppe 1 45,4 % der Patienten eine mittelgradige Anzahl kleiner Peroxisomen aufwies, während bei 36,5 % der Patienten geringgradig kleine und bei 18,1 % nur vereinzelt kleine Peroxisomen gefunden wurden. Das Vorkommen großer Peroxisomen war dagegen in Gruppe 1 anders verteilt. So enthielten die Hepatozyten von 63,6 % der Patienten große Peroxisomen in geringer Anzahl, während zwei Patienten (18,2 %) nur vereinzelt Peroxisomen aufwiesen. Bei einem Patienten dieser Gruppe konnten keine Peroxisomen festgestellt werden, während ein Tier große Peroxisomen in mittelgradiger Anzahl besaß.
In Gruppe 2 zeigten sich in den Hepatozyten aller Patienten nahezu gleichermaßen kleine sowie große Peroxisomen in geringgradigem Ausmaß, wobei ein Patient gar keine großen Peroxisomen aufwies.
Die Kontrollgruppe (Gruppe 3) zeichnete sich dadurch aus, dass die meisten der untersuchten Hepatozyten (66,6 %) hochgradig große Peroxisomen enthielten und nur in einem Schnittpräparat jeweils eine gering- bis mittelgradige Anzahl großer Peroxisomen gefunden wurde. Kleine Peroxisomen waren in 66,7 % der Fälle in geringgradiger Anzahl feststellbar.
Eine Übersicht über die Verteilung großer und kleiner Peroxisomen in den drei Untersuchungsgruppen ist in Abbildung 3-24 und Abbildung 3-25 dargestellt.
Die vergleichende statistische Auswertung aller Gruppen hinsichtlich des Auftretens von kleinen Peroxisomen in den Hepatozyten ergab keinen signifikanten Unterschied (Kruskal Wallis Test), während bei den großen Peroxisomen ein signifikanter
Unterschied festzustellen war (Kruskal Wallis Test p-Wert 0,0288; signifikant ab p <0,05).
Ein paarweiser Gruppenvergleich ist aufgrund einer zu kleinen Gruppengröße aller Untersuchungsgruppen nicht durchgeführt worden.
Abbildung 3-24 Verteilung kleiner Peroxisomen in den Gruppen 1-3
Abbildung 3-25 Verteilung großer Peroxisomen in den Gruppen 1-3
Verteilung der Peroxisomen in der Zelle
Bei der Untersuchung des Verteilungsmusters der Peroxisomen innerhalb der Hepatozyten wurde zwischen einem panzytären Auftreten, Gruppenbildung (Cluster) (Abbildung 3-27), Anhäufungen im Bereich des Kernes (perinukleär) (Abbildung 3-28) und sonstigen Verteilungsmustern unterschieden. Wie in Abbildung 3-26 ersichtlich, waren die Peroxisomen in Gruppe 1 und 2 am häufigsten panzytär verteilt, gefolgt von Clusterbildung. In der Kontrollgruppe hingegen waren die Peroxisomen am häufigsten in Clustern angeordnet und weniger häufig panzytär bzw. perinukleär. In Gruppe 1 konnte außerdem bei einem Patienten eine deutlich mit Fetttropfen und degenerierten Mitochondrien (Abbildung 3-29) assoziierte Lokalisation der Peroxisomen beobachtet werden. Hinsichtlich der statistischen Auswertung der Verteilung der Peroxisomen in den vier Merkmalen (Nähe Fettropfen, Cluster, panzytär, perinukleär) ergab sich lediglich in einem Merkmal (Cluster) ein signifikantes Ergebnis. Gruppe 1 zeigte das Auftreten der Peroxisomen in Form eines Clusters zu 36,4 %, während Gruppe 2 das Merkmal zu 25 % aufwies und Gruppe 3 zu 100 %. Der Unterschied erwies sich zwischen allen drei Gruppen im Merkmal (Cluster) als signifikant p 0,01233 (p Wert signifikant ab p <0,05).
Abbildung 3-26 Peroxisomales Verteilungsmuster der Gruppen 1-3
M
Abbildung 3-27 Verteilungsmuster der Peroxisomen (Pfeile) als Cluster. Mitochondrium (M) (K2103/15, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).
N M M
M M M
Abbildung 3-28 Perinukleäres Verteilungsmuster der Peroxisomen (Pfeile). Nukleus (N), Mitochondrium (M) (K2103/12, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr.
6300x).
Px
Px Px
Px F
F F F
M
Abbildung 3-29 Verteilung der Peroxisomen (Px) im Bereich von Fetttropfen (F) und Mitochondrium (M).
(K2029, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).
Morphologische Veränderungen der Peroxisomen
Die hepatozellulären Peroxisomen wurden darüber hinaus hinsichtlich ihrer morphologischen Eigenschaften in den verschiedenen Untersuchungsgruppen beurteilt (Abbildung 3-30). Dabei zeigte sich, dass in Gruppe 1 Marginalplatten (Abbildung 3-32) am häufigsten mit 90,1 % zu finden waren, gefolgt vom Auftreten eines Nukleoids (72,3 %) (Abbildung 3-33). In weniger als 50 % der Fälle wiesen die Peroxisomen in Gruppe 1 Protrusionen (Abbildung 3-31) auf. In Gruppe 2 dagegen wurden Protrusionen (75 %) ebenso häufig wie Marginalplatten (75 %) festgestellt.
Das Auftreten eines Nukleoids war geringfügig (62,5 %). In der Kontrollgruppe waren Nukleoide dagegen am häufigsten nachweisbar (83,3 %), gefolgt von Protrusionen (66,7 %) und dem Vorhandensein einer Marginalplatte (50 %). Bei der statistischen Auswertung mit Hilfe des Pearson Chi-Quadrat Testes konnten in keinem Fall signifikante Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen ermittelt werden (Protrusion p-Wert 0,40036; Marginalplatte p-Wert 0,16792; Nukleoid p-Wert 0,68960 signifikant ab p<0,05000).
Abbildung 3-30 Morphologische Veränderungen der Peroxisomen der Gruppen 1-3
Px M
N
Abbildung 3-31 Protrusion (roter Pfeil) eines Peroxisoms (Px). Mitochondrium (M), Nukleus (N) (K1965, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 12.000x).
M Px
Px
Px Px
Abbildung 3-32 Marginalplatten (rote Pfeile) der Peroxisomen (Px). Mitochondrium (M), das geschwollen ist. (K2029, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr.
16.000x).
Px Nk
Abbildung 3-33 Peroxisom (Px) mit Nukleoid (Nk) und Marginalplatte (Pfeil). (K1969, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 25.000x).
Mitochondriale Eigenschaften
Neben den Peroxisomen wurden außerdem die hepatozellulären Mitochondrien hinsichtlich Schwellungen, lytischen Prozessen und parakristallinen Einschlüssen sowie der Anwesenheit von Riesenmitochondrien ultrastrukturell untersucht (Abbildung 3-34).
Dabei zeigten sich in Gruppe 1 am häufigsten Riesenmitochondrien (90,1 %) (Abbildung 3-35) gefolgt von Schwellungen (63,6 %) (Abbildung 3-37), Lysen (45,5
%) (Abbildung 3-36) und Einschlüssen (36,4 %) (Abbildung 3-35). In Gruppe 2 waren die am häufigsten beobachteten mitochondrialen Veränderungen in Form von Schwellung (75 %) und Lyse (75 %) zu finden. Riesenmitochondrien und parakristalline Einschlüsse kamen dagegen nur bei der Hälfte bzw. etwas mehr als einem Drittel der untersuchten Patienten von Gruppe 2 vor. In der Kontrollgruppe zeigten sämtliche Lokalisationen eine ausgeprägte Schwellung der Mitochondrien und sehr häufig waren Riesenmitochondrien anzutreffen (83,3 %). Die Hälfte der untersuchten Lokalisationen wiesen lytisch veränderte Mitochondrien auf und nur zu 16,7 % konnten parakristalline Einschlüsse gefunden werden. Die statistische Auswertung mit dem Pearson Chi square-Test hinsichtlich der mitochondrialen Eigenschaften Schwellung, Lyse, parakristallinen Einschlüssen und Riesenmitochondrien ergab keinen signifikanten Unterschied (Schwellung p-Wert 2,4403; Lyse Wert 0,41558; Einschlüsse Wert 0,65189; Riesenmitochondrien p-Wert 0,10634; signifikanter p-p-Wert <0,0500).
Abbildung 3-34 Eigenschaften der Mitochondrien der Gruppen 1-3
RM
M
Abbildung 3-35 Riesenmitochondrium (RM) mit parakristallinen Einschlüssen (Pfeile) in Nachbarschaft zu einem normal großen Mitochondrium (M) verdeutlicht den Größenunterschied. (K1979, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).
M
Abbildung 3-36 Lyse eines Mitochondriums (M). (K2015, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronen-mikroskopie, Gerätevergr. 12.500x).
M
Abbildung 3-37 Schwellung eines Mitochondriums (M). (K2015, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 12.500x).
Lipidgehalt, Myelinfiguren und Glykogengehalt
Auch elektronenmikroskopisch konnten intrahepatozelluläre Lipidtropfen in allen Untersuchungsgruppen nachgewiesen werden (Abbildung 3-39). Entsprechend wurden ausgewählte Hepatozyten aus den drei Untersuchungsgruppen auf ihren Lipid- und Glykogengehalt sowie auf das Vorkommen von Myelinfiguren untersucht und semiquantitativ ausgewertet (Abbildung 3-38). Dabei zeigte sich, dass in Gruppe 1 tendenziell die meisten Lipidtropfen mit mittelgradigen Mengen bei fast 30 % der untersuchten Hepatozyten nachgewiesen werden konnten. In Gruppe 2 zeigten dagegen nur 12,5 % einen mittelgradigen Lipidgehalt und die Mehrheit der Patienten wiesen überhaupt keine Lipidtropfen auf (62,5 %). In der Kontrollgruppe waren minimale bis geringgradige Lipidgehalte gleichermaßen in den untersuchten Schnittebenen verteilt. Zur statistischen Auswertung wurde der Kruskal-Wallis Test herangezogen. Dabei wurden die drei Untersuchungsgruppen hinsichtlich des Merkmals Lipidtropfen global betrachtet. Hierbei ergab sich ein signifikanter p-Wert 0,0107 (p-Wert signifikant <0,05000). Im Paarvergleich, der mittels des Mann-Whitney U-Testes durchgeführt wurde, fand sich zwischen Gruppe 2 und 3 ein signifikanter Unterschied p-Wert 0,008132 (p-Wert signifikant <0,017).
Abbildung 3-38 Häufigkeit des Vorkommens von Lipidtropfen in den Hepatozyten der Untersuchungsgruppen 1-3
Hepatozyt
F
F F
F
F F
F
Abbildung 3-39 Gemischttropfige Verfettung (F) eines Hepatozyten. (K1972, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. links 2500x und rechts 3150x).
Myelinfiguren als Einschlüsse in Mitochondrien oder Autophagosomen repräsentieren möglicherweise pathologische Konformationen von Membran-proteinen und Lipoproteinschichten und wurden vor allem in Gruppe 2 in gehäufter Form beobachtet. Hier zeigten 37,5 % der Hepatozyten mittelgradige und 25 % hochgradige Anhäufungen von Myelinfiguren (Abbildung 3-40 und Abbildung 3-41), während sie bei 25 % der Hepatozyten nur in minimaler Ausprägung gefunden wurden. In 12,5 % der Gruppe 2 konnten keine Myelinfiguren nachgewiesen werden.
In Gruppe 1 waren vor allem geringgradige Mengen von Myelinfiguren erkennbar (54,5 %) und bei 27,3 % traten sie in mittelgradiger Ausprägung auf. Der Rest zeigte entweder keine (9,1 %) oder nur minimale (9,1 %) Anzeichen von Myelinfiguren. Bei keinem Patienten der Gruppe 1 wurden hochgradige Anhäufungen von Myelinfiguren festgestellt. In der Kontrollgruppe wurden zu gleichen Teilen minimale bis geringgradige Mengen von Myelinfiguren nachgewiesen. Die statistische Auswertung mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests ergab keinen signifikanten Unterschied p-Wert
0,2402 (p-Wert signifikant ab p <0,05000). Ein Paarvergleich wurde nicht durchgeführt.
Abbildung 3-40 Häufigkeit des Auftretens von Myelinfiguren
M
MF
Abbildung 3-41 Myelinfigur (MF) in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem Mitochondrium (M). (K2015, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).
In Gruppe 1 und 3 war der Glykogengehalt der untersuchten Leberzellen am höchsten (Abbildung 3-42). Das Glykogen stellt sich dabei elektronenmikroskopisch als Ansammlung feingranulären Materials dar (Abbildung 3-43). Die Kontrollgruppe zeigte dabei einen hochgradigen Glykogengehalt in 100 % der untersuchten Zellen.
In Gruppe 1 wurden bei 63,6 % hochgradige Mengen und bei 18,2 % mittelgradige Mengen an Glykogen festgestellt. Der Rest zeigte entweder nur wenig oder gar kein Glykogen. In Gruppe 2 zeigte die Hälfte der untersuchten Patienten mittelgradige Glykogenmengen, während jeweils ein Viertel entweder geringgradige oder hochgradige Glykogengehalte aufwies. Die statistische Auswertung mittels des Kruskall-Wallis-Test ergab eine Signifikanz. Der p-Wert lag bei 0,0217 (p-Wert signifikant ab <0,05000). Der Paarvergleich der Gruppen untereinander mittels des Mann-Whitney U-Testes ergab keine signifikanten Werte (p-Wert signifikant ab p
<0,017).
Abbildung 3-42 Glykogengehalt der Hepatozyten der Untersuchungsgruppen 1-3
Px Nk
Abbildung 3-43 Ausgeprägte Glykogenansammlungen (rote Pfeile) neben einem Peroxisom (Px) mit Nukleoid (N) und sichtbarer Marginalplatte (schwarzer Pfeil). (K1972, Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr.16.000x).
3.2.4.2.4 Quantitative Unterschiede
Um herauszufinden, ob sich die Anzahl der Peroxisomen in Abhängigkeit von unterschiedlichen Krankheitsprozessen in der Leber sowie je nach Alter bzw.
Rasse/Gewichtsklasse der untersuchten Hunde unterscheidet, wurden die Peroxisomen in sechs repräsentativen Hepatozyten pro Patient bzw. 18 Hepatozyten pro Kontrolltier (jeweils 6 Hepatozyten aus 3 verschiedenen Lokalisationen) ausgezählt. Dabei wurde die ausgezählte Peroxisomenmenge auf die Fläche des untersuchten Hepatozyten bezogen und aus allen untersuchten Hepatozyten der Mittelwert gebildet. Die Tabellen mit den ausgezählten Peroxisomen pro µm² Hepatozyt sowie deren Mittelwerte sind im Anhang (Anhangstabelle 10-11) aufgeführt. Im Anhang (Anhangstabelle 10-12) findet sich eine Gesamtübersicht der zur statistischen Untersuchung verwendeten Daten.
Unterschiede zwischen den Gruppen
Die durchschnittliche Peroxisomenzahl/µm² Hepatozyt betrug für die Gruppe 1 0,13 und lag damit etwas höher als in den Gruppen 2 und 3 mit jeweils 0,1 Peroxisomen/µm² Hepatozyt (Abbildung 3-44). Beim Vergleich der untersuchten Patientengruppen untereinander sowie mit den Kontrolltieren konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Hunden der Gruppe 1, Gruppe 2 und den Kontrolltieren (Gruppe 3) gefunden werden (einfaktorielle ANOVA, p-Wert 0,17515).
Abbildung 3-44 Darstellung der Mittelwerte der Peroxisomenzahl/Hepatozytenfläche (µm²) in den drei Untersuchungsgruppen
Altersabhängige Unterschiede
Da sich zwischen den Untersuchungsgruppen keine statistisch signifikanten Unterschiede der Peroxisomenzahl/µm² Hepatozyt ergaben und die Patientenzahl pro Untersuchungsgruppe für eine Einteilung in unterschiedliche Altersstufen innerhalb der Gruppe zu niedrig war, wurden sämtliche untersuchten Tiere aus allen Gruppen zusammengefasst und in drei Altersklassen (1-5 Jahre, 6-10 Jahre, 11-15 Jahre) eingeteilt, um mögliche altersabhängige Unterschiede der
0,00
Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3
n/µm²
Durchschnittliche Px Zahl pro µm² Hepatozyt (Mittelwerte mit Standardabweichung)
Peroxisomenanzahl/µm² Hepatozyt zu ermitteln (Anhangstabelle 10-12). Dabei zeigte sich, dass Tiere im Alter von 11-15 Jahren durchschnittlich etwas mehr Peroxisomen/µm² Hepatozyt (0,12) aufwiesen, als jüngere Tiere (jeweils ca. 0,1 Peroxisom/µm² Hepatozyt). Die statistische Analyse mittels eines einfaktoriellen ANOVA Testes ergab jedoch keine signifikanten Unterschiede (p-Wert 0,38906) zwischen den verschiedenen Altersklassen (Abbildung 3-45).
1-5 Jahre 6-10 Jahre 11-15 Jahre
Altersgruppen 0,06
0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16
Mittelwerte der Peroxisomen/ Fläche µm²
Abbildung 3-45 Mittelwerte der Peroxisomen/Hepatozytenfläche(µm²) in Bezug zu den Altersgruppen
Gewichts- bzw. rasseabhängige Unterschiede
Neben altersabhängigen Unterschieden wurden außerdem quantitative Unterschiede der hepatozellulären Peroxisomen in Abhängigkeit der Rasse bzw. des Gewichtes der untersuchten Hunde ausgewertet. Hierzu wurden ebenfalls sämtliche Tiere aus allen Gruppen zusammengefasst und in drei Gewichtsklassen (0-10 kg, 10-20 kg, 20-40 kg) eingeteilt (Anhangstabelle 10-12). Beim Vergleich der durschnittlichen Peroxisomenanzahl/µm² Hepatozyt fiel auf, dass die Hunde kleiner Rassen bzw. der
Gewichtsklasse1 (0-10 kg) im Mittel deutlich mehr Peroxisomen aufwiesen als Hunde mittlerer (10-20 kg) bzw. großer Rassen (20-40 kg) Gewichtsklassen. Die statistische Auswertung mittels des einfaktoriellen ANOVA Tests der verschiedenen Gewichtsklassen in Bezug auf die Mittelwerte der Peroxisomenanzahl/µm² Hepatozyt ergab einen signifikanten Unterschied (p-Wert 0,04023). Der Paarvergleich ergab unter Verwendung des t-Testes nach Bonforoni-Anpassung (p-Wert signifikant ab
<0,017) einen signifikanten Unterschied (p-Wert 0,016221) zwischen den Gruppen 1 (0-10 kg) und Gruppe 3 (20-40 kg).
0-10kg 10-20kg 20-40kg
Gewichtsklassen 0,05
0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0,17 0,18
Mittelwerte der Peroxisomen/ µm² Fläche
Abbildung 3-46 Mittelwerte der Peroxisomen/Hepatozytenfläche (µm²) in Bezug zu den Gewichtsklassen
4 Diskussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende lichtmikroskopische und elektronenmikroskopische Untersuchung von caninen Hepatozyten im Hinblick auf morphologische und quantitative Unterschiede der Peroxisomen bei Tieren mit primären degenerativen Lebererkrankungen sowie bei Tieren mit neoplastischen Veränderungen in der Leber. Zur Diagnostik der Lebererkrankung wurden neben der pathohistologischen Untersuchung der Leberbiopsien auch leberspezifische klinisch-chemische Blutparameter untersucht, die in der Diagnostik von Lebererkrankungen von Bedeutung sind.