2.1 Das Peroxisom
2.1.2 Funktion
Die Peroxisomen sind in ein großes Spektrum an Aufgaben und Funktionen in der eukaryontischen Zelle involviert (PLATTA u. ERDMANN 2007). Sie sind besonders an Oxidations- und Detoxifikationsvorgängen beteiligt (CHEVILLE 1994e). Die Aufgaben der Peroxisomen variieren je nach Organismus, Gewebe und der Umgebung, in der sie sich befinden. Daher verfügen sie in den einzelnen Geweben über unterschiedliche Enzymausstattungen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992) mit über 50 verschiedenen Enzymen (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Davon sind die meisten ausschließlich in Peroxisomen lokalisiert, während einige außerdem in Mitochondrien vorkommen (WANDERS u. WATERHAM 2006). Trotz der großen enzymatischen Variation gilt jedoch das Auftreten von Oxidase und Katalase in den Peroxisomen als konstant und dient somit ihrer Charakterisierung und Identifizierung (MASTERS u. CRANE 1995).
Mehr als siebzig Prozent der peroxisomalen Enzyme befinden sich in der Matrix.
Einige wenige Enzyme sind im Nukleoid lokalisiert und der verbleibende Anteil ist in der einfachen Membran der Peroxisomen angesiedelt (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).
Das Aufgabenspektrum ist sehr komplex und umfasst den Peroxidmetabolismus, die ß-Oxidation sowie die Biosynthese von Etherphospholipiden (Plasmalogene), welche
besonders im Nervensystem zu finden sind. Die Synthese von Cholesterol, Gallensäuren, Leukotrienen, Prostaglandinen und der Metabolismus von Xenobiotika obliegt ebenfalls den Peroxisomen. Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil von Membranen und dient als Komponente von Lipoproteinen. Darüber hinaus ist es an der Synthese von Gallensäuren und Steroiden beteiligt (MASTERS u. CRANE 1995).
Da Peroxisomen auch am Abbau insbesondere von sehr langkettigen Fettsäuren beteiligt sind, haben ihre Abwesenheit oder das Fehlen eines ihrer Enzyme, wie Katalase oder Oxidase, metabolische Konsequenzen. Zahlreiche angeborene Erkrankungen, darunter das Zellweger Syndrom, lassen Peroxisomen in den Körperzellen missen und führen dadurch zu schweren körperlichen Anomalien, die mit einem Überleben über das Säuglingsalter hinaus nicht vereinbar sind. Ein anderes Beispiel ist der Urikasedefekt des Dalmatiners, bei dem das dunkle Zentrum des Peroxisomes, als Sitz der Urikase definiert, beim Dalmatiner deutlich kleiner ausgeprägt ist als bei anderen Hunderassen. Das klinische Bild ist durch deutlich erhöhte Harnsäureaussscheidung charakterisiert mit der Gefahr der Uratsteinbildung in den harnbildenden und –ableitenden Wegen (CHEVILLE 1994a).
Im Folgenden werden die wichtigsten Funktionen und Aufgaben der Peroxisomen näher erläutert.
2.1.2.1 Peroxidmetabolismus
Eine der wichtigsten Funktionen der Peroxisomen ist die Neutralisierung von freien Radikalen mit Hilfe enzymatischer Mechanismen, die im Folgenden besprochen werden.
Oxidativer Stress ist ein Zustand der Imbalanz zwischen prooxidativ wirkenden Komponenten (Oxidantien) und antioxidativ wirkenden Abwehrmechanismen (Antioxidantien), der durch einen Überschuss an freien Radikalen gekennzeichnet ist (DJORDJEVIC 2004). Der Redox Status ist dabei ein übergeordneter Begriff, der beide Mechanismen zusammenfasst (WEBB u. TWEDT 2008).
Freie Radikale wirken prooxidativ, da sie ein oder mehrere ungepaarte Elektronen aufweisen (WEBB u. TWEDT 2008). Zu dieser Gruppe gehören das Superoxid-Radikal O2-, das Hydrogen Radikal H•, das Hydroxyl Radikal OH• und das Hydrogen Peroxid Radikal H2O2 (DJORDJEVIC 2004). Diese sind in der Lage, unterschiedliche Biomoleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren (DJORDJEVIC 2004) anzugreifen und in ihrer Funktion schwer zu beeinträchtigen (LÖFFLER et al. 2007).
Die meisten freien Radikale stammen vom Sauerstoff ab, dann bezeichnet man sie auch als reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS=reactive oxygen species). Die Radikalbildung ist unweigerlich an die mitochondriale Energieproduktion gekoppelt (GEROK 1995; MANDELKER 2008; WEBB u. TWEDT 2008). Die Reduktion des Sauerstoffes während der mitochondrialen Atmungskette erzeugt freie Radikale wie das Superoxidradikal (MANDELKER 2008). Die zweite Gruppe der Radikale stammt von Stickstoff ab und wird als Gruppe reaktiver Nitrogenverbindungen (RNS) bezeichnet (MANDELKER 2008). Der gesunde Organismus wandelt ein Viertel des eingeatmeten Sauerstoffes zu Radikalen um. Bei Krankheit werden sogar drei Viertel des inspiratorischen Sauerstoffes in Radikale umgesetzt (DJORDJEVIC 2004).
Freie Radikale sind an der Pathogenese von zahlreichen Krankheitsprozessen beteiligt, beeinflussen das Immunsystem negativ und beschleunigen den Alterungsprozess der Zelle (DJORDJEVIC 2004; MANDELKER 2008; CAMOES et al. 2009). So können zahlreiche unterschiedliche Ursachen wie Toxämien, Infektionen, hypoxisch-ischämische Zustände, Hyperglykämien, die Verstoff-wechslung von Xenobiotika, Hyperlipidämien, Hyperproteinämien, Neoplasien, Entzündungen sowie Immunreaktionen und erhöhte metabolische Raten oxidativen Stress auslösen. Vor allem bei alternden Geweben kann ein zu niedriger ATP Gehalt, bedingt durch eine ungenügende mitochondriale Produktion, zu erhöhtem oxidativen Stress führen (MANDELKER 2008). Außerdem entstehen freie Radikale bei Absorption von Strahlung, dem Metabolismus von Ethanol in Hepatozyten und Lipidperoxidation von ungesättigten Fettsäuren (DJORDJEVIC 2004). Der Vorgang der Lipidperoxidation wird dabei selbst auch durch freie Radikale in Gang gesetzt und dann durch sekundär gebildete Radikale aufrecht erhalten, welche das umliegende Gewebe schädigen und so eine Kettenreaktion auslösen. Von der
Lipidperoxidation sind besonders die sehr empfindlichen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren als Bestandteil von Zellmembranen und intrazellulären Organellen betroffen (DJORDJEVIC 2004).
Die Folge der Lipidperoxidation ist eine Zunahme der Membranpermeabiltät, so dass die Integrität von Zellorganellen wie Peroxisomen, Mitochondrien und Lysosomen herabgesetzt wird. Darüber hinaus werden Enzyme und Rezeptoren inaktiviert.
Letztlich kann die Peroxidation zur Zerstörung aller Lipidmembranen führen (HARMAN 1956). Mit der Zerstörung von Zellorganellen, wie z.B. den Mitochondrien, beginnt der Alterungsprozess der Zelle, da die Energieproduktion abnimmt, vermehrt freie Radikale anfallen und der oxidative Stress zunimmt, was wiederum zu einer weiteren Zellschädigung führt (WALLACE 2001). Zusammenfassend kann also der oxidative Schaden, verursacht durch freie Radikale, entweder die Ursache aber auch die Folge mitochondrialer Dysfunktion sein (MANDELKER 2008).
Der Entstehung von Tumoren liegen Mutationen und unkontrollierte Zellproliferationen zu Grunde. Die chronische Exposition durch oxidativen Stress kann Mutationen der DNA zur Folge haben, die zur Expression modifizierter Gene führen und somit das Wachstum von Tumoren unterstützen. Daher wird dem oxidativen Stress auch eine Beteiligung an der Karzinogenese zugesprochen (DJORDJEVIC 2004; KLAUNIG u. KAMENDULIS 2004).
Antioxidantien
Antioxidative Mechanismen wirken den freien Radikalen entgegen und können in enzymatische und nicht enzymatische Prozesse eingeteilt werden. Im Folgenden werden nur die enzymatischen Antioxidantien besprochen, da diese in Peroxisomen vorkommen. Zu dieser Gruppe gehören die Katalase, als ein Bestandteil der Peroxisomen, die Glutathionperoxidase und die Superoxiddismutase (SOD) (GEROK 1995; SCHRADER u. FAHIMI 2004). Glutathionperoxidasen sind wichtige Bestandteile des antioxidativen Schutzsystems aller Zellen, kommen aber auch im Extrazellularraum vor (LÖFFLER et al. 2007). Das Enzym ist in der Matrix und in den Mitochondrien lokalisiert und kann als ein alternatives Enzym zur Katalase betrachtet werden. Es ist in der Lage, organische Peroxide, wie Lipidperoxide (CHEVILLE
1994b; DJORDJEVIC 2004; LÖFFLER et al. 2007) oder Wasserstoffperoxide abzubauen, wenn die Katalaseaktivität ausgeschaltet ist, wie z.B. im Falle einer Endotoxämie oder des Ischämie-Reperfusionssyndroms (SINGH et al. 1994).
Die Superoxiddismutase (SOD) existiert in verschiedenen Varianten mit unterschiedlichen Metallionen im aktiven Bereich des Enzyms. CuZn SOD findet sich im Zytoplasma, im Kern und in Peroxisomen von Säugetieren (DJORDJEVIC 2004).
Weiterhin existiert eine SOD im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten (MARKLUND 1980). Eine erhöhte Aktivität der SOD wird über Zytokine wie IFN γ induziert, während eine verminderte Aktivität über TNFα und TGF β eingeleitet wird (MARKLUND 1992). Die SOD unterstützt die Beseitigung von Superoxidanion- und Hydroxyperoxidradikalen, indem das weniger reaktionsfähige Wasserstoffperoxid und molekularer Sauerstoff entsteht (GEROK 1995). Das Wasserstoffperoxid dient dann wiederum der Katalase als Substrat (MASTERS u. CRANE 1995;
ANGERMULLER et al. 2009).
Peroxisomen verfügen sowohl über Oxidasen, die Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduzieren können, als auch über Katalasen, die Wasserstoffperoxid zu Wasser reduzieren (BAUDHUIN et al. 1965; DE DUVE u. BAUDHUIN 1966; SHNITKA 1966).
Die Enzyme Katalase und einige Oxidasen sind in der Matrix lokalisiert (BAUDHUIN et al. 1965). Es existieren verschiedene Oxidasen, die ein spezielles Endprodukt und zusätzlich Wasserstoffperoxid produzieren. Zu den peroxisomalen Oxidasen gehören die L-α-Hydroxyacid-Oxidasen A und B. Hydroxyacid-Oxidase A ist in der Matrix und Hydroxyacid-Oxidase B ist in der Marginalplatte lokalisiert. Beide Enzyme finden sich insbesondere in Leber und Niere. Eine weitere Oxidase, die D-Aminoacid-Oxidase, ist außer in den Peroxisomen auch frei im Zytosol der Zelle vorhanden (MASTERS u.
CRANE 1995).
Die Produktion und Reduktion der Wasserstoffperoxide mittels Katalase sowie die Entgiftung anderer reaktiver Sauerstoffradikale schützt Zellen vor oxidativen Schädigungen (TERLECKY et al. 2006). Die Katalase ist ein ubiquitäres Enzym (SHARMA et al. 1989), das 40 % des peroxisomalen Proteins ausmacht (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966) und eine besonders hohe Aktivität in der Leber aufweist. Außer
in Peroxisomen ist das Enzym auch in Mitochondrien lokalisiert, eine für die Zelle günstige Lage, da hier viele Wasserstoffperoxid produzierende Enzyme ansässig sind (SHARMA et al. 1989).
Die Katalase unterstützt sowohl katalytische als auch peroxidative Reaktionen.
Beide Reaktionen benötigen Wasserstoffperoxid. Im katalytischen Fall kommt ein zweites Wasserstoffperoxid zur Reaktion dazu und es entsteht Wasser und Sauerstoff. In der peroxidativen Reaktion reagiert Wasserstoff mit weiteren Wasserstoffdonatoren, wie Alkoholen, Phenolen, Nitriten, Formaldehyd und primären Aminen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; GEROK 1995; MASTERS u.
CRANE 1995).
Katalytische Reaktion: H2O2 + H2O 2H2O + O2
Peroxidative Reaktion: H2O2 + RH2 2H2O + R
Peroxiosmen verfügen über zahlreiche weitere Enzyme. Eine umfassende Übersicht bieten Kapitel 2 („Enzymology“) und Kapitel 3 („Intraparticulate organization of peroxisomal proteins-methodology and topology“) des Buches „The peroxisome: a vital organelle“ von Colin Masters und Denis Crane (MASTERS u. CRANE 1995).
Rolle der Mitochondrien bei oxidativem Stress
Mitochondrien werden ursächlich durch Hypoxie, freie Radikale und Toxinbelastung geschädigt (VIEIRA u. KROEMER 1999).
Neben den vielseitigen, für die Zelle nützlichen Aufgaben, tragen die Mitochondrien aber auch selbst zur Radikalbildung bei (ROTH 1997). O2- und H2O2 reagieren häufig mit Eisen, das sich in den Mitochondrien befindet. Dadurch kann die mitochondriale DNA geschädigt werden. Die Folge dieser Schädigung ist eine Verstärkung des oxidativen Stresses aufgrund Expression veränderter Proteine, die verantwortlich für die Elektronentransportkette sind. Es entsteht ein Circulus vitiosus mit verstärkter
Radikalbildung (LEE u. WEI 1997) Unter physiologischen Bedingungen werden die Radikale durch Antioxidantien neutralisiert (ROTH 1997). Das wichtigste Antioxidans zum Schutz der Mitochondrien ist Glutathion (MANDELKER 2008). Bei Krankheitszuständen, z.B. Sepsis, reichen diese Mechanismen jedoch nicht aus und erschöpfen (ROTH 1997). Oxidativer Stress der Mitochondrien kann zu einer Aktivierung der Mitochondrienexpression führen und damit zu Erhöhung der Organellenanzahl (MANDELKER 2008). Neben dem Enzym Glutathion schützen erhöhte peroxisomale Katalasekonzentrationen die Mitochondrien vor Fehl-funktionen, während niedrige Konzentrationen zu einer mitochondrialen Dysfunktion führen können (KOEPKE et al. 2008).
2.1.2.2 ß-Oxidation
In der Pilz- und Pflanzenzelle ist dieser biochemische Vorgang ausschließlich in den Peroxisomen lokalisiert. In eukaryontischen Zellen findet die ß-Oxidation sowohl in Mitochondrien als auch in Peroxisomen statt, mit dem Ziel, die Lipidhomöostase aufrechtzuerhalten (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).
Das peroxisomale ß-Oxidationssystem dient über etwa fünf hintereinander ablaufende ß-Oxidationszyklen der Verkürzung von sehr langen und toxischen Fettsäuren (REDDY u. MANNAERTS 1994; MASTERS u. CRANE 1995;
HASHIMOTO 1999). Kurze Fettsäuren (<C8) sind kein geeignetes Substrat für Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992). Die peroxisomale Oxidationsrate der Fettsäuren durch die Peroxisomen nimmt bei gleichzeitig sich verkürzender Kettenlänge ab. Ungesättigte Fettsäuren werden dahingegen bevorzugt von den Peroxisomen oxidiert (MASTERS u. CRANE 1995).
Die daraus hervorgehenden kurz- und mittellangen Fettsäuren erreichen dann das ß-Oxidationssystem der Mitochondrien. Diese Verstrickung der Stoffwechselwege zeigt das enge Verhältnis von Mitochondrien und Peroxisomen (LAZAROW 1978;
HASHIMOTO 1987; MASTERS u. CRANE 1995). Der weitaus größte Anteil der langen Fettsäuren wird in Mitochondrien der ß-Oxidation unterzogen. Die Begründung liegt darin, dass die mitochondriale ß-Oxidation im Hinblick auf die
Energiegewinnung um das zweifache effektiver ist als die peroxisomale ß-Oxidation der Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).
Die Enzyme zur peroxisomalen ß-Oxidation befinden sich in der Matrix. Dabei unterliegt die peroxisomale Enzymausstattung einer Dynamik, die von dem Gewebe, der Spezies und den Rahmenbedingungen sowie dem Einfluss von Umweltfaktoren oder Xenobiotika abhängt (MASTERS u. CRANE 1995).
Die eigentliche ß-Oxidation gesättigter Fettsäuren verläuft in vier Schritten (Abbildung 2-3):
1) Acyl-CoA wird mittels Acyl-CoA-Dehydrogenase zu 2-trans-Enoyl-CoA oxidiert, dabei entsteht Wasserstoffperoxid.
2) Hydratationsschritt mittels Enoyl-CoA-Hydratase mit Zwischenprodukt L-Hydroxyl-CoA.
3) Oxidationsschritt mittels L-3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase mit dem Zwischenprodukt 3-Ketoacyl-CoA
4) Aus 3-Ketoacyl-CoA entsteht durch das Enzym ß-Ketoacyl-CoA-Thiolase, mittels der thiolytischen Spaltung des Ketoacyl-CoAs, ein Acetyl-CoA und eine um zwei C-Atome verkürzte aktivierte Fettsäure, die wieder in den ß-Oxidationszyklus einfließen kann (LAZAROW 1978; HASHIMOTO 1987)
Abbildung 2-3 Abbau geradzahliger Fettsäuren durch β-Oxidation (LÖFFLER et al. 2007)
Der Vorgang der ß-Oxidation beginnt mit der Aktivierung der Fettsäure. Die peroxisomale Membran besitzt zwei Acyl-CoA-Synthetasen, die an der Aktivierung von langen (C14-C20) und sehr langen Fettsäuren (>C20) beteiligt sind (MANNAERTS et al. 1982; SINGH u. POULOS 1988; LAZO et al. 1990; LAGEWEG et al. 1991). Zur Aktivierung werden ATP und Coenzyme A benötigt (MASTERS u. CRANE 1995). Da in Peroxisomen vor allem die Oxidation sehr langer Fettsäuren stattfindet, zeigen Patienten mit Peroxisomenmangel eine erhöhte intrazelluläre Anhäufung von sehr langen Fettsäuren (MASTERS u. CRANE 1995).
Im Folgenden werden die wichtigsten Unterschiede zwischen peroxisomaler und mitochondrialer ß-Oxidation in tabellarischer Form aufgezeigt:
Tabelle 2-1 Unterschiede peroxisomaler und mitochondrialer β-Oxidation
(MANNAERTS et al. 1979; MASTERS u.
CRANE 1995)
membranständiges Transportsystem, Carnithin unabhängig
Carnithin abhängig
Energieweiterverarbeitung (LAZAROW u.
DE DUVE 1976; MANNAERTS et al.
1979)
Abgabe von Wärme
Verknüpfung mit oxidativer
Phosphorylierung/Elektronentransportkette
Ablauf der ß-Oxidation (LAZAROW 1978) unvollständig,
lediglich Verkürzung von Fettsäuren
vollständig
Funktion der ß-Oxidation (LAZAROW 1987; HAYASHI u. MIWA 1989; HAYASHI u. TAKAHATA 1991;
OSMUNDSEN et al. 1991)
Substratbereitstellung für anabole Vorgänge (Cholesterin- u. Gallen-säuresynthese, Phospholipide)
Eliminierung schlecht
verstoffwechselbarer Verbindungen
Bereitstellung von Energie für zelluläre Abläufe
Enzymatische Ausstattung (MASTERS u. CRANE 1995)
3 Enzyme 4 Enzyme
Energiestatus der Zelle
(MASTERS u. CRANE 1995) ATP unabhängig
ATP abhängig
steigt mit sinkendem ATP Gehalt
2.1.2.3 Weitere Funktionen der Peroxisomen
Synthese der Plasmalogene
Die Peroxisomen verfügen über eine enzymatische Ausstattung zur Synthese von Plasmalogenen. Diese werden außer in den Peroxisomen auch im Endoplasmatischen Retikulum hergestellt (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992). Im menschlichen Organismus bilden die Plasmalogene 18 % der gesamten Phospholipide (WANDERS u. WATERHAM 2006) und machen mehr als 80 % des Phospholipidgehaltes der weißen Substanz im Gehirn aus (WANDERS 2004a).
Cholesterinsynthese
Außerdem enthalten Peroxisomen Anteile der enzymatischen Ausstattung zur Bildung des Cholesterols (WANDERS u. WATERHAM 2006). Die Menge des in den Peroxisomen produzierten Cholesterols ist jedoch im Vergleich zur Cholesterol-synthese des Endoplasmatischen Retikulums sehr klein. Die physiologische Rolle
der peroxisomalen Cholesterolsynthese ist bis jetzt unklar (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).
Harnsäurestoffwechsel
Das Enzym Uratoxidase oder auch Urikase ist am Purinkatabolismus beteiligt und findet sich in den meisten Säugetierperoxisomen (USUDA et al. 1988). Dort ist es, wie auch die Xanthinoxidase bevorzugt, im Nukleoid lokalisiert. Es gibt jedoch auch Vertebraten, die eine nennenswerte peroxisomale Aktivität dieses Enzyms aufweisen, ohne Nukleoide zu besitzen (MASTERS u. CRANE 1995). Die Xanthinoxidase verstoffwechselt Xanthin zu Harnsäure, während die Uratoxidase die Oxidation von Urat mit Hilfe von molekularem Sauerstoff zu Allantoin katalysiert (MASTERS u. CRANE 1995). Bei einigen Neuweltaffen und dem Menschen fehlt die Uratoxidase in hepatozellulären Peroxisomen, sodass bei diesen Spezies Harnsäure als Endprodukt des Purinkatabolismus ausgeschieden wird (USUDA et al. 1988;
MASTERS u. CRANE 1995). Primaten verfügen dagegen über eine gewisse Leberuratoxidaseaktivität und zeigen daher nur niedrige Harnsäurespiegel (MASTERS u. CRANE 1995).
Die Gicht des Menschen ist eine Erkrankung in Folge des Mangels an Uratoxidase (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; HAYASHI et al. 2000). Es ist das einzige peroxisomale Enzym, das in der veterinärmedizinischen Literatur für den Hund beschrieben ist und befindet sich in den hepatozellulären Peroxisomen im Nukleoid (LAGING et al. 1988). Der Dalmatiner besitzt im Vergleich zum Beagle eine höhere Anzahl und auch größere Peroxisomen. Es handelt sich hier um einen kompensatorischen Mechanismus, um einer erhöhten Harnsäurekonzentration im Blut vorzubeugen. Die Unfähigkeit der Hepatozyten des Dalmatiners, aus Harnsäure mittels der in den Peroxisomen lokalisierten Urikase Allantoin zu synthetisieren, liegt jedoch nicht an dem bei dieser Rasse vorherrschenden Urikasemangel, sondern aufgrund eines Transportdefektes, an einer verminderten Fähigkeit der Hepatozyten, die Harnsäure in die Hepatozyten hineinzutransportieren (GIESECKE et al. 1985;
LAGING et al. 1988).