Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie Arbeitsgruppe Zellbiologie, Leiter: Prof. Dr. J. Seitz
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. E. Weihe des Fachbereiches Medizin der Philipps-Universität Marburg
Ein neues In-Vitro-Modell
zur Untersuchung der
Degradation von Peroxisomen
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt
von
Christian Tobias Mehlhorn
Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie Arbeitsgruppe Zellbiologie, Leiter: Prof. Dr. J. Seitz
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. E. Weihe des Fachbereiches Medizin der Philipps-Universität Marburg
Ein neues In-Vitro-Modell
zur Untersuchung der
Degradation von Peroxisomen
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt
von
Christian Tobias Mehlhorn
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 07.08.2008.
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereiches.
Dekan: Prof. Dr. M Rothmund Referent: PD Dr. G. H. Luers
„Die Furcht des Herrn ist der Anfang der Erkenntnis.“
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis... 1
Abkürzungsverzeichnis: ... 4
1. Einführung... 6
Peroxisomen ... 6
Entstehung, Ultrastruktur und Stoffwechselfunktion... 6
Klinische Bedeutung ... 9
Autophagie / Degradation / Pexophagie... 11
Das Hefemodell... 11
Modelle für höhere Eukaryonten... 14
Das Degradationsmodell der BGL 231-Zelllinie ... 17
Pxmp2: ... 17
GFP (Grün fluoreszierendes Protein) und das Pxmp2-GFP-Fusionsprotein: ... 17
Muristeron-induzierbares Genexpressionssystem:... 18
Ziele der Arbeit ... 20
2. Material und Methoden: ... 21
Geräte: ... 21 Reagenzien: ... 22 Verbrauchsmaterialien: ... 22 Zellen:... 23 BGL 231 ... 23 BGL 69 ... 25 Muristeron ... 25
Inhibitoren der Autophagie: ... 26
3-Methyladenin (3-MA):... 26
N-Ethylmalemide (NEM):... 26
Wortmannin:... 27
Nocodazol: ... 27
Leupeptin:... 28
Induktoren der Autophagie... 28
Rapamycin:... 28
Inhibitoren der 15-Lipoxygenase (15-LOX) ... 29
Esculetin ... 29
Übersicht der verwendeten Inhibitoren und Induktoren ... 30
LysoTracker: ... 31 Antikörper: ... 31 Primärantikörper... 31 Sekundärantikörper ... 32 Medien:... 32 Medium Ham‘s F12 + 10% FCS:... 32
Medium Ham‘s F12 ohne FCS (Färbelösung mit LysoTracker Red) ... 33
Zellkultur ... 33
Trypsinierung: ... 33
Einfrieren von Zellen ... 33
Auftauen / Kultivieren von Zellen ... 34
Mediumwechsel: ... 34
Klonierung von Zellen: ... 34
Färbungen... 35
Vitalfärbung mit LysoTracker Red ... 35
GFP-Färbungen ... 35
Fluoreszenzfärbungen mit DAPI:... 36
Immunfluoreszenzfärbung: ... 36
Digitale Fotographie und Bildbearbeitung:... 38
Standardinduktionsversuch: ... 38
3. Ergebnisse: ... 40
Induktionseffekt auf das Muster der GFP-Verteilung:... 40
Induktionseffekt in Abhängigkeit der Muristeronkonzentration... 47
Induktionseffekt auf verschiedene Zellkompartimente:... 48
Peroxisomen (anti-Pmp70):... 48
Mitochondrien (anti-Hsp70):... 51
Lysosomen ... 52
Zusammenfassung des Standardinduktionsversuches und der beobachteten Effekte auf verschiedene Zellkompartimente ... 58
Versuche mit Autophagieinhibitoren an BGL 231-Zellen ... 59
3-Methyladenin (3-MA) ... 59
Wortmannin... 61
Nocodazol... 62
Leupeptin:... 63
Versuche mit einem Inhibitor der 15-Lipoxygenase... 64
Zusammenfassung der Inhibitionsversuche ... 65
Versuche mit Induktoren der Autophagie an BGL 231-Zellen... 68
Rapamycin:... 68
Tamoxifen: ... 69
Zusammenfassung der Ergebnisse ... 69
Effekte der Inhibitoren der Autophagie auf das lysosomale Kompartiment... 71
3-Methyladenin (3-MA):... 71
N-Ethylmalemide (NEM):... 72
Wortmannin:... 74
Nocodazol: ... 74
Leupeptin:... 75
Zusammenfassung der Effekte auf das lysosomale Kompartiment: ... 77
Versuche mit Inhibitoren der Autophagie an BGL 69-Zellen... 79
4. Kontrollen... 84
Induktion mit Muristeron ... 84
Immunfluoreszenzfärbungen:... 85
Inhibitor- und Induktorversuche: ... 86
5. Zusammenfassung der Ergebnisse ... 88
6. Diskussion ... 91
Peroxisomendegradation in der BGL 231-Zelllinie ... 91
Vergleich mit anderen Modellen... 91
Lokalisation des Pxmp2-GFP-Fusionsproteins ... 94
Beteiligung der Lysosomen an der Pexophagie ... 95
Degradationsmodell der Peroxisomen für höhere Eukaryonten: ... 96
Zusammenfassung... 102
Literaturverzeichnis... 104
Verzeichnis der akademischen Lehrer: ... 112
Danksagung:... 113
Abkürzungsverzeichnis:
µm Mikrometer 3-MA 3-Methyl-Adenin Abb. Abbildung Ag Antigen Ak Antikörper ALD AdrenoleukodystrophieCHO Chinese Hamster Ovary
DEHP Di-(2-ethylexyl)Phthalat
DMSO Dimethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure
E/GRE Ecdyson/Glucocorticoid response Element EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ER Endoplasmatisches Retikulum
Esc. Esculetin
etc. und so weiter
FCS Fötales Kälberserum
GA Glutaraldehyd
GFP Green fluorescent protein
Hsp Hitzeschockprotein Leu. Leupeptin LOX Lipoxygenase MRT Magnetresonanztomographie NEM N-Ethylmalemide Noco. Nocodazol
PBD Peroxisomal biogenesis disorder
PBS Phosphat Buffered Saline
Pmp Peroxisomales Membranprotein
PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor PTS Peroxisomal targeting signal
Rapa. Rapamycin
rER Rauhes endoplasmatisches Retikulum
RxR Retinoid x receptor
sog. sogenannte
Tab. Tabelle
Tamo. Tamoxifen
TOR Target of rapamycin
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
uva. und viele andere
v.a. vor allem
VgEcR Modifizierter Ecdysone-Rezeptor
Wort. Wortmannin
z.B. zum Beispiel
1. Einführung
Peroxisomen
Entstehung, Ultrastruktur und Stoffwechselfunktion
Peroxisomen sind 0,3 bis 1,5 µm große Zellorganellen, die von einer einschichtigen Doppelli-pidmembran umgeben sind. Im elektronenmikroskopischen Bild zeigen sie eine gleichmäßi-ge, feingranuläre Matrix. Peroxisomen kommen nahezu in allen eukaryonten Zellen vor. Beim Menschen ist ihre Konzentration in Leberzellen und Nieren-Tubuluszellen am höchsten. Sie sind sehr zahlreich und gleichförmig im Zytoplasma verteilt und geben der Zelle in Immun-fluoreszenzfärbungen ein punktiertes Muster (siehe Abbildung 1).
Das erste Review über Peroxisomen, damals auch noch „microbodies“ genannt, wurde in den 60er Jahren des letzten Jahrhunderts verfasst (De Duve and Baudhuin 1966) und befasste sich hauptsächlich mit ihrer Bedeutung für den Stoffwechsel. In den letzten zwei Jahrzehnten hat man sich diesen Organellen eher mit der Fragestellung nach ihrer Biogenese, also Entstehung, Abbau, Rolle im Zell-turn-over etc., zugewandt. Besonders mit der Entdeckung von Krank-heiten, die mittels neuerer Erkenntnisse pathologischen Peroxisomenfunktionen zugeschrie-ben werden konnten, ist das Interesse an Peroxisomenforschung auch in der Medizin wieder neu aufgekommen.
Obwohl ihre Entstehung bis heute noch nicht vollständig geklärt ist, scheint das Endoplasma-tische Retikulum als Lieferant der Lipidmembran eine entscheidende Rolle zu spielen
(Titorenko and Rachubinski 1998; Tabak, Murk et al. 2003). Zur Stabilisierung der Membran werden dann spezielle Membranproteine eingebaut, die darüberhinaus auch funktionelle Auf-gaben übernehmen. Es sind schon zahlreiche peroxisomale Membranproteine identifiziert worden, die bei der Entstehung und Funktion der Peroxisomen und ihrer Lipidmembran mit-wirken. Die Gene dieser an der Peroxisomen-Biogenese mitwirkenden Proteine werden PEX-Gene genannt (die Genprodukte Peroxine). Es konnten bis heute mehr als 24 PEX-PEX-Gene ge-funden werden. So scheint z.B. PEX-11 die Proliferation der Peroxisomen anzuregen (Marshall, Krimkevich et al. 1995), PEX-16 und PEX-3 sind u.a. zusammen mit PEX-19 (Sacksteder, Jones et al. 2000) an der Bildung der frühen Peroxisomenformen und der
Mem-bran beteiligt, und PEX-5 (Fransen, Brees et al. 1995) und PEX-7 sind wichtig für den Import von zytoplasmatischen Proteinen in die Peroxisomenmatrix.
Für die Funktion im Stoffwechsel spielen die membranständigen Proteine insofern eine Rolle, als dass sie u.a. für den Transport von Stoffwechselprodukten, aber auch den Import von an freien Ribosomen synthetisierten zytoplasmatischen Proteinen in die Peroxisomenmatrix hin-ein, zuständig sind. Diese eingeschleußten Proteine werden Matrixproteine genannt. Es han-delt sich hauptsächlich um Enzyme, die für die Stoffwechselfunktionen der Peroxisomen wichtig sind. Zu der enzymatischen Ausstattung der Peroxisomen gehören zum einen Enzy-me, die während ihrer katalysierenden Reaktion Radikale wie H2O2 oder O2- bilden. Unter
diesen Enzymen gibt es viele Oxidasen (Acyl-CoA-Oxidase, Amino acid Oxidase, D-Aspartat Oxidase, α-Hydroxyacid Oxidase etc.), aber auch die NO-Synthetase. Die peroxiso-malen Oxidasen tragen somit einen erheblichen Teil zum oxidativen Stress einer Zelle bei (Schrader and Fahimi 2004). Es konnte z.B. gezeigt werden, dass 35% des gesamten H2O2 in
der Leber der Ratte von den Oxidasen der Peroxisomen produziert werden (Boveris, Oshino et al. 1972). Zum anderen besitzen die Peroxisomen aber auch Enzyme wie Peroxidasen, Ka-talase, Dismutasen u.a., die die von den Oxidasen gebildeten Peroxide abbauen und einen Beitrag zur Bewältigung des oxidativen Stresses der Zelle übernehmen. Peroxisomen neutra-lisieren dabei nicht nur die von ihnen selber gebildeten Radikale, sondern sind darüber hinaus ein sehr wichtiges Redoxsystem für jede Art von oxidativem Stress der Zelle.
Insgesamt ist die Funktion der Peroxisomen eng mit dem Stoffwechsel von Fettsäuren ver-knüpft. In ihnen wird vollständig oder teilweise z.B. die β-Oxidation (van den Bosch, Schut-gens et al. 1992) katalysiert, aber auch der Glyoxylat-Stoffwechsel, die Cholesterol-Synthese (Keller, Barton et al. 1985), die Etherlipid-Synthese (van den Bosch, Schutgens et al. 1992), der Purin-Stoffwechsel (Muller and Moller 1969), die α-Oxidation (Wanders, van Grunsven et al. 2000) uva. Insgesamt sind schon mehr als 50 verschiedene Enzyme in Peroxisomen ge-funden worden, die die Peroxisomen zu einem zentralen Organell im Zellstoffwechsel ma-chen.
Alle peroxisomalen Enzyme sind vom Zellkern kodierte Proteine, die an freien Ribosomen synthetisiert werden. Viele dieser Proteine besitzen an ihrem C-terminalem Ende ein speziel-les Signalpeptid (PTS1, peroxisomal targeting signal 1 (Gould, Keller et al. 1989)), welches von PEX-5 erkannt wird und sie zu den Peroxisomen führt (Fransen, Brees et al. 1995). Auch
et al. 2004)), welches allerdings von nur sehr wenigen Proteinen benutzt wird (über PEX-7). An der Peroxisomenmembran interagiert ein PEX-13-14-17-Komplex mit dem Protein und schleußt es mit Hilfe weiterer Peroxine in die Zellorganelle ein. Dort angekommen kann das Enzym seine spezifische Aufgabe übernehmen.
Peroxisomen sind ein sehr dynamisches Zellkompartiment. In nur wenigen Stunden können Zellen massenhaft Peroxisomen bilden, wenn die Stoffwechselanforderungen dies nötig ma-chen, und ebenso werden sie sehr schnell und suffizient abgebaut, wenn sie nicht mehr benö-tigt werden.
Experimentell können die Peroxisomen auf verschiedene Art und Weise dazu angeregt wer-den zu proliferieren. Ein gern genommenes Modell hierfür ist die chemische Induktion der Peroxisomenproliferation. Zu den Substanzen, die zu solch einer Induktion fähig sind, gehö-ren z.B. Medikamente wie Bezafibrate (Fahimi, Reinicke et al. 1982) und Acetylsalicylsäure (Dzhekova-Stojkova, Bogdanska et al. 2001), Chemikalien wie SaH 42-348 (Moody and Reddy 1976), Abkömmlinge der Essig- und Benzoesäure (Reddy and Krishnakantha 1975), der Weichmacher DEHP (Di-(2-ethylhexyl)Phthalat, (Lake, Gangolli et al. 1975)) oder Ste-roide wie Dehydroepiandosteron (Dzhekova-Stojkova, Bogdanska et al. 2001). Die Wirkung dieser Stoffe wird, ähnlich dem Mechanismus der Steroidhormone, über den sogenannten „peroxisome proliferator-activated receptor“ (PPAR) vermittelt (Escher and Wahli 2000). Es hat sich herausgestellt, dass vor allem in Ratten und Mäusen gute Ergebnisse bei Versuchen mit diesen Methoden erzielt werden können.
Für Hefezellen ist ein anderer Weg etabliert. Hier lassen sich die Zellen durch Veränderung des Nahrungsangebotes zur Peroxisomenproliferation bewegen. Wird Hefezellen z.B. Metha-nol oder Fettsäuren als alleinige Kohlenstoffquelle angeboten, so wird die Proliferation von Peroxisomen angeregt, da diese zur Verstoffwechselung des Angebotes benötigt werden (Veenhuis, van Dijken et al. 1978; van der Klei and Veenhuis 1997). Ebenso lässt sich da-durch die Degradation von zuvor da-durch Chemikalien induzierten Peroxisomen verhindern (Luiken, van den Berg et al. 1992).
Abbildung 1: Immunfluoreszenzfärbung von CHO-Zellen mit anti-Pmp70, ein Antikörper gegen das 70 kDalton große peroxisomale Membranprotein (rot) und DAPI-Kernfärbung (blau).
Balken: 10 µm
Klinische Bedeutung
Die medizinisch-klinische Relevanz der Peroxisomenforschung liegt begründet in verschiede-nen Erkrankungen, die mit gestörter Peroxisomenfunktion oder -biogenese einhergehen. Die-se Erkrankungen sind meist angeboren und werden überwiegend autosomal rezessiv vererbt. Das zentrale Nervensystem ist in fast allen Fällen in irgendeiner Weise mitbetroffen. Meist wurden diese recht seltenen Erkrankungen schon vor der Entdeckung der Pathogenese be-schrieben, so dass bis heute noch die ursprünglichen, eher deskriptiven Namen üblich sind.
Man kann diese Krankheiten, je nach den vorherrschenden biomolekularen Ursachen, in zwei verschiedene Gruppen einteilen (Gartner 2000): einmal gibt es die Enzymdefekte, entweder singulär oder multipel, die in verschiedene Störungen der Stoffwechselfunktionen der Peroxi-somen münden, und es gibt die Störungen der peroxisomalen Biogenese, also Entstehung, Lebenszyklus und Abbau (PBD für engl. „peroxisome biogenesis disorder“).
Zu den PBDs gehören hauptsächlich die Krankheiten Zellweger Syndrom, neonatale Adre-noleukodystrophie und infantile Refsum Krankheit.
Zu den Krankheiten, die durch singuläre Enzymdefekte charakterisiert sind, gehören u.a. die adulte Refsum Krankheit (Phytanoyl-CoA Hydroxylase Mangel), Defekte der
Acyl-CoA-dysplasia punctata geht mit multiplen Enzymdefekten einher. Mittlerweile ist fast für jedes peroxisomale Enzym ein entsprechender Defekt beschrieben worden. Hauptsächlicher Pa-thomechanismus ist bei fast allen Störungen die Akkumulation von Stoffwechselvorstufen, die durch den jeweiligen Defekt nicht weiter verarbeitet werden können. Diese lagern sich in verschiedenen Organen an und führen zu Störungen.
Die Symptomatik kann entweder schon bei Neugeborenen auftreten (z.B. Zellweger Syn-drom) oder sich erst mit der vollständigen Entwicklung des ZNS ausprägen (z.B. X-ALD (Depreter, Espeel et al. 2003)), wobei die meisten peroxisomalen Störungen jedoch ihren Sterblichkeitsgipfel in den Kinderjahren haben. Obwohl jede dieser Krankheiten sehr indivi-duelle Leitsymptome und Verläufe hat, gibt es doch viele Gemeinsamkeiten in der Gruppe der peroxisomalen Erkrankungen. Zu den „typischen“ Symptomen gehören z.B. kraniofaziale Dysmorphien, Hypotonie, Epilepsien, Hepatomegalie und Skelettdysmorphien bei Neugebo-renen. Im weiteren Verlauf können ein prolongierter Ikterus, psychomotorische Retardierung und optische/akkustische Störungen hinzukommen. Psychoneurologische Symptome prägen dann das Bild der älteren Patienten (zunehmende intellektuelle Störungen, Verhaltensauffäl-ligkeiten) zusammen mit z.B. Gangunsicherheit und Retinitis. Zu lebensbedrohlichen Kom-plikationen (z.B. Addison-Krisen) kommt es allerdings nur selten. Die Lebenserwartung ist im allgemeinen reduziert, wobei es aber starke individuelle Unterschiede zwischen den Krankheiten und auch zwischen Patienten mit der selben Krankheit gibt (Wanders and Water-ham 2005).
Für die klinische Diagnostik sind Blut- und Urintests entscheidend, um mögliche anfallende Stoffwechselprodukte, die bei den jeweiligen Enzymdefekten akkumulieren, nachzuweisen. Darüberhinaus können (v.a. bei den PBDs) allerdings auch mikroskopische Untersuchungen von Leberbiopsien (auch Nierenbiopsien sind beschrieben) durchgeführt werden, bei denen fehlende oder gestörte Peroxisomenmuster in den verschiedenen Immunfärbungen auffallen (Depreter, Espeel et al. 2003). Auch pränatale Diagnostik durch Amniozentese ist möglich, und v.a. bei den Leukodystrophien kann mittels MRT gute bildgebende Diagnostik betrieben werden (Cheon, Kim et al. 2002).
Kausale Therapien sind noch nicht möglich, aber auch die symptomatische Behandlung ist unbefriedigend. Sie beschränkt sich in erster Linie auf antiepileptische Behandlung und inten-sive Betreuung der meist retardierten Patienten. Medikamentöse Therapieversuche oder Be-handlung durch Stammzell- oder Lebertransplantationen wurden durchgeführt, die Datenlage
ist diesbezüglich aber noch nicht evidenzbasiert, so dass hier für weitere Prognosen wohl noch einige Zeit abgewartet werden muss (Krivit 2004).
Experimentell wird versucht, die Fähigkeit der Peroxisomen zum Abbau aktiver Radikale bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. M. Parkinson oder Multiple Sklerose auszunutzen. Viele dieser Krankheiten gehen mit aseptischen Entzündungsprozessen mit Apoptose und in Folge mit oxidativem Stress einher. So konnte in einem Zellkulturmodell gezeigt werden, dass Hippokampusneurone von Ratten den Stress durch Alzheimer-Fibrillen besser bewältigen können, wenn sie durch Medikamente zur Peroxisomenproliferation ange-regt werden (Santos, Quintanilla et al. 2005). Weitere experimentelle Studien zur möglichen neuroprotektiven Eigenschaft von Peroxisomen sind veröffentlicht worden (so z.B. bei Schlaganfall (Pereira, Hurtado et al. 2005; Pereira, Hurtado et al. 2005; Shimazu, Inoue et al. 2005), bei Schädel-Hirn- (Besson, Chen et al. 2005) und Rückenmarkstrauma (Genovese, Mazzon et al. 2005), bei Amyotrophischer Lateralsklerose (Schutz, Reimann et al. 2005) u.v.a.) und lassen in Zukunft vielleicht sogar an einen Einsatz von entsprechenden Medika-menten zur Behandlung dieser Erkrankungen denken.
Autophagie / Degradation / Pexophagie
Obwohl schon sehr viel über die Bedeutung der Peroxisomen im Stoffwechsel bekannt ist, ist die Biogenese, besonders der Abbau, immer noch nicht vollständig verstanden. Insbesondere fehlt es an Informationen über die Degradation von Peroxisomen in höheren Eukaryonten, da diese Zellen, im Gegensatz zu Hefen, sehr viel weniger von außen beeinflussbar sind, was die Steuerung der Peroxisomenbiogenese betrifft. Aus diesem Grund konnten sich bis jetzt keine allgemein anerkannten Modelle zur Beobachtung der Peroxisomendegradation in höheren Eukaryonten durchsetzen.
Das Hefemodell
Der Abbau der Peroxisomen wird heute weitgehend an Hefezellen erforscht, und die meisten Informationen, die über die Peroxisomendegradation vorliegen, stammen aus solchen Studien. Zur Untersuchung dieser Phänomene wird oft die Methode der Veränderung des
Nahrungsan-oxisomen zur Proliferation angeregt worden sind, wieder in ein vor allem ethanol- und gluco-sehaltiges Medium zurückgebracht, so werden die zuvor gebildeten Peroxisomen abgebaut (Kim and Klionsky 2000). Dieser Degradationsprozess kann somit weitgehend kontrollierbar untersucht werden.
Es hat sich gezeigt, dass Hefezellen zum Abbau der Peroxisomen die Autophagie benutzen, den für alle eukaryonten Zellen gemeinsamen Weg zum Abbau und Recycling von Zellorga-nellen (Kim and Klionsky 2000). Das jeweils abzubauende Zellkompartiment wird auf unter-schiedlichem Weg in die Lysosomen transportiert (in Hefezellen: Vacuole), in denen die dort lokalisierten Enzyme Membranen, Proteine u.a. spalten und so die einzelnen Bausteine (Ami-nosäuren, Lipide etc.) dem Zellstoffwechsel wieder zur Verfügung stellen. Generell kann die Autophagie auf zwei verschiedenen, sich vom Prinzip aber sehr ähnelnden Wegen stattfinden: als Mikroautophagie oder als Makroautophagie (siehe Abbildung 2). Beide Wege haben so-wohl gemeinsame als auch verschiedene Proteine, die an dem jeweiligen Prozess beteiligt sind und münden beide in die gleiche Endstrecke ein. Welcher Weg von beiden eingeschlagen wird hängt von der jeweiligen Zellart ab und von den Konditionen, die zu der Degradation geführt haben.
Zwei weitere Wege, Organellen bzw. zytosolische Proteine in das lysosomale Kompartiment zu schleusen, sind die Chaperone-vermittelte Autophagie und der sogenannte Cvt (cytosol-to-vacuole transport). Beide spielen bei der Betrachtung der Degradation von Peroxisomen aber eine untergeordnete Rolle. Den speziellen Abbau von Peroxisomen nennt man Pexophagie (Mikropexophagie und Makropexophagie).
Sowohl die Makro- als auch die Mikropexophagie beginnt mit dem sogenannten „signaling“. Darunter werden sämtliche Vorgänge subsummiert, die dafür sorgen, dass die Veränderung des Nährmediums oder irgendein anderes Signal für die Peroxisomendegradation in der Zelle „verstanden“ und umgesetzt wird (Meijer and Codogno 2004). Bei der Makropexophagie wird dann das zu recycelnde Peroxisom vom Rest des Zytosols abgesondert (sequestration) und mit einer Doppellipidmembran noch unbekannten Ursprungs umgeben (rER ?). An die-sem Schritt sind Apg-Proteine und verschiedene Phosphatidylinositol 3-Kinasen beteiligt. Die so neu gebildeten Organellen nennt man Autophagosomen. Die äußere Lipidmembran dieses Autophagosoms fusioniert nun mit der Lysosomenmembran (fusion), im Lysosom selbst ver-bleibt das sogenannte Autophagie-Körperchen, welches dann Angriffspunkt von Hydrolasen und anderen lysosomalen Enzymen wird (breakdown). Lysosomen, die zelleigene Organellen phagozytiert haben, nennt man Autolysosomen (Kim and Klionsky 2000).
Die Mikropexophagie wurde bei der Hefe Pichia pastoris entdeckt (Tuttle and Dunn 1995). Hierbei werden die Peroxisomen direkt von den Lysosomen aufgenommen, indem sich die Lysosomenmembran ausstülpt und die Peroxisomen umschließt. Die Ausstülpungen fusionie-ren wieder, nachdem die Peroxisomen vollständig umschlossen sind, so dass die Peroxisomen schließlich intralysosomal zu liegen kommen, umgeben von einer zusätzlichen Membran, die direkt vom Lysosom abstammt. In Pichia pastoris konnten beide Wege, sowohl die Makro-als auch die Mikropexophagie, nachgewiesen werden. Bei einer Umstellung der Kohlenstoff-quelle auf Glucose wurde die Mikro-, bei einer Umstellung auf Ethanol wurde die Makro-pexophagie eingeschlagen.
Makropexophagie
Mikropexophagie
Lysosom Autophagosom Peroxisomen Autophagiekörperchen signaling sequestration early late fusion breakdownAbbildung 2: Schematische Darstellung der zwei für die Peroxisomendegradation wichtigen Autophagiewege in Hefen.
Von den vielen Faktoren, die bei der Autophagie im Allgemeinen und bei der Pexophagie im Speziellen eine Rolle spielen, seien hier zwei genannt, da sie in dieser Arbeit durch Inhibito-ren und InduktoInhibito-ren beeinflusst werden: TOR und die Phosphatidylinositol 3-Kinasen.
TOR („target of rapamycin“) ist ein Protein mit Kinase-Aktivität, welches in vielen verschie-denen Zellzykluswegen eine Schlüsselrolle einnimmt (Schmelzle and Hall 2000). Ist TOR unter für die Zelle guten Wachstumsbedingungen aktiv, so inhibiert es die Autophagie, ist
TOR deaktiviert, wird die Autophagie von unbrauchbarem Zellmaterial angestoßen (Jacinto and Hall 2003). Dies geschieht unter anderem über einen Komplex der Proteine Apg 1 (einer Proteinkinase) und Apg 13 (einem Phosphoprotein). Aktives TOR führt zu einer Phosphory-lierung von Apg 13, was die Verbindung mit Apg 1 stört, wohingegen bei inaktivem TOR die fehlende Phosphorylierung zur Bindung der beiden Proteine führt (Kamada, Funakoshi et al. 2000). Sind Apg 13 und 1 gebunden, werden weitere Enzymkaskaden aktiviert, die u.a. die Autophagie steuern. Wie der Name schon sagt, ist TOR durch Rapamycin beeinflussbar, was in dieser Arbeit experimentell genutzt wird.
Phosphatidylinositol 3-Kinasen sind eine sehr heterogene Gruppe von Enzymen, die in fast allen Autophagieschritten mitwirken. Anfang der 80er Jahre wurde erstmals die Beteiligung dieser Kinasen bei der Bildung von Autophagosomen entdeckt (Seglen and Gordon 1982). Ihre Wirkung entfalten sie durch die Bildung des second messengers Phosphatidylinositol 3, 4, 5-Triphosphat aus dem Membranlipid Phosphatidylinositol 4, 5-Biphosphat, welches Si-gnal für weitere Kinasen ist, die die weitere SiSi-gnaltransduktion dann spezifisch weiterführen (Neufeld 2003). Es gibt eine Reihe von Stoffen, die durch eine Blockade solcher Phosphati-dylinositol 3-Kinasen inhibierend auf die Autophagie wirken, so z.B. das auch in dieser Ar-beit verwendete Wortmannin (Blommaart, Krause et al. 1997).
Modelle für höhere Eukaryonten
Für höhere Eukaryonten gibt es bisher nur wenige Vostellungen darüber, wie der Abbau der Peroxisomen abläuft oder reguliert wird. Dies liegt unter anderem daran, dass es nur sehr we-nige und oft schwierig zu beobachtende Modelle zur Induktion des Degradationsprozesses in höheren Eukaryonten gibt. Viele Versuche diesbezüglich wurden an Hepatozyten von Ratten durchgeführt, wobei man sich den proliferativen Effekt des DEHP (oder anderer Agonisten am „peroxisome proliferator-activated receptor“) zunutze gemacht hat: zuerst ließ man Zellen durch Behandlung mit DEHP massenhaft Peroxisomen bilden, um nach Wegnahme den Ab-bauprozess der zuviel gebildeten Peroxisomen (sog. „excess peroxisomes“) zu untersuchen (Svoboda and Reddy 1972). Eine neuere Studie hat dieses Modell auf transgene Mäuse über-tragen und erstmals mit einem knock-out-Modell versucht, die an der Peroxisomendegradati-on in höheren EukaryPeroxisomendegradati-onten beteiligten Gene zu identifizieren (Iwata, Ezaki et al. 2006). Ebenso konnte ein, ähnlich dem Hefemodell, nahrungsabhängiger Effekt bei CHO-Zellen ge-zeigt werden. CHO-Zellen, die für eine bestimmte Zeit in serumfreiem Medium inkubiert wa-ren, fingen an, ihre Peroxisomen abzubauen (Arai, Ohkuma et al. 2001).
Ein weiterer wichtiger Grund für Zellen, Peroxisomen abzubauen, sind beschädigte und un-brauchbare Peroxisomen. Schafft man es, z.B. durch toxische Stoffe, die Peroxisomen zu schädigen und sie somit in ihrer Funktion derart zu schwächen, dass sie unbrauchbar werden, fangen Zellen an diese zu degradieren (Sepulveda-Saavedra, Bermudez de Rocha et al. 1998).
Trotz dieser Möglichkeiten, die Peroxisomen auch in höheren Eukaryonten zur Degradation zu bewegen, konnte man sich bis jetzt noch nicht auf ein einheitliches Modell der greifenden Mechanismen und beteiligten Faktoren bei diesem Prozess einigen. Yokota et al. konnten zei-gen, dass die Peroxisomen der Rattenleber nach Induktion durch DEHP durch Membranfusi-ons- und umschließungsvorgänge in die Lysosomen transportiert wurden (Yokota, Himeno et al. 1993). Arai et al. zeigte, dass bekannte Inhibitoren der Autophagie, wie z.B.
3-Methyladenine, Bafilomycin, Wortmannin oder Nocodazol, den Degradationsprozess der Peroxisomen auch in CHO-Zellen beeinflussen konnten (Arai, Ohkuma et al. 2001). Iwata et al. gelang es, den Degradationsvorgang von DEHP-induzierten Peroxisomen in transgenen, Atg-7-defizienten knock-out-Mäusen zu untersuchen (Iwata, Ezaki et al. 2006). Atg-7 ist ein bekanntes, für die Autophagie essentielles Gen. Es zeigte sich, dass die Peroxisomen in diesen defizienten Mäusen nicht bzw. nur inkomplett vonstatten geht.
All diese Erkenntnisse legen nahe, dass auch in Säugetierzellen, zumindestens teilweise, We-ge der Autophagie benutz werden, so wie es für die Hefezellen schon länWe-ger bekannt ist.
Ein von der Autophagie völlig unabhängiges, schon früher als Autolyse bezeichnetes Modell, beschrieb Yokota (Yokota, Oda et al. 2001). Seine Theorie basiert auf der Beobachtung, dass in Schnitten von Rattenleber nach besonderer Fixierung und Behandlung mit verschiedenen Puffern die Peroxisomenmembran in höchst unterschiedlichem Maße fragil wurde und auf-brach. Yokota postulierte daraufhin, dass es einen Weg der Peroxisomendegradation gäbe, der durch Ruptur der Membran und eine Art „Auslaufen“ des Inhaltes in das Zellinnere vonstat-ten gehe. Die so freigesetzvonstat-ten peroxisomalen Proteine werden dann zytosolisch degradiert. Diese Theorie wurde unterstützt durch die Entdeckung, dass Inhibitoren des Enzyms 15-Lipoxygenase (15-LOX) diesen Prozess stoppen können. 15-LOX ist ein Enzym, von dem bekannt ist, dass es die Membranen verschiedener Zellorganellen brüchig und durchlässig macht und somit zum Abbau verschiedener Organellen beitragen kann (van Leyen, Duvoisin et al. 1998). Auch wenn Yokota 2001 diese Vermutungen noch sehr vorsichtig äußerte und die Notwendigkeit von weiteren Versuchen, vor allem mit besseren Methoden, einräumte, so ist dies die einzige derzeit ernsthaft diskutierte Alternative zu dem Autophagiemodell. Die Abbildung 3 zeigt eine Übersicht über die heute akzeptierten Degradationsmodelle.
Es ist noch nicht klar, inwieweit die beiden Wege der höheren Eukaryonten (Makropexopha-gie und Autolyse) ineinander verflochten sind, ob sie gleichzeitig in einer Zelle vorkommen können, ob sie sich gegenseitig beeinflussen oder von welchen Faktoren es abhängt, welcher Weg eingeschlagen wird. Vor allem gibt es bezüglich des Autolysemodells erst sehr wenig Daten, die bei einer Beantwortung dieser Fragen helfen könnten.
Ebenso ist wenig bekannt darüber, wie und ob die Pexophagiewege der Hefen mit denen von höheren Eukaryonten vergleichbar sind. Sind die einzelnen Teilschritte identisch, oder welche Wege werden gemeinsam und welche unterschiedlich gegangen, all dies sind Fragen, mit de-nen sich die aktuelle Forschung an peroxisomalen Degradationsprozessen beschäftigt.
Peroxisomendegradation
Autophagie
Autolyse
Makropexophagie
Mikropexophagie
zytosolische Degradation
Lysosom / Vacuole
Peroxisom 15-LOX PeroxisomAbbildung 3: Schematische Darstellung der zur Zeit diskutierten Degradationswege von Peroxisomen in Hefen und höheren Eukaryonten. Für höhere Eukaryonten ist die Makropexophagie und die Autolyse belegt, für Hefe die Mikro- und Makropexophagie.
Das Degradationsmodell der BGL 231-Zelllinie
Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zur Beobachtung der Peroxisomendegradation beruht auf Beobachtungen an der Zelllinie BGL 231. Es handelt sich hierbei um eine transgene CHO-Zelllinie, der ein induzierbares Genexpresionsystem eingeschleußt wurde. Dadurch lässt sich präzise die Expression eines Pxmp2-GFP-Fusionsproteins induzieren, welches einen to-xischen Effekt auf die Peroxisomen zu haben scheint, die daraufhin abgebaut werden. Es han-delt sich somit um ein weiteres Degradatiosmodell für höhere Eukaryonten, welches bisher noch nicht beschrieben wurde.
Pxmp2:
Pxmp2, früher Pmp22 genannt, ist ein vom Pxmp2-Gen kodiertes peroxisomales Membran-protein mit einer Größe von 22 kDalton (Hashimoto, Kuwabara et al. 1986). Es wird an freien Ribosomen synthetisiert (Suzuki, Orii et al. 1987) und posttranslational spezifisch in die Per-oxisomenmebran eingeschleußt (Diestelkotter and Just 1993). Für Ratte und Maus konnte die Länge der cDNA auf 194 Aminosäuren bestimmt werden mit insgesamt vier Transmembran-domänen (Kaldi, Diestelkotter et al. 1993; Bryant and Wilson 1995). Die eigentliche Funktion des Pxmp2 ist noch nicht vollständig geklärt, wobei aber eine Rolle bei der Regulierung der Membranpermeabilität als wahrscheinlich gilt.
GFP (Grün fluoreszierendes Protein) und das Pxmp2-GFP-Fusionsprotein:
Das GFP stammt ursprünglich aus der Qualle Aequorea victoria und wird seit einiger Zeit er-folgreich in der zellbiologischen Forschung als Reportermolekül verwendet (Chalfie, Tu et al. 1994; Marshall, Molloy et al. 1995; Zhuo, Sun et al. 1997). Das GFP hat die Eigenschaft, bei Anregung durch monochromatisches Licht der Wellenlänge λmin=470 nm bis λmax=395 nm
grünes Licht der Wellenlänge λ=509 nm zu emittieren (Cody, Prasher et al. 1993; Reid and Flynn 1997). Dies ermöglicht es, dieses Protein unter Zuhilfenahme eines Fluoreszenzmikro-skops optisch sichtbar zu machen. In der Peroxisomenforschung wird es mit verschiedenen Mitteln in die Peroxisomen eingeschleußt, um dieses Kompartiment spezifisch zu färben. Hierzu wird es entweder an eines der beiden PTS (peroxisomal targeting signal, meist an das
(Wiemer, Wenzel et al. 1997; Schrader 2001; Jedd and Chua 2002), oder das GFP wird mit Hilfe eines anderen peroxisomalen Proteins in die Peroxisomen eingeschleußt (Fransen, Va-stiau et al. 2004; Monastyrska, van der Heide et al. 2005). Da das Protein (zumindestens in basaler Expressionsrate) keinen toxischen Effekt auf die Zelle hat, kann man somit das GFP bei lebenden Zellen in Kultur detektieren, was aufwendige Färbeschritte erspart und Untersu-chungen dynamischer Veränderungen der Peroxisomen ermöglicht.
In dieser Arbeit wurden transgene CHO-Zellen benutzt, die ein Fusionsprotein von Pxmp2 und GFP exprimierten (siehe Abbildung 5). Das Pxmp2-GFP-Fusionsprotein wurde durch die physiologischen Transportmechanismen für das Pxmp2 in die peroxisomale Membran inte-griert. Unter einem Fluoreszenzmikroskop konnten so die Peroxisomen als grüne Punkte sichtbar gemacht werden. In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Expression dieses Fusionsproteins zu morphologischen Veränderungen in den Zellen führte.
Muristeron-induzierbares Genexpressionssystem:
Das Muristeron-induzierbare Genexpresionssystem ist ein System, welches es ermöglicht, die Expression bestimmter Gene selektiv zu induzieren. Im vorliegenden Fall wird die Expres-sionrate des Pxmp2-GFP-Fusionsproteins durch die Dauer der Zugabe und die Konzentration des Hormones Muristeron kontrolliert.
Um dies zu ermöglichen, wurde zunächst das Plasmid pVgRxR in das Genom der Zellen in-tegriert (vgl. Abbildung 6). Dieses Plasmid kodiert für zwei konstitutiv exprimierte Unterein-heiten eines Steroidhormonrezeptors, RxR und VgEcR. Mit Hilfe von ebenfalls auf diesem Plamid kodierenden Antibiotikaresistenzgenen konnten durch experimentelle Selektion sta-bile Zelllinien hergestellt werden, die diese beiden Rezeptoruntereinheiten exprimierten. Danach wurde das Plasmid pGHL259 in das Zellgenom eingeschleußt (vgl. Abbildung 5). Hierbei handelt es sich um die Gensequenz des Pxmp2-GFP-Fusionsproteins unter der Kon-trolle des E/GRE (Ecdysone/Glucocorticoid response element). Auch hier konnte mit Hilfe eines auf dem Plasmid codierten Resistenzgens stabile Zelllinien hergestellt werden.
Wird nun diesen Zellen Muristeron im Kulturmedium angeboten, diffundiert dies als lipophi-les Steroidhormon durch die Zellmembran und bindet beide Rezeptoruntereinheiten (RxR und VgEcR). Dieser so stabilisierte Komplex kann in den Zellkern wandern und spezifisch sein response-element finden und daran binden. Da das E/GRE die Expression des Pxmp2-GFP-Fusionsproteins reguliert, wird nach Bindung und Aktivierung des response-elements die
Transkription der Pxmp2-GFP-mRNA gestartet und die Expression des Fusionsproteins in Gang gesetzt (siehe Abbildung 4).
Da dieses System auf für die CHO-Zellen artfremde Gene aufbaut, bleibt der physiologische Stoffwechsel der Zelle unbeeinflusst. Die Wahrscheinlichkeit, dass das Muristeron als Insek-tenhormon die Expression anderer CHO-Gene induzieren könnte, oder dass die beiden Re-zeptoruntereinheiten durch von den Zellen selber gebildete Faktoren stabilisiert werden und das response-element binden können, ist sehr gering. Somit ist die Expressionsrate des Pxmp2-GFP-Fusionsproteins nahezu alleine abhängig von der Menge und Dauer des zugege-benen Muristerons und kann dadurch präzise kontrolliert werden.
extrazellulär intrazellulär AGTGCATTGTTCT TCACGTAACAAGA GFP Mur.
Pxmp2 Mur. Mur. RxR VgEcR RxR VgEcR Mur. RxR VgEcR Peroxisomen ZellkernAbbildung 4: Schematische Darstellung des Muristeron-induzierbaren Systems: Muristeron verbindet sich in-trazellulär mit dem RxR und VgEcR. Dieser Komplex transloziert in den Zellkern, bindet spezifisch an E/GRE und induziert die Transkription des GFP-Pxmp2-Fusionsproteins.
Mur.: Muristeron
RxR und VgEcR: Untereinheiten des Muristeronrezeptors Grauer Kasten: Promotorkassette (E/GRE)
GFP: green fluorescent protein
Ziele der Arbeit
Das Ziel dieser Arbeit war es, den Degradationsprozess der Peroxisomen in Säugetierzellen, hier am Beispiel von CHO-Zellen (chinese hamster ovary), genauer zu untersuchen.
Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass die Induktion der Expression eines Pxmp2-GFP-Fusionsproteins zu Veränderungen im GFP-Muster der BGL231-Zellen führte. In dieser Ar-beit sollte nun geprüft werden, ob die Veränderungen, die durch Expression des Pxmp2-GFP-Fusionsproteins entstehen, geeignet sind, auch Degradationsprozesse von Peroxisomen zu untersuchen.
Auf der Basis eines Ecdyson-unduzierbaren Genexpressionssystems sollte hierfür eine CHO-Zelllinie etabliert werden, in der die Expressionsstärke des Pxmp2-GFP-Fusionsproteins ge-nau reguliert werden kann.
Die kontrollierte Expression dieses Fusionsproteins sollte dann genutzt werden, um die mor-phologischen Veränderungen des peroxisomalen Kompartimentes zu charakterisieren. Um bestehende alternative Modelle zur Degradation von Peroxisomen zu überprüfen, sollten bekannte Inhibitoren und Induktoren von Degradationsprozessen eingesetzt werden, um die Pxmp2-GFP-induzierten Veränderungen zu manipulieren.
Abschließend sollte ein Modell für die Degradation von Peroxisomen in CHO-Zellen entwik-kelt werden.
2. Material und Methoden:
Wenn nicht anders angegeben beziehen sich die in dieser Arbeit erwähnten Bezeichnungen und Namen für Geräte, Materialien und Reagenzien auf folgende Produkte (urheberrechtlich geschützte Namen sind nicht extra gekennzeichnet):
Geräte:
Werkbank für Zellkultur: Heraeus Instruments, Typ HS12 Nr. 3090 540-0 Mikroskope: Axiovert 135 der Firma Zeiss Germany mit
Fluo-reszenzlampe ebenfalls der Firma Zeiss oder Mo-dell CK40 der Firma Olympus
Immunfluoreszenzmikroskop: Leica Vertrieb GmbH
Digitale Kamera: DXM1200F der Firma Nikon Aufnahmeprogramm: Nikon ACT-1 Version 2.51 Kamera für konv. Fotographie: Contax 167 MT
Dia-Kleinbildfilme: FujiFilm Fujichrome 400 Flachbrett- und Diascanner: EPSON Perfection 1250 Photo
Zentrifuge: Labofuge 400e von Heraeus Instruments Begasungsbrutschrank: HERA cell von Heraeus Instruments Minischüttler: Reax 2000 von Heidolph
Tischzentrifuge: Biofuge pico von Heraeus Instruments
Vakuumpumpe: Vacuum Pump Unit der Firma Vacuubrand GMBH (Wertheim)
Pipetten: von der Firma Eppendorf oder Abimed Wasserbad: Thermomix 1441 der Firma B. Braun
Pipettierhilfe: pipetus-akku der Firma Hirschmann Laborgeräte Magnetrührer: Ikamag RET-GS von Janke & Kunkel GmbH
Waage: Explorer Pro der Firma Ohaus
Stickstofftank: GT 80 der Firma Air Liquide Kryotechnik GmbH, Düsseldorf
Einfrierbox: Qualifreeze Cryo Einfriergerät der Firma Qualilab (Kat. Nr.: 115650)
Reagenzien:
Medium: HAM’S F-12 der Firma PAA Laboratories GmbH (Cat. No. E15-817)
Puffer: Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x mit / ohne Calcium und Magnesium der Firma PAA Laboratories GmbH (Cat. No. H15-001 bzw. H15-002)
Dimethyl Sulphoxide (DMSO): DMSO Hybri-Max der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Roti-Block: 10x Konzentrat der Firma Carl Roth GmbH + Co Karlsruhe
Antibiotikum / Antimykotikum: Antibiotic / Antimycotic solution (100x) von PAA Laboratories GmbH (Cat. No. P11-002)
HEPES Puffer: HEPES Buffer Solution von PAA Laboratories GmbH (Cat. No. S11-001)
Bikarbonat: Sodium Bicarbonate 7,5% von Biochrom AG (Berlin)
FCS: Foetal Calf Serum von PAA Laboratories GmbH
(Cat. No. A15-043)
Trypsin: Trypsin/EDTA (1x) der Firma PAA Laboratories GmbH (Cat. No. L11-004)
Tween: Tween 20 der Firma Roth (Art. 9127.1)
Triton: Triton X-114 (Octylphenol-poly-ethylenglycol-ether) der Firma Feinbiochemica
DAPI: von der Firma GIBCO BRL
Verbrauchsmaterialien:
Tubes zum Einfrieren der Zellen: Nunc CryoTubeTM Vials der Firma Nalge Nunc International
Kulturflaschen: je nach Verfügbarkeit NunclonTM Surface der Fir-ma Nalge Nunc International oder Gewebekultur-flaschen der Firma Greiner Labortechnik, 25 cm² oder 75 cm²
24-well Platten für Induktionsversuche und Färbungen: Tissue Culture Plate MultiwellTM 24 well der Firma Becton Duckinson Labware Pipetten: 5 ml, 10 ml, 25 ml und 50 ml Pipetten der Firma
Nalge Nunc International Pipettenspitzen: von der Firma Greiner bio-one Sterilfilter: von Schleicher und Schuell
Objektträger: 76 x 26 mm Objektträger der Firma Menzel-Gläser Glasplättchen / Deckgläser: von der Firma Menzel-Gläser
Tubes / Cups: zum Mischen von Antikörpern o.Ä.: Micro tubes 1,5 ml der Firma Sarstedt (Nümbrecht) oder Cell-star PP-Test tubes der Firma Greiner bio-one Petrischalen (Gewebekultur): Cellstar Petrischalen der Firma Greiner bio-one Pasteur Pipetten: der Firma Hirschmann Laborgeräte
Zellen:
Beide BGL-Zelllinien wurden aus CHO-K1-Zellen hergestellt (ATCC CCL-61).
BGL 231
Aus einer CHO-K1-Zelllinie wurde die Zelllinie BGL 231 erzeugt, indem durch Transfektion die Plasmide pGHL259 und pVgRxR eingefügt wurden. Beide Plasmide enthielten zusätzlich zu den in Abbildung 5 und Abbildung 6 gezeigten Kassetten noch Resistenz-Sequenzen gegen Neomycin bzw. Zeocine zur Selektion stabiler Zelllinien sowie poly-A-Sequenzen, die aber im Folgenden nicht berücksichtigt sind.
pGHL259: Dieses Plasmid enthält die Expressionskassette eines
Pxmp2-GFP-Fusionsproteins unter der Kontrolle eines E/Glukokortikoid-Response-Elements (Abbildung 5). Dieses Response-Element wird von dem Muristeron-RxR-VgEcR-Komplex spezifisch
er-kannt. Durch Bindung des Hormon-Rezeptor-Komplexes an das E/GRE wird die Transkripti-on der Pxmp2-GFP-mRNA initiiert.
E/GRE
Pxmp2
GFP
Abbildung 5: Schematische Darstellung des Plasmids pGHL259. Poly-A-Sequenzen und Expressionskassetten für Antibiotikaresistenzen wurden nicht berücksichtigt.
E/GRE: ecdysone/glucocorticoid response element Pxmp2: peroxisomal membrane protein (22 kD) GFP: green fluorescent protein
pVgRxR: Dieses Plasmid enthält zwei Kassetten zur konstitutiven Expression des Retinoid-X-Rezeptors (RxR) sowie eines modifizierten Ecdysone-Rezeptors (Abbildung 6). Beide Re-zeptorn sind Untereinheiten eines durch Muristeron stabilisierten Rezeptorkomplexes, der in gebundener Form als Transkriptionsfaktor spezifisch das E/GRE aus dem Plasmid pGHL259 erkennt und die Transkription von abhängigen Genen induziert.
RxR
VgEcR
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Plasmids pVgRxR. Poly-A-Sequenzen und Expressionskassetten für Antibiotikaresistenzen wurden nicht berücksichtigt.
RxR: retinoid x receptor
VgEcR: ecdysone receptor (verändert)
Die Herstellung dieser Zelllinie erfolgte mit dem Ecdysone Expression System der Firma In-vitrogen und war nicht Teil dieser Arbeit. Die Eignung von CHO-Zellen für dieses Expressi-onssystem konnte schon in früheren Arbeiten gezeigt werden (Luers, Jess et al. 2000).
BGL 69
Die BGL 69-Zelllinie entstand ebenfalls aus einer CHO-K1-Zelllinie. Sie enthält ein GFP-PTS1-Plasmid, bei dem die kodierende Sequenz des GFP an die des PTS 1 gekoppelt wurde (Abbildung 8). Das nach der Synthese so markierte GFP wird über PEX-5 in die Peroxiso-menmatrix hineingebracht. Im Gegensatz zur Zelllinie BGL-231 besitzen die BGL-69-Zellen kein induzierbares Expressionssystem, d.h. die Expression des GFP-PTS 1-Proteins geschieht mit einer basalen Rate entsprechend den Stoffwechselanforderungen der Zellen ohne steuern-de Einflussmöglichkeiten von außen.
PTS 1
GFP
Abbildung 8: Darstellung des GFP-PTS1-Plasmids. Auch hier sind Expressionskassetten zur Antibiotikaresi-stenz nicht berücksichtigt.
GFP: green fluorescent protein PTS 1: peroxisomal targeting signal 1
Muristeron
Das Muristeron ist ein Steroidhormon und gehört in die Familie der Ecdysteroide. Bei Insek-ten steuert es die Häutungen und zahlreiche Schritte in der Morphogenese. Zusätzlich greift es auch in die Regulation der Eireifung, Embryogenese, Vitallogenese, Ovulation, Spermiogene-se uva. ein. Zusammen mit einem weiteren Hormon (Juvenilhormon) steht es unter der Kon-trolle zentraler hormoneller Schaltkreise und wird in seine aktive Form, dem
20-Hydroxyecdyson, umgewandelt (Koolman et al. 1989). Als solches kann es dann über intra-zelluläre Rezeptoren aus der Steroidrezeptor-Superfamilie die Expressionsrate einzelner Gene beeinflussen (Robinow, Talbot et al. 1993; Talbot, Swyryd et al. 1993; Truman, Talbot et al. 1994). Als wohl wichtigster Effekt sei die Apolysis genannt, worunter die Abstoßung der al-ten Cuticula von den darunterliegenden Epidermiszellen und die Bildung (unter Zusammen-spiel mit dem oben erwähnten Juvenilhormon) einer neuen Cuticula verstanden wird.
Muristeron A ist ein Ecdyson-Analogon mit geringfügigen Veränderungen (Hydroxylierun-gen) des Steroidgerüstes (Abbildung 9) und wird in dem hier verwendeten Expressionssystem als Induktor verwendet.
Abbildung 9: links: Ecdyson; rechts: Muristeron A
Für diese Arbeit wurde Muristerone A der Firma Invitrogen benutzt (Cat. No. H100-01), wel-ches in Ethanol gelöst und bei – 20 °C aufbewahrt wurde.
Inhibitoren der Autophagie:
3-Methyladenin (3-MA):
3-Methyladenin ist schon lange als Inhibitor der Autophagie in eukaryonten Zellen bekannt (Seglen and Gordon 1982). Es inhibiert die Bildung von Autophagosomen durch Blockierung von Phosphatidylinositol 3-Kinasen und greift somit vor allem in einen der frühen Schritte (signaling oder sequestration) der Autophagie ein (Petiot, Ogier-Denis et al. 2000).
Für diese Arbeit wurde 3-Methyladenin (C6H7N5; MW: 149,16) der Firma Fluka Chemie
GmbH (EC No. 2259086) verwendet. 500 mg wurden in 67 ml HAM’S F12 Medium gelöst, um eine 50 mM Lösung zu erhalten, welche bei –20°C aufbewahrt wurde.
N-Ethylmalemide (NEM):
Der Effekt des N-Ethylmalemides (NEM) wird über das sogenannte NSF („NEM-sensitive protein“) vermittelt. Das NSF ist in verschiedene intrazelluläre Transportvorgänge involviert (Woodman 1997), unter anderem inhibiert es ATP-abhängige Membranfusionsvorgänge (Gerst 1999). Es konnte gezeigt werden, dass NEM auch die Autophagie inhibiert, und zwar während der frühen Phase der Sequestration (Munafo and Colombo 2001), wobei weitere
Ef-fekte, z.B. bei der Fusion von Autophagosom und Lysosom, nicht ausgeschlossen werden können.
Für diese Arbeit wurde NEM (MW: 125,1) der Firma CALBIOCHEM (Cat. No. 34115)
ver-wendet. 5 mg wurden in 790 µl H2O gelöst, um eine 50 mM Lösung zu erhalten, welche bei
–20°C aufbewahrt wurde.
Wortmannin:
Wortmannin ist ein Pilz-Metabolit, welches, ähnlich wie 3-Methyladenin, Phosphatidylinosi-tol 3-Kinasen irreversibel inhibiert. In Hepatozyten konnte dieser inhibitorische Effekt gezeigt werden (Blommaart, Krause et al. 1997). Versuche mit P. pastoris dagegen zeigten, dass Wortmannin die Mikropexophagie bei dem Schritt der frühen Sequestration inhibiert, wohin-gegen es keinen Effekt auf die Makroautophagie hat (Sakai, Koller et al. 1998).
Darüberhinaus inhibiert Wortmannin eine ganze Reihe weiterer Stoffwechselschritte, unter anderm z.B. metabolische Effekte des Insulins (Okada, Kawano et al. 1994) und die Kno-chenresorption durch Osteoklasten (Nakamura, Takahashi et al. 1995).
Für diese Arbeit wurde Wortmannin (C23H24O8; MW: 428,4) der Firma CALBIOCHEM (Cat.
No. 681675) verwendet. 1 mg wurden in 23,34 ml DMSO gelöst um eine 100 µM Lösung zu erhalten, welche bei –20°C aufbewahrt wurde.
Nocodazol:
Nocodazol bindet an Tubulin und ruft eine Depolimerisation der Mikrotubuli hervor. Hiervon ist vor allem der Apperat betroffen, was sich in Fuktionsstörungen vieler
Golgi-abhängiger Zellsysteme zeigt (Presley, Cole et al. 1997; Storrie and Yang 1998). Unter ande-rem führt dies zu einer Störung in der Fusion von Autophagosomen und Lysosomen, was den Prozess der Autophagie an dieser Stelle unterbricht (Webb, Ravikumar et al. 2004).
Für diese Arbeit wurde Nocodazol (C14H11N3O3S; MW: 301,3) der Firma CALBIOCHEM
(Cat. No. 487928) verwendet. 10 mg wurden in 1106 µl DMSO gelöst um eine 30 mM Lö-sung zu erhalten, welche bei –20°C aufbewahrt wurde.
Leupeptin:
Leupeptin ist ein Inhibitor von Serin-Proteasen in Lysosomen und bekannt für seinen Effekt auf den letzten Schritt der Autophagie, nämlich auf die Fusion von Autophagosom und Lyso-som. Daraus resultiert eine Akkumulation von Autophagosomen (Aronson, Dennis et al. 1981; Kovacs, Reith et al. 1982), die in ihrer Funktion des Abbaus von Zellmaterial gestört sind.
Für diese Arbeit wurde Leupeptin (C20H38N6O4⋅ ½ H2SO4; Ac-Leu-Leu-Arginal; MW: 475,6)
der Firma CALBIOCHEM (Cat. No. 108975) verwendet. 50 mg wurden in 1 ml H2O gelöst
um eine 100 mM Lösung zu erhalten, welche bei –20°C aufbewahrt wurde.
Induktoren der Autophagie
Rapamycin:
Rapamycin ist der Inhibitor von TOR, dem „target of rapamycin“. TOR ist, wie oben schon erläutert, eines der wichtigsten Schlüsselproteine in der Autophagie-Kaskade. Rapamycin führt zu einer Dephosphorylierung und somit zu einer Inaktivierung von TOR, woraufhin der hemmende Einfluss von TOR auf die Autophagie unterbleibt (Blommaart, Luiken et al. 1995; Raught, Gingras et al. 2001).
Für diese Arbeit wurde Rapamycin (C51H79NO13; MW: 914,2) der Firma CALBIOCHEM
(Cat. No. 553210) verwendet. 100 µ g wurden in 1 ml DMSO gelöst um eine 100 µM Lösung zu erhalten, welche bei –20°C aufbewahrt wurde.
Tamoxifen:
Tamoxifen ist ein Anti-Oestrogen, welches schon seit längerer Zeit in der Behandlung von Mamma-Tumoren eingesetzt wird (Ward 1973). Es inhibiert die Proteinkinase C, indem es das katalytische Zentrum modifiziert (Gundimeda, Chen et al. 1996), und scheint dadurch Autophagie und Apoptosevorgänge anzuregen (Bursch, Hochegger et al. 2000; Bilir, Altinoz et al. 2001).
Für diese Arbeit wurde Tamoxifen Citrate (MW: 563,7) der Firma CALBIOCHEM (Cat. No.
579000) verwendet. 100 mg wurden in 0,89 ml Ethanol gelöst um eine 200 mM Lösung zu erhalten, die bei –20°C aufbewahrt wurde.
Übersicht der Autophagieinhibitoren und -induktoren:
Abbildung 10 zeigt eine Übersicht über die Autophagieprozesse und die zeitlichen Angriffs-punkte der verschiedenen Inhibitoren / Induktoren. Die benutzten Inhibitoren greifen an un-terschiedlichen Stellen des Autophagieprozesses ein, wobei in diesem Schema der Übersicht halber die verwendeten Mediatoren, Angriffspunkte und Zwischenschritte nicht erwähnt wur-den. Das Schema ist angelehnt an das Review von Kirkegaard et al. 2004.
Abbildung 10: Übersicht der verwendeten Inhibitoren und Induktoren der Autophagie, angelehnt an Kirkegaard et al. 2004.
Inhibitoren der 15-Lipoxygenase (15-LOX)
Esculetin
Lipoxy-rocko et al. 2003). Lipoxygenasen sind Enzyme, die für die Oxidation von Membran-Phospholipiden zuständig sind (Schewe, Rapoport et al. 1986; Kuhn, Belkner et al. 1990). Dies ist vor allem bei der Regulation von Entzündungsprozessen wichtig, da die Phospholipi-de als Substrate für die Bildung von Leukotrienen und Lipoxinen dienen. Darüberhinaus wur-de entwur-deckt, dass Lipoxygenasen eng mit Membranen von Zellorganellen assoziiert sind und sie diese permeabilisieren können (van Leyen, Duvoisin et al. 1998), wofür Calcium ein ent-scheidender Bindungspartner zu sein scheint (Watson and Doherty 1994). Schon recht früh wurde angenommen, dass Lipoxygenasen so auch an der Degradation von Organellen betei-ligt sind, so z.B. bei Mitochondrien (Schewe, Halangk et al. 1975). Eine Beteiligung der 15-LOX an der Degradation von Peroxisomen wurde erstmals von Yokota erwähnt (Yokota, Oda et al. 2001). Er setzte erfolgreich Esculetin ein, das eine elektronenmikroskopisch sichtbare Permeabilisierung der peroxisomalen Membran hemmen konnte.
Für diese Arbeit wurde Esculetin (C9H6O4; MW: 178,15) der Firma Sigma-Aldrich (Cat.:
24,657-3) verwendet. 89 mg wurden in 10 ml Ethanol gelöst, der wegen der schlechten Lös-lichkeit des Esculetins erwärmt werden musste. So entstand eine 50 mM Lösung, die bei – 20°C aufbewahrt wurde.
Übersicht der verwendeten Inhibitoren und Induktoren
Eine Übersicht über alle verwendeten Inhibitoren und Induktoren gibt Tabelle 1.
Tabelle 1: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Inhibitoren und Induktoren.
Chemikalie Lösungsmittel Verwendete Endkonzentration
3-Methyladenin (3-MA) Medium 5 mM
N-Ethylmalemide (NEM) H2O 1 µM
Wortmannin DMSO bis 1 µM
Nocodazol DMSO 30 µM
Leupeptin H2O 3 mM
Rapamycin DMSO 1 µM
Tamoxifen Ethanol bis 20 µM
LysoTracker:
Der in den Versuchen verwendete Farbstoff zur Färbung der lysosomalen Kompartimente (LysoTracker red® von MolecularProbes, DND-99) ist eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte schwache Base, die frei permeabel durch Zellmembranen ist. Im neutralen pH-Bereich ist sie partiell protoniert, im sauren pH-pH-Bereich dagegen voll protoniert, was seine hohe Affinität zu sauren Kompartimenten bedingt. Der Mechanismus ist noch nicht genau geklärt. Es wird jedoch angenommen, dass die Protonierung in den Lysosomen zu einer ver-minderten Membranpermeabilität und in Folge zur Anreicherung dieses Farbstoffes in den Lysosomen führt (nach Herstellerangaben).
Antikörper:
Primärantikörper
Zur Darstellung der verschiedenen zellulären Kompartimente wurden neben der Vitalfärbung mit dem lysosomenspezifischen Farbstoff LysoTracker auch Immunfluoreszenz-Techniken mit Antikörpern gegen Markerproteine verschiedener Zellkompartimente eingesetzt. Gegen folgende Proteine gerichtete Antikörper wurden verwendet:
Zur Darstellung von Mitochondrien:
• Hsp70 (70 kD Hitzeschockprotein): Dieses Transportprotein ist an der inneren Mitochon-drienmembran lokalisiert und katalysiert mit Hilfe von Tim44 und Mge1p die Einschleu-sung von Proteinen aus dem Zytosol in das Mitochondrium (Moro, Okamoto et al. 2002). Der hier verwendete Hsp 70-Antikörper wurde bezogen von Affinity bioreagents, Golden, USA.
Zur Darstellung von Lysosomen:
• Cathepsin D: Dieses Glycoprotein ist eine lysosomale Proteinase (Mort, Poole et al. 1981) und ist bei einem pH-Optimum von ca. 4 an der Degradation intrazellulärer und internali-sierter Proteine beteiligt (Hayasaka, Hara et al. 1975; Hultquist, Rodriguez et al. 1989). Der hier verwendete Cathepsin D-Antikörper wurde bezogen von S. Yokota, Yamanashi, Japan.
Zur Darstellung von Peroxisomen:
• Pmp70 (70 kD peroxisomales Membranprotein): Dieses 70 kD große Protein ist ein Hauptbestandteil von peroxisomalen Membranen. Es ist zuständig für die ATP-abhängige Einschleusung von langen und sehr langen Fettsäuren in die Peroxisomen (Imanaka, Aiha-ra et al. 2000; Tanaka, Tanabe et al. 2002).
Der hier verwendete Pmp70-Antikörper wurde bezogen von A. Völkl, Heidelberg, Ger-many.
Sekundärantikörper
Zur Markierung des Pmp70- und des Cathepsin D-Antikörpers wurde ein Cy3-markierter goat-antirabbit-Antikörper und zur Markierung des Hsp70-Antikörpers wurde ein Cy3-markierter goat-antimouse-Antikörper benutzt, beide von der Firma Jackson ImmunoRese-arch (siehe auch Tabelle 2).
Medien:
Für die Kultur von CHO-Zellen und genetisch manipulierten CHO-Zellen (BGL 231, BGL 69) wurde folgendes Medium benutzt:
Medium Ham‘s F12 + 10% FCS:
1 Flasche (500 ml) 1x Hams 9 ml Bicarbonat
5 ml Antibiotikum/Antimycotikum 50 ml FCS
Medium Ham‘s F12 ohne FCS (Färbelösung mit LysoTracker Red) 1 Flasche (500 ml) 1x Hams
5 ml Antibiotikum/Antimycotikum HEPES gepuffert 20 mM
LysoTracker Red DND-99 wurde hierin in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet
Zellkultur
Alle Arbeiten in der Zellkultur wurden unter sterilen Bedingungen an einer Werkbank für Zellkultur der Firma Heareus Instruments (Typ HS12 Nr. 3090 540-0) durchgeführt.
Trypsinierung:
Wurden die Zellen aus den Kulturflaschen für Versuche, zum Splitten oder zum Einfrieren benötigt, wurden sie vom Flaschenboden mittels Trypsin abgelöst. Dazu wurde zuerst das Medium abgegossen und die Zellen mit PBS ohne Ca2+ und Mg2+ gewaschen. Dann wurde soviel Trypsin / EDTA hinzugegeben, dass der Flaschenboden eben gerade benetzt war. So wurde die Flasche wieder für ca. 2 Minuten im Brutschrank inkubiert. Nachdem unter dem Mikroskop kontrolliert wurde, dass auch alle Zellen abgelöst waren, wurde zum Stoppen der Trypsinwirkung ca. 5 ml Medium in die Flasche gegeben. Die Zellsuspension wurde dann in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bis auf 10 ml mit Medium aufgefüllt. Nach Zentrifu-gation bei 600 U/min für 10 Minuten wurde der Überstand abgegossen und das Pellet mit 1 ml Medium suspendiert. Dann standen die Zellen für weitere Versuche zur Verfügung.
Einfrieren von Zellen
Zum Einfrieren der Zellen wurden sie wie oben beschrieben abtrypsiniert, zentrifugiert und in 900 µl Medium resuspendiert. Die ganzen 900 µl wurden in ein spezielles Cryo-Röhrchen überführt und für ca. 4 Stunden in den Kühlschrank gestellt.
legt. Nach 1 – 2 Tage konnten dann die Röhrchen zur langfristigen Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden.
Auftauen / Kultivieren von Zellen
Zum Auftauen der Zellen aus dem Stickstoff wurden die Tubes mit den Zellen in einem leicht angewärmten Wasserbad innerhalb von 10 Minuten erwärmt, so dass das Einfriermedium vollständig aufgetaut war. Danach wurden die ganzen 1,8 ml Medium inklusive Zellen in ein 10 ml Zentrifugenröhrchen, in das schon ca. 5 ml normales angewärmtes Ham’s F12-Medium vorgelegt war, überführt. Der Tube wurde nochmal mittels Medium gespült und in das Zentri-fugenröhrchen überführt. Danach wurde das Röhrchen bis auf 10 ml aufgefüllt und bei 600 U/min ca. 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in 1 ml Medium suspendiert und in eine mit einer entsprechenden Menge Medium gefüllte Kultur-flasche überführt (bei 75 cm² ca. 10 ml).
Die Kulturflasche wurde dann in einen Kulturschrank bei 37 °C und einer Atmosphäre von 5% CO2 gelegt.
Mediumwechsel:
Nach durchschnittlich 2 - 3 Tagen wurde das Medium der Kulturflaschen gewechselt, je nach Wachstum und Bedarf der Zellen. Dazu wurde das Medium abgegossen, die Flasche 2 mal mit PBS gespült und hinterher wieder mit Medium aufgefüllt. Hierzu wurde jeweils ange-wärmtes Medium bzw. Puffer verwendet.
Klonierung von Zellen:
In einer Zellkultur werden ständig Zellen selektioniert, die unter den gegebenen Bedingungen am schnellsten wachsen. Das führt zum Teil zur Selektion von Mutanten. Die BGL 231-Zellen mussten mehrmals subkloniert werden, um in Bezug auf Geschwindigkeit und Stärke homogen induzierbare Zelllinien zu erhalten, damit zeit- und konzentrationsabhängige Induk-tionsversuche aussagekräftig wurden.
Zur Subklonierung wurden die Zellen in 10 ml Gewebekulturschalen in verschiedenen Kon-zentrationen dünn ausgesäht und mit Muristeron (3 µM) induziert. Nach 24 und 48 Stunden
wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop solche Klone ausgesucht und markiert, deren Zellen alle das gleiche Färbemuster zeigten. Diese wurden dann mittels kleiner Stahlzylinder (4 mm lang, Innendurchmesser 4 mm, Außendurchmesser 5mm), die an einem Ende zur besseren Haftung mit autoklaviertem Silikonfett bestrichen worden waren, von der restlichen Kultur separiert, so dass sie sich im Inhalt des Zylinders befanden. In diesem Zylinder konnten die einzelnen Klone dann trypsiniert werden, um anschließend in einzelnen Schritten expandiert zu werden (96-Loch-Platte → 24-Loch-Platte → 25 cm² / 75 cm² Kulturflasche).
Die Passage 2 jedes Klons wurde eingefroren um für weitere Versuche zur Verfügung zu ste-hen.
Färbungen
Vitalfärbung mit LysoTracker Red
Sollten Zellen mit dem Vitalfarbstaoff LysoTracker red gefärbt werden, wurden diese wie oben beschrieben von der Kulturflasche abtrypsiniert, zentrifugiert und nach Resuspendierung auf 24-well-Platten aufgetragen. Dort wurde dann nach Anwachsen der Zellen und Durchfüh-rung des jeweiligen Versuchs folgendes, von den Herstellerangaben leicht modifiziertes Fär-beprotokoll durchgeführt. Die Modifizierungen wurden in Vorversuchen optimiert und bezie-hen sich im Wesentlicbezie-hen auf die Inkubationszeiten oder Anzahl der Waschschritte:
Die Zellen wurden zuerst mit PBS gewaschen, anschließend wurden ca 500 – 1000 µl der Färbelösung (Medium mit 1 µM LysoTracker red) hinzugegeben und für 2 h bei 38°C inku-biert. Nach erneutem Waschen mit PBS konnten die Zellen dann fixiert werden, wobei sich als optimales Fixanz PFA 4% (oder PFA + GA) herausgestellt hatte. Fixiert wurde für ca. 10 Minuten. Dann konnte erneut gewaschen werden (3x in PBS) und die Glasplättchen auf Ob-jektträger überführt werden.
GFP-Färbungen
Für die mikroskopische Untersuchung des GFPs waren neben den oben beschriebenen Wasch- und Fixierungsschritten (mit PBS bzw. PFA 4%) keine weiteren Färbeschritte
not-wendig. Nach der DAPI-Kernfärbung und Überführen der Glasplättchen auf Objektträger konnten die Zellen sofort mittels eines Fluoreszenzmikroskopes untersucht werden.
Fluoreszenzfärbungen mit DAPI:
Der blaufluoreszierende Farbstoff DAPI wurde zur Kernfärbung benutzt. Entweder wurde er nach den Farbeschritten für ca. 5 Minuten auf die Zellen gegeben oder in einer 1:100-Verdünnung zu dem jeweiligen Zweitantikörper gemischt (Endkonzentration: 1 µg/ml). Wie bei allen anderen Färbungen musste dann noch mehrmals mit PBS gewaschen werden, bevor die Zellen auf einen Objektträger gebracht werden konnten.
Immunfluoreszenzfärbung:
Zur Darstellung der verschiedenen Zellkompartimente wurde die Methode der Immunfluores-zenzfärbung angewendet (siehe Abbildung 11). Hierbei macht man sich die Eigenschaft von Antikörpern (Ak) zunutze, spezifisch ein Antigen (Ag) zu erkennen und zu binden. Der Pri-märantikörper ist ein gegen das zu untersuchende Antigen gerichteter Antikörper, der spezi-fisch sein Target erkennt und daran bindet. Der Sekundärantikörper ist ein gegen den Fc-Teil
des Primärantikörper gerichteter Ak, der zusätzlich noch mit einem fluoreszierenden Farbstoff (hier Cy3) markiert ist.
Ag Ag 1. Ak 1. Ak Ag Ag Ag Ag 2. Ak 2. Ak Ag Ag Cy3 Cy3 Cy3 Cy3
A
B
C
D
Abbildung 11: Schematische Darstellung des Prinzips der Immunfluoreszenzfärbungen. Erklärung im Text.
Nach Waschen der Zellen mit PBS wurden diese für ca. 15 Minuten mit PFA 4% fixiert. Da-nach wurde 3x mit einem Waschpuffer (PBS + 0,2% Tween + 0,2% Triton) gewaschen, wo-durch die zellulären Membranen permeabilisiert und somit für Antikörper passierbar wurden. Dann konnte für ca. 1,5 Stunden die Blockreagenz zum Abblocken unspezifischer Antigene hinzugegeben werden. Nach erneutem Waschen wurde der Primärantikörper in jeweiliger Verdünnung in Roti-Block hinzugegeben (Abbildung 11 A) und über Nacht stehen gelassen (Tabelle 2 zeigt alle verwendeten Antikörper im Überblick). In dieser Zeit konnte der Primär-antikörper sein Antigen finden und daran binden (Abbildung 11 B). Nach nochmaligem Wa-schen wurden die Zellen für 1,5 Stunden mit dem Sekundärantikörper inkubiert (Abbildung 11 C). Dieser fand nun spezifisch den Fc-Teil des Primärantikörpers und konnte dort binden
(Abbildung 11 D). Im Anschluss daran wurde die Kernfärbung mit DAPI durchgeführt. Nach weiteren Waschschritten konnten die Glasplättchen dann auf einen Objektträger mit flüssigem Eindeckmittel (100 ml PBS + 50 % Glycerin + 1,5 g Propylgallate) überführt werden.
Tabelle 2: alle verwendeten Antikörper im Überblick
Primärantikörper Target Verdünnung Sekundärantikörper
anti-Pmp70 Peroxisomen 1:100 anti-rabbit-goat-Cy3 anti-Hsp70 Mitochondrien 1:300 anti-mouse-goat-Cy3 anti-Cathepsin D Lysosomen 1:1500 anti-rabbit-goat-Cy3
Digitale Fotographie und Bildbearbeitung:
Bis auf das Foto der Abbildung 7 wurden alle in dieser Arbeit gezeigten Photos an einem Lei-ca Fluoreszenzmikroskop mit Hilfe einer Digitalkamera (DXM1200F der Firma Nikon) foto-graphiert. Die Bilder wurden mit dem Programm Nikon ACT-1 (Version 2.51) aufgenommen und digital archiviert.
Die Bildbearbeitung wurde mit dem Programm Corel© PHOTO-PAINT Version 6.0 vorge-nommen. Neben nachträglicher Kanalkorrektur (Herausrechnen des roten und blauen Kanals bei Grünfluoreszenzen, des grünen und roten Kanals bei Blaufluoreszenzen etc.) und eventu-eller Farbintensitätskorrektur (wenn die Farbintensitäten nicht zur Bildanalyse wichtig waren) wurde hauptsächlich die Funktion der digitalen Bildüberlagerung benutzt. Dies diente in er-ster Linie zur Einfügung der blauen DAPI-Kernfärbung in die grün- bzw. rot-fluoreszierenden Antikörperfärbungen bzw. GFP-Färbungen, oder aber zu morphologischen Analysen bezüg-lich Kolokalisation verschiedener Zellkompartimente.
Dazu wurden die ausgewählten Zellen bzw. Objektausschnitte an identischer Position jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfiltern fotographiert (rot, grün und blau) und getrennt abge-speichert. Je nach gewünschter Farbkombination konnten dann digital mehrere Bilder überla-gert werden (Funktion „aus Datei einfügen“), so dass mehrfarbige Fluoreszenzbilder entstan-den.
Standardinduktionsversuch:
Folgendes Protokoll wurde als Standard zur Behandlung der BGL-Zelllinien benutzt, wobei es je nach Fragestellung leicht modifiziert wurde:
Die Zelllinie BGL 231 wurde nach dem Auftauen in 24 cm²- bzw. 75 cm²-Kulturflaschen ausgesäht und dann ein bis zwei Tage in Standardmedium inkubiert, um dann in
24-well-Platten, bestückt mit passenden Glasplättchen, überführt zu werden. In den 24-well-Platten wurde der eigentliche Induktionsversuch gestartet, indem die Zellen nach ausreichendem Anwachsen auf den Glasplättchen jeweils mit 1 µM Muristeron in Standardmedium für unter-schiedliche Zeitspannen inkubiert wurden.
Nach der gewünschten Inkubationszeit wurden die Zellen fixiert (je nach anschließender Fär-bung) und gefärbt.
3. Ergebnisse:
Vorversuche nach dem Protokoll des Standardinduktionsversuches zeigten, dass sich das GFP-Muster der BGL-231-Zellen nach Induktion des Expressionssystems durch Zugabe von Muristeron veränderte. Es sollte zunächst die Frage geklärt werden, ob diese Veränderung im Zusammenhang mit der verwendeten Muristeronkonzentration und der Länge der Induktion stand und ob diese Veränderungen gleichmäßig und reproduzierbar in Erscheinung traten. Dazu wurde der Standardinduktionsversuch mit verschiedenen Muristeronkonzentrationen gestartet und nach verschiedenen Induktionszeiträumen gestoppt.
Induktionseffekt auf das Muster der GFP-Verteilung:
Die Übersichtsvergrößerungen (siehe Abbildung 12) zeigen den Effekt des Muristerons auf die BGL 231-Zellen. Unbehandelte Zellen zeigten aufgrund ihrer schwachen basalen Tran-skriptionsrate des Fusionsproteins ein in dieser Vergrößerung nur sehr schwaches, kaum er-kennbares punktförmiges Muster. Gab man allerdings das Muristeron hinzu, veränderte sich in Abhängigkeit der Zeit das GFP-Muster. Erst fing die Fluoreszenzintensität an, stärker zu werden, dann veränderte sich das GFP von fein gepunktet über stark gepunktet bis hin zu dif-fus die gesamte Zelle durchziehend.
Abbildung 12: Übersichtsvergrößerung von BGL 231-Zellen nach Inkubation mit 1 µM Muristeron zu ver-schiedenen Zeitpunkten der Induktion. GFP (grün) mit DAPI-Kernfärbung (blau).
Balken: 100 µm
In höheren Vergrößerungen (Abbildung 13) erkannte man deutlicher die morphologischen Veränderungen während der Induktion mit Muristeron. In Abhängigkeit der Inkubationszeit fanden sich bezüglich des GFP-Musters im wesentlichen vier verschiedene Phänotypen: Ein-mal Zellen, die weiterhin wie die unbehandelten Zellen fast keine, wenn überhaupt nur schwache, punktförmige, perinukleäre Grünfärbung zeigten. Dann gab es Zellen, die ein stär-keres, intensiveres punktförmiges Muster zeigten, dann Zellen, deren GFP sehr viel heller und konzentrierter an wenigen Stellen in der Zelle sichtbar war. Als viertes konnte in denjenigen Zellen, die in der Übersicht noch eine diffuse Grünfluoreszenz zeigten, ein fast tubuläres Mu-ster erkannt werden.
0 h 12 h
Abbildung 13: BGL 231-Zellen nach Inkubation mit 1 µM Muristeron zu verschiedenen Zeitpunkten der Induk-tion. GFP (grün) mit DAPI-Kernfärbung (blau).
Balken: 10 µm
Je länger die Inkubationszeit war, desto mehr Zellen zeigten die intensiven, stark gefärbten großen Punkte und desto mehr Zellen zeigten auch das tubuläre Färbungsmuster. Nach 24 Stunden waren (je nach Homogenität des verwendeten Klons) bei den meisten Zellen die hellen, punktförmigen Strukturen zu sehen, wogegen nach 48 Stunden fast alle Zellen die tu-buläre Grünfärbung besaßen.
Aufgrund dieses Zusammenhangs zwischen dem morphologischen Erscheinungsbild der GFP-Fluoreszenz und der Zeitspanne der Induktion konnten vier verschiedene Stadien der Induktion definiert werden:
Stadium 1: Insgesamt schwache Fluoreszenzintensität mit feinen, im ganzen Zytoplasma lo-kalisierten Punkten. Dieses Stadium zeigten unbehandelte Zellen, also nach 0 Stunden Induk-tion (Abbildung 14).
Abbildung 14: Stadium 1-Zellen. BGL 231-Zellen ohne Induktion. GFP (grün) mit DAPI-Kernfärbung (blau). Balken: 10 µm
Stadium 2: Die Fluoreszenzintensität wurde stärker, wobei das punktförmige zytoplasmati-sche Muster weitgehend beibehalten wurde (Abbildung 15). Gelegentlich sah man größere, wie akkumulierte Punkte. Dieses Stadium zeigten die Zellen nach ca. 12 Stunden Induktion.
Abbildung 15: Stadium 2-Zellen. BGL 231-Zellen nach 12 Stunden Induktion mit 1 µM Muristeron. GFP (grün) mit DAPI-Kernfärbung (blau).
Balken: 10 µm
Stadium 3: Die Zellen zeigten wenige, sehr stark fluoreszierende Strukturen (Abbildung 16). Dieses Stadium erreichten sie nach spätestens 24 Stunden Induktion. Je nach Zeitpunkt besa-ßen sie jedoch zusätzlich noch das aus Stadium 2 bekannte Muster mit ein paar kleineren Punkten, oder schon das weiter unten beschriebene Muster aus Stadium 4.
