Zusammenfassung - Hormonell wirksame Pflanzenschutzmittelwirkstoffe

Gesamt-LDH-Gehalt (als indirektes Maß für die Zellzahl), relative Zytotoxizität und Estrongehalt im Zellüberstand untersucht (n = 3).

a im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle: --- keine Veränderung; Zunahme; Abnahme.

b Veränderung im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle; MW: Mittelwert; SA: Standardabweichung.

c 100 µM Azoxystrobin wurde nicht getestet.

d bei 100 µM Kresoxim-methyl

e bei 100 µM Kresoxim-methyl

f 100 µM Captan wurde nicht getestet.

4 Ergebnisse

Alle Wirkstoffe bis auf Captan, Azoxystrobin und Kresoxim-methyl weisen hinsichtlich des Gesamt-LDH-Gehaltes und der Zytotoxizität keine Unterschiede zur Lösungsmittelkontrolle auf. Bei den Strobilurinen verläuft hingegen mindestens ein Vitalitätsparameter biphasisch, auch wenn es sich hierbei – absolut betrachtet – um geringe Veränderungen handelt. Ab 30 µM Captan fällt der Gesamt-LDH-Gehalt ab und nimmt die relative Zytotoxizität zu. Unter dem Einfluss der Anilinopyrimidine und Dicarboximide nimmt der Estrongehalt zu. Die Triazole, Strobilurine und Captan vermindern den Estrongehalt. Methomyl löst keine messba-ren Veränderungen des Estrongehaltes aus.

In Tab. 4-17 wurde von allen zehn untersuchten Pflanzenschutzmittelwirkstoffen auf Grund-lage der zur Verfügung stehenden Rückstandsdaten jeweils der höchste nachgewiesene Rück-standsgehalt in mg/kg Lebensmittel ermittelt. Unter Berücksichtigung der Fruchtsorte wurden von diesen die jeweiligen NESTI-Werte in mg/kg Körpergewicht mithilfe des VELS-Modells des BfR berechnet. Zudem wurde in Anlehnung an die vorliegenden Untersuchungsergeb-nisse jeweils die niedrigste Wirkstoffkonzentration einer Testsubstanz, bei der durchschnitt-lich die ersten Anzeichen einer Veränderung des Estrongehaltes der H295R-Zellen festzustel-len sind (= LOAEL), von µM in mg/kg umgerechnet. Der grobe Vergleich zwischen NESTI-Wert und LOAEL zeigt, dass die effektiven Wirkstoffkonzentrationen um den Faktor 3 (Cyprodinil) bis >1000 (Methomyl) über den jeweiligen NESTI-Werten liegen. Bei Myclobu-tanil sind die Gehalte hingegen fast identisch.

Tab. 4-17. Gegenüberstellung der NESTI- und LOAEL-Werte der zehn getesteten Pflanzenschutzmittelwirkstoffe. – Datenbasis = Rückstandsdaten von Obst- und Gemüseproben 2005-2008 (LAVES). NESTI = National Estimated Short Term Intake (s. auch Kap. 1.1 und Kap. 3.2.4.2). LOAEL = Lowest Observed Adverse Effect Level bezogen auf Veränderungen des Estrongehaltes der H295R-Zellen und auf Grundlage der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse (n = 3). LM = Lebensmittel; KG = Körper-gewicht; * = im Vels-Modell berechnet als „Mandarine“; ** = im VELS-Modell berechnet als „übrige

Tebuconazol 0,32 rote Johannisbeere 0,003 0,92

Myclobutanil 1,85 Clementine 0,08* 0,09

Azoxystrobin 1,1 Erdbeere 0,02 4,03

Kresoxim-methyl 0,4 Stachelbeere 0,0025 0,94

Iprodion 14,1 Feldsalat 0,04 33,02

Procymidon 2,36 Blattgemüse 0,04** 2,84

Captan 27,51 rote Johannisbeere 0,26 3,01

Methomyl 0,89 Blattgemüse 0,01 > 16,22

4 Ergebnisse

4.3 Auswahl binärer Wirkstoffkombinationen

Im Anschluss an die Einzelstoffversuche folgten die Kombinationsversuche. Hierbei sollten jeweils zwei Stoffe miteinander kombiniert und hinsichtlich ihrer Gesamtwirkung auf die Estronbiosynthese der H295R-Zellen untersucht werden. Bei zehn Testsubstanzen wären ins-gesamt 45 verschiedene binäre Kombinationen möglich gewesen – eine Anzahl, die bei weitem den möglichen Untersuchungsumfang überstiegen hätte. Es wurden daher zwei Aus-wahlkriterien angewendet, um die Vielzahl der Kombinationsmöglichkeiten effektiv und sinn-voll einzuschränken:

1) Berücksichtigung der Häufigkeit der Rückstandsnachweise einer binären Wirkstoffkombi-nation in den untersuchten Lebensmitteln;

2) Berücksichtigung der spezifischen Wirkpotenz und Wirkungsweise der einzelnen Wirk-stoffe in Anlehnung an die Untersuchungsergebnisse der vorliegenden Arbeit.

zu 1) Häufigkeit der Rückstandsnachweise

Es sollten vorrangig diejenigen Wirkstoffkombinationen getestet werden, die in den einzelnen Lebensmittelproben auch vergleichsweise häufig als Rückstandskombination nachgewiesen werden konnten und die der Verbraucher somit in erhöhtem Maße über den Verzehr eines belasteten Lebensmittels aufnehmen könnte. Für alle 45 denkbaren Wirkstoffpaare wurde daher jeweils die Anzahl der Lebensmittelproben bestimmt, in denen diese als Rückstands-kombination tatsächlich nachgewiesen worden waren. Als Grundlage dienten Untersuchungs-ergebnisse von Obst- und Gemüseproben, die vom LAVES in den Jahren 2005 bis einschließ-lich 2008 auf Pflanzenschutzmittelrückstände untersucht worden waren. Anschließend wurde in Abhängigkeit der Anzahl der Lebensmittelproben eine Rangliste mit den einzelnen Wirk-stoffkombinationen erstellt. Ein Ausschnitt dieser Liste ist in Tab. 4-18 gezeigt (vollständige Rangliste s. Anhang Tab. A 7).

Bis auf Methomyl traten unter den fünfzehn häufigsten binären Wirkstoffkombinationen alle Testsubstanzen mindestens einmal auf. Cyprodinil war mit sieben Kombinationen am häufigsten vertreten. Es handelte sich überwiegend um Kombinationen, die hinsichtlich des Einflusses auf den Estrongehalt der H295R-Zellen aus zwei entgegengesetzt wirkenden Stoffen oder aus Substanzen, die beide den Estrongehalt erhöhen, bestanden.

4 Ergebnisse

Tab. 4-18. Rangliste der fünfzehn am häufigsten nachgewiesenen binären Wirkstoffkombinationen.

– In die Auswahl wurden nur binäre Wirkstoffkombinationen einbezogen, die sich aus jeweils zwei der zehn aus-gewählten Testsubstanzen zusammensetzten. Datenbasis = Untersuchungsergebnisse von Obst- und Gemüse-proben, die in den Jahren 2005 bis einschließlich 2008 auf Pflanzenschutzmittelrückstände untersucht wurden (LAVES). Es wurde bestimmt, in wie vielen Lebensmittelproben die einzelnen Wirkstoffpaare als Rückstands-kombination tatsächlich nachgewiesen worden waren.

Rang Anzahl der

* Kursiv und Fett: Wirkstoffe, die in der vorliegenden Arbeit dosisabhängig den Estrongehalt von H295R-Zellen erhöhen.

Normal: Wirkstoffe, die in der vorliegenden Arbeit dosisabhängig den Estrongehalt von H295R-Zellen ernied- rigen.

zu 2) Berücksichtigung der Wirkpotenz und Wirkungsweise der einzelnen Testsubstanzen Es sollten von den häufigsten binären Kombinationen vorrangig diejenigen Wirkstoffpaare getestet werden, die auch aus toxikologischer Sicht in erhöhtem Maße interessant waren. Bei der endgültigen Auswahl wurden daher auch die Ergebnisse der Einzelstoffversuche berück-sichtigt. Von besonderem Interesse waren hierbei die Wirkpotenz und die Wirkungsweise der einzelnen Testsubstanzen. Letztlich wurden vier binäre Wirkstoffkombinationen ausgewählt:

Kombination 1: Cyprodinil und Azoxystrobin

Beide Stoffe wurden mit Abstand am häufigsten als Rückstandskombination nachgewiesen (208 Mal). Sie verändern als Einzelstoffe den Estrongehalt der H295R-Zellen in entgegen-gesetzter Weise: Cyprodinil erhöht den Estrongehalt, Azoxystrobin erniedrigt ihn. Sehr wahr-scheinlich findet die Einflussnahme der Substanzen an verschiedenen Angriffspunkten

inner-4 Ergebnisse

halb des Biosyntheseweges statt. So beeinflusst Azoxystrobin nachweislich die Funktion von Mitochondrien (PFEIL 2007, S. 1366), wobei bei Cyprodinil eher nicht davon ausgegangen wird. Vielmehr wird bei diesem Wirkstoff eine Wirkungsweise vermutet, die derjenigen des Pyrimidins Fenarimol ähnelt und somit eher Enzyme der Steroidbiosynthese oder steroidale Rezeptoren betrifft (s. Kap. 4.1.3.1 und 4.1.4).

Kombination 2: Cyprodinil und Pyrimethanil

Rückstände dieser Wirkstoffkombination wurden in insgesamt 80 Lebensmittelproben und damit am zweithäufigsten nachgewiesen. Beide Substanzen gehören der Pestizidklasse der Anilinopyrimidine an und erhöhen mit unterschiedlicher Potenz den Estrongehalt der H295R-Zellen.

Kombination 3: Cyprodinil und Procymidon

Beide Stoffe wurden in insgesamt 49 Obst- und Gemüseproben als Rückstandskombination nachgewiesen und stehen damit auf Rang 5. Es wurde ihnen vor den Kombinationen Iprodion und Azoxystrobin sowie Iprodion und Cyprodinil Vorrang gegeben, da Procymidon aus der gleichen Pestizidklasse stammt wie Iprodion, jedoch bei den Einzelstoffversuchen eine höhere Wirkpotenz aufweist (Procymidon: höchster Mittelwert +40 %, s. Abb. 4-21; Iprodion:

höchster Mittelwert +27 %, s. Abb. 4-18). Zudem ist der gemessene Effekt von Iprodion kritisch zu betrachten, da in der Konzentration, bei welcher der Estrongehalt der H295R-Zellen erhöht ist, auch eine Kristallbildung stattfindet (s. Abb. 4-16). Sowohl unter der Behandlung von Procymidon als auch unter derjenigen von Cyprodinil nimmt der zelluläre Estrongehalt zu, wobei die Substanzen unterschiedlichen Pestizidklassen angehören.

Kombination 4: Cyprodinil und Myclobutanil

Rückstände dieser Kombination wurden in 43 Lebensmittelproben nachgewiesen. Beide Stoffe erwiesen sich in den Einzelstoffversuchen als die potentesten Substanzen und wirken entgegengesetzt: Cyprodinil erhöht den Estrongehalt, Myclobutanil hingegen senkt ihn.

4 Ergebnisse

4.4 Einfluss der Zellzahl auf das Wirkungsausmaß der Testsubstanzen

Der Versuchsaufbau zur Untersuchung der Einzelsubstanzen und binären Kombinationen unterschied sich in der Anzahl der ausgesäten Zellen: 35 000 Zellen/Well bei den Einzelstoff-versuchen gegenüber 25 000 Zellen/Well bei den KombinationsEinzelstoff-versuchen. Durch die Reduk-tion der Zellzahl sollte vermieden werden, dass die Estrongehalte der zu untersuchenden Zell-überstände insbesondere bei Kombinationen mit zwei stimulatorisch wirksamen Substanzen außerhalb der Kalibrierkurve lagen (s. auch Kap. 3.2.1.5). Es wurde nun in diesem Zusammenhang überprüft, ob die Zellzahl einen Einfluss auf die Empfindlichkeit der H295R-Zellen gegenüber der hormonellen Wirksamkeit der fünf ausgewählten Testsubstanzen Azoxystrobin, Cyprodinil, Myclobutanil, Procymidon und Pyrimethanil hat (s. Abb. 4-27).

-40

Abb. 4-27. Darstellung der Ergebnisse zur Veränderung des Estrongehaltes in Abhängigkeit der Zellzahl. – Die Versuche wurden mit den Wirkstoffen Cyprodinil (A), Procymidon (B), Pyrimethanil (C), Azoxystrobin (D) und Myclobutanil (E) durchgeführt. Es sind die prozentualen Veränderungen des Estronge-haltes relativ zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 1, Dreifachbestimmung).

4 Ergebnisse

Für diese Versuche wurden parallel auf der gleichen Mikrotiterplatte sowohl 25 000 Zellen als auch 35 000 Zellen/Well ausgesät und mit denjenigen Wirkstoffkonzentrationen behan-delt, die sowohl in den Einzelstoff- als auch in den Kombinationsversuchen eingesetzt wurden. Bei den Testsubstanzen, die den Estrongehalt im Vergleich zur Kontrolle erhöhen, sind in diesem einmaligen Versuch je nach Konzentration und Wirkstoff, Unterschiede in Abhängigkeit der Zellzahl festzustellen. Diese treten insbesondere in der jeweils höchsten Testkonzentration von Cyprodinil (A), Procymidon (B) und Pyrimethanil (C) sowie bei Procymidon auch in der niedrigsten Konzentration auf. Bei den Testsubstanzen Azoxystrobin (D) und Myclobutanil (E) treten die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes bei beiden Zellaussaaten in vergleichbarem Ausmaß auf.

4.5 Ergebnisse der Kombinationsversuche 4.5.1 Cyprodinil und Azoxystrobin

Wie in Tab. 4-19 dargestellt, wurden die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Azoxystrobin in neun verschiedenen Konzentrationsverhältnissen miteinander kombiniert.

Tab. 4-19. Kombinationsquadrat für die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Azoxystrobin. – Von jeder Substanz wurden drei Konzentrationen festgelegt (s. Kap. 3.2.1.4) und miteinander kombiniert, so dass die H295R-Zellen insgesamt mit neun verschiedenen Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin behandelt wurden. Die hier genannten Bezeichnungen (A1 bis C3) werden in den folgenden Abbildungen für die einzelnen Kombinationen ebenfalls verwendet.

0,1 µM 10 µM 30 µM

3 µM A1 B1 C1

10 µM A2 B2 C2

30 µM A3 B3 C3

Cyprodinil-Konzentration

Azoxystrobin-Konzentration

Analog zu den Einzelstoffversuchen wurde auch bei den Kombinationsversuchen sowohl der Gesamt-LDH-Gehalt als auch die relative Zytotoxizität durch den CytoTox-ONE^TM-Assay bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-28 wiedergegeben.

Der Gesamt-LDH-Gehalt schwankt zwischen durchschnittlich 92 und 110 % (A). Er ist jeweils am höchsten, wenn die H295R-Zellen zuvor mit Kombinationen behandelt wurden,

4 Ergebnisse

die 10 µM Azoxystrobin enthielten (Kombinationen A2, B2 und C2). Er ist jeweils am niedrigsten, wenn die Kombinationslösungen 30 µM Azoxystrobin enthielten (Kombinationen A3, B3 und C3). Auch die relative Zytotoxizität ändert sich bei näherer Betrachtung in Abhängigkeit der Azoxystrobin-Konzentration (C): Mit ansteigender Dosis dieses Wirkstoffes erhöhen sich ebenfalls die Zytotoxizitätswerte und erreichen Mittelwerte zwischen 6 und 9 %.

Werden die Verläufe des Gesamt-LDH-Gehaltes und der Zytotoxiziät in einer einzigen Abbildung zusammengefasst, so ist zu erkennen, dass die niedrigsten Gesamt-LDH-Gehalte stets zusammen mit den höchsten Zytotoxizitätswerten gemessen wurden (s. Abb. 4-29). Es handelt sich dabei um die Kombinationen A3, B3 sowie C3 und somit um diejenigen Kombinationen, die jeweils die höchste Azoxystrobin-Konzentration enthielten.

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen.

Darstellung der Zytotoxizität mit unterschiedlichen Skalierungen (B, C). Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 5). K: Lösungsmittelkontrolle. Die Bezeichnungen A1 bis C3 verweisen auf die verschiedenen Konzentrationsverhältnisse der Kombinationen, Bedeutungen s. Tab. 4-19.

4 Ergebnisse

0 50 100 150

0 5 10 15 20

Gesamt-LDH-Gehalt Zytotoxizität

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3

Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin

Gesamt-LDH-Gehalt (% Kontrolle) Zytotoxizität (%) Abb. 4-29. Vergleichende Darstellung der Messergebnisse zum Gesamt-LDH-Gehalt und zur Zytotoxizität nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin. – In dieser Abbildung werden die Messergebnisse aus Abb.

4-28 zusammengefasst. Es sind die Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 5).

In Abb. 4-30 sind die Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung nach Behandlung der H295R-Zellen sowohl mit den Einzelsubstanzen als auch mit den binären Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin vergleichend dargestellt. Cyprodinil erhöht als Einzelstoff den Estrongehalt dosisabhängig um bis zu durchschnittlich 84 %. Azoxystrobin hingegen senkt als Einzelstoff den Estrongehalt um bis zu durchschnittlich 19 %. Bei Kombination der niedrigsten Konzentrationen beider Wirkstoffe ist im Gegensatz zu den Einzelwirkungen eine Abnahme des Estrongehaltes um durchschnittlich 18 % festzustellen (A1). Wird Azoxy-strobin erhöht, fällt der Estrongehalt um bis zu durchschnittlich 26 % ab (A2 und A3).

Bei höheren Cyprodinil-Konzentrationen werden in Kombination mit Azoxystrobin Estrongehalte gemessen, die zwar im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle erhöht sind, die jedoch durchgehend niedrigere Zunahmen aufweisen als bei alleiniger Cyprodinil-Behandlung (B1 – C3). In Kombination B3 heben sich die entgegengesetzten Einzelwir-kungen der beiden Wirkstoffe im Mittel annähernd auf.

4 Ergebnisse

-40 -20 0 20 40 60 80 100 120

Cyprodinil (µM) 0,1 0,1 0,1 10 10 10 30 30 30 Azoxystrobin (µM) 3 10 30 3 10 30 3 10 30

Kombination A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Veränderung des Estrongehaltes (% Kontrolle)

Abb. 4-30. Vergleichende Darstellung der Veränderungen des Estrongehaltes nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Cyprodinil und Azoxystrobin als Einzelsubstanzen sowie in binären Kombinationen. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes relativ zur Lösungsmittelkon-trolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (Einzelsubstanzen: n = 3, Kombinationen:

n = 5).

4.5.2 Cyprodinil und Pyrimethanil

Tab. 4-20 zeigt die neun verschiedenen Konzentrationsverhältnisse, mit denen die H295R-Zellen behandelt wurden.

Tab. 4-20. Kombinationsquadrat für die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Pyrimethanil. – Von jeder Substanz wurden drei Konzentrationen festgelegt (s. Kap. 3.2.1.4) und miteinander kombiniert, so dass die H295R-Zellen insgesamt mit neun verschiedenen Kombinationen aus Cyprodinil und Pyrimethanil behandelt wurden. Die hier genannten Bezeichnungen (A1 bis C3) werden in den folgenden Abbildungen für die einzelnen Kombinationen ebenfalls verwendet.

0,1 µM 10 µM 30 µM

3 µM A1 B1 C1

30 µM A2 B2 C2

100 µM A3 B3 C3

Cyprodinil-Konzentration

Pyrimethanil-Konzentration

4 Ergebnisse

Die Messergebnisse zur Bestimmung des Gesamt-LDH-Gehaltes und der Zytotoxizität geben keine Hinweise auf Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Zellen. Die Zyto-toxizitätswerte liegen durchschnittlich bei 7 % (s. Abb. 4-31).

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3

Abb. 4-31. Gesamt-LDH-Gehalt (A) und Zytotoxizität (B) nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Pyrimethanil. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen.

Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 5). K: Lösungsmittelkontrolle. Die Bezeichnungen A1 bis C3 verweisen auf die verschiedenen Konzentrationsverhältnisse der Kombinationen, Bedeutungen s. Tab. 4-20.

In Abb. 4-32 ist vergleichend dargestellt, welchen Einfluss Cyprodinil und Pyrimethanil als Einzelsubstanzen sowie in binärer Kombination auf die Estronbiosynthese der H295R-Zellen ausüben. Beide Wirkstoffe erhöhen den Estrongehalt: Cyprodinil um bis zu durchschnittlich 84 % und Pyrimethanil um bis zu durchschnnittlich 47 %.

Werden beide Substanzen in ihrer jeweils niedrigsten Konzentration miteinander kombiniert, wird die Estronkonzentration im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle im Durchschnitt nicht verändert (A1). Wird jeweils die Konzentration von Pyrimethanil (A2 und A3) oder Cyprodinil (B1 und C1) erhöht, nimmt der Estrongehalt unter der Kombinationsbehandlung zu. Die Zunahmen sind vergleichbar hoch wie unter Behandlung mit den jeweiligen Einzel-substanzen.

Die prozentualen Estronzunahmen bleiben annähernd konstant, wenn die H295R-Zellen mit einer Kombination aus der höchsten Cyprodinil-Konzentration (30 µM) und mit 30 oder 100 µM Pyrimethanil behandelt werden (C2 und C3). Ein wenig differenzierter sehen die Ergebnisse aus, wenn die mittlere Cyprodinil-Konzentration (10 µM) mit 30 oder 100 µM

4 Ergebnisse

Pyrimethanil kombiniert wird: Die Zunahme des Estrongehaltes ist unter der Kombinations-behandlung im Durchschnitt höher als unter der jeweiligen Behandlung mit den Einzelsub-stanzen (B2 und B3).

Cyprodinil (µM) 0,1 0,1 0,1 10 10 10 30 30 30 -20

0 20 40 60 80 100 120 140

Pyrimethanil (µM) 3 30 100 3 30 100 3 30 100

Kombination A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Veränderung des Estrongehaltes (% Kontrolle)

Abb. 4-32. Vergleichende Darstellung der Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Cyprodinil und Pyrimethanil als Einzelsubstanzen sowie in binären Kombinationen. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes relativ zur Lösungs-mittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (Einzelsubstanzen: n = 3, Kombina-tionen: n = 5).

4.5.3 Cyprodinil und Procymidon

In Tab. 4-21 ist dargestellt, in welchen Konzentrationsverhältnissen Cyprodinil und Procymidon getestet wurden. Die Messwerte zum Gesamt-LDH-Gehalt schwanken zwischen durchschnittlich 92 und 110 % bei zugleich annähernd konstanten Zytotoxizitätswerten um durchschnittlich 7 % (s. Abb. 4-33).

In Abb. 4-34 sind die Wirkungen der Einzelstoffe Cyprodinil und Procymidon sowie ihrer binären Kombinationen auf den Estrongehalt der H295R-Zellen dargestellt. Procymidon erhöht den Estrongehalt als Einzelsubstanz um bis zu durchschnittlich 40 % und ist damit

4 Ergebnisse

etwa halb so potent wie Cyprodinil, das die Estronkonzentration um bis zu durchschnittlich 84 % erhöht.

Tab. 4-21. Kombinationsquadrat für die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Procymidon. – Von jeder Substanz wurden drei Konzentrationen festgelegt (s. Kap. 3.2.1.4) und miteinander kombiniert, so dass die H295R-Zellen insgesamt mit neun verschiedenen Kombinationen aus Cyprodinil und Procymidon behandelt wurden. Die hier genannten Bezeichnungen (A1 bis C3) werden in den folgenden Abbildungen für die einzelnen Kombinationen ebenfalls verwendet.

0,1 µM 10 µM 30 µM

Abb. 4-33. Gesamt-LDH-Gehalt (A) und Zytotoxizität (B) nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Procymidon. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen.

Die Kombination der niedrigsten Konzentrationen beider Testsubstanzen bewirkt im Durch-schnitt keine Veränderung des Estrongehaltes (A1). Wird jeweils die Konzentration von Procymidon (A2 und A3) oder Cyprodinil (B1 und C1) erhöht, ist der Estrongehalt vergleich-bar hoch wie unter Behandlung mit der jeweils potenteren Einzelsubstanz.

Liegt Cyprodinil in mittlerer Konzentration (10 µM) vor, erhöht sich der Estrongehalt in Ab-hängigkeit der zugesetzten Procymidon-Dosis: Es wurden in den Kombinationen B2 und B3

4 Ergebnisse

prozentuale Estronzunahmen gemessen, die im Durchschnitt höher liegen als die entsprechen-den durchschnittlichen Einzelwirkungen. Eine vergleichbare, sukzessive Erhöhung des Estrongehaltes wird durch ansteigende Procymidon-Konzentrationen hingegen nicht ausge-löst, wenn die höchste Cyprodinil-Konzentration (30 µM) bereits vorliegt (C2 und C3).

-20 0 20 40 60 80 100 120 140

Cyprodinil (µM) 0,1 0,1 0,1 10 10 10 30 30 30 Procymidon (µM) 3 10 30 3 10 30 3 10 30

Kombination A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Veränderung des Estrongehaltes (% Kontrolle)

Abb. 4-34. Vergleichende Darstellung der Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Cyprodinil und Procymidon als Einzelsubstanzen sowie in binären Kombinationen. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes relativ zur Lösungs-mittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (Einzelsubstanzen: n = 3, Kombina-tionen: n = 5).

4.5.4 Cyprodinil und Myclobutanil

Beide Wirkstoffe wurden gemäß dem Schema in Tab. 4-22 in neun verschiedenen Konzentrationsverhältnissen miteinander kombiniert. Die Messwerte zum Gesamt-LDH-Gehalt schwanken zwischen durchschnittlich 93 und 107 % bei zugleich annähernd konstanten Zytotoxizitätswerten um durchschnittlich knapp 8 % (s. Abb. 4-35).

In Abb. 4-36 sind die Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung dargestellt. Als Einzelsubstanz reduziert Myclobutanil den Estrongehalt um bis zu durchschnittlich 90 %.

Cyprodinil erhöht hingegen die Hormonkonzentration um bis zu durchschnittlich 84 %.

4 Ergebnisse

Werden beide Substanzen in ihrer jeweils niedrigsten Konzentration miteinander kombiniert, wird im Durchschnitt keine Veränderung des Hormongehaltes bewirkt (A1). Wird Cyprodinil höher dosiert, erhöht sich der Estrongehalt in vergleichbarem Ausmaß wie unter alleiniger Behandlung mit diesem Wirkstoff (B1 und C1). Sobald die Konzentration von Myclobutanil erhöht wird, ist stets ein Abfall des Estrongehaltes festzustellen, und zwar unabhängig davon, in welcher Konzentration Cyprodinil vorliegt. Der Hormongehalt wird dabei in ähnlich starkem Ausmaß gesenkt wie nach alleiniger Behandlung mit Myclobutanil (A2, A3, B2, B3, C2 und C3).

Tab. 4-22. Kombinationsquadrat für die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Myclobutanil. – Von jeder Substanz wurden drei Konzentrationen festgelegt (s. Kap. 3.2.1.4) und miteinander kombiniert, so dass die H295R-Zellen insgesamt mit neun verschiedenen Kombinationen aus Cyprodinil und Myclobutanil behandelt wurden. Die hier genannten Bezeichnungen (A1 bis C3) werden in den folgenden Abbildungen für die einzelnen Kombinationen ebenfalls verwendet.

0,1 µM 10 µM 30 µM

Abb. 4-35. Gesamt-LDH-Gehalt (A) und Zytotoxizität (B) nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Myclobutanil. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen.

4 Ergebnisse

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120

Cyprodinil (µM) 0,1 0,1 0,1 10 10 10 30 30 30 Myclobutanil (µM) 0,01 1 30 0,01 1 30 0,01 1 30

Kombination A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Veränderung des Estrongehaltes (% Kontrolle)

Abb. 4-36. Vergleichende Darstellung der Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Cyprodinil und Myclobutanil als Einzelsubstanzen sowie in binären Kombinationen. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes relativ zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (Einzelsubstanzen: n = 3, Kombinationen: n = 5).

4.5.5 Zusammenfassung: Ergebnisse der Kombinationsversuche

In Tab. 4-23 sind die Ergebnisse der Kombinationsversuche in einer Übersicht zusammenge-fasst. Es wurden insgesamt vier binäre Wirkstoffkombinationen hinsichtlich ihres kombinato-rischen Einflusses auf den Gesamt-LDH-Gehalt, die Zytotoxizität sowie auf den Estrongehalt der H295R-Zellen getestet.

Auffällige Veränderungen des Gesamt-LDH-Gehaltes und der Zytotoxizität wurden nur bei den Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin festgestellt. Diese treten in Abhängig-keit der Azoxystrobin-Konzentration auf. So werden die niedrigsten Gesamt-LDH-Gehalte und zugleich die höchsten Zytotoxizitätswerte gemessen, wenn in den Kombinationen 30 µM Azoxystrobin vorlagen.

Der Estrongehalt verändert sich in den meisten Fällen unter der Kombinationsbehandlung in vergleichbarer Weise wie unter alleiniger Behandlung mit dem jeweils potenteren Wirkstoff.

4 Ergebnisse

In einigen Kombinationen aus Cyprodinil mit Procymidon oder mit Pyrimethanil ist der stimulatorische Gesamteffekt auf die Estronbiosynthese jedoch stärker ausgeprägt, und in allen Kombinationen zwischen Cyprodinil und Azoxystrobin wird der stimulatorische Effekt im Vergleich zur alleinigen Cyprodinil-Wirkung durch Azoxystrobin abgeschwächt. Diese Abschwächung tritt bereits ein, wenn die jeweils niedrigsten Konzentrationen dieser beiden Wirkstoffe miteinander kombiniert werden.

Wird eine effektive Konzentration von Myclobutanil mit einer effektiven Konzentration von Cyprodinil kombiniert, ist in der Gesamtwirkung eine Abnahme des Estrongehaltes in ver-gleichbarem Ausmaß wie unter alleiniger Behandlung mit Myclobutanil zu messen.

Tab. 4-23. Zusammenfassung der Messergebnisse aus den Kombinationsversuchen. – Es wurden insgesamt vier binäre Wirkstoffkombinationen

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