Untersuchungen mittels Estron-ELISAs

Das Testprinzip beruht auf der kompetitiven Bindung von Estron und eines Estron-Tracers (Marker) an spezifische Antikörper, die fest an den Wellboden der ELISA-Platte gebunden sind. Das sich in der Probe befindliche Estron der H295R-Zellen konkurriert dabei mit dem Marker aus einer zugesetzten Enzymkonjugatlösung um die freien Bindungsstellen der Anti-körper. Der Marker ist mit einem Enzym (Meerrettichperoxidase) verbunden, welches das zunächst farblose Substrat Tetramethylbenzidin zu einem blauen Farbstoff oxidiert.

Vor Zugabe der Substratlösung wird das Well mehrmals gewaschen, um sicherzustellen, dass nur Markermoleküle, die an Antikörper gebunden sind, an der Farbumsetzung beteiligt sind.

Durch spektroskopische Bestimmung der Farbstoffkonzentration bei 450 nm können an-schließend Rückschlüsse auf die Höhe des Estrongehaltes in der Probe gemacht werden: Je mehr Antikörper-gebundene Markermoleküle vorhanden sind, desto mehr blauer Farbstoff wird aus dem farblosen Substrat generiert. Je intensiver die Blaufärbung des Reaktions-mediums, desto höher der Extinktionswert. Im Umkehrschluss bedeutet dies wiederum: Je höher der Messwert, desto weniger native Estron-Moleküle der H295R-Zellen sind in der Probe vorhanden. Der von den Zellen gebildete Estrongehalt verhält sich somit umgekehrt proportional zum Extinktionswert.

3 Material und Methoden

27 3.2.2.2 Matrixkalibrierung

In der vorliegenden Arbeit sollte der Estrongehalt im Zellüberstand bestimmt werden, d. h.

bei der Untersuchungsmatrix handelte es sich um Zellmedium. Der anzuwendende Estron-ELISA ist aber nur für die Untersuchung von Serum- und Plasmaproben validiert, was bedeutet, dass die mitgelieferten Estron-Standards in Serum gelöst sind. Es musste daher vor Einsatz der Testmethode überprüft werden, ob sich die Messwerte in Abhängigkeit des Lösungsmittels (Serum oder Zellmedium) in ihrer Höhe wesentlich voneinander unterschei-den.

Hierfür wurde zunächst eine 1 mg/mL-Estron-Stammlösung unter Berücksichtigung des Rein-heitsgrads in DMSO angesetzt. Durch anschließende Verdünnung mit Behandlungsmedium wurden daraus Estronkonzentrationen hergestellt, die den mitgelieferten Standardkonzentra-tionen des Testkits entsprachen (0, 15, 50, 200, 800 und 2 000 pg/mL Estron). Die selbst her-gestellten Estronkonzentrationen und die Estronstandards des Testkits wurden parallel auf derselben ELISA-Platte gemäß Protokoll (s. Kap. 3.2.2.4) behandelt und hinsichtlich ihrer Messwerte miteinander verglichen. In Abb. 3-2 sind die Extinktionswerte dieses Vergleiches dargestellt (0 pg/mL Estron ist bei dieser graphischen Darstellung nicht berücksichtigt).

0 0,5 1 1,5 2

10 100 1000 10000

Estron (pg/mL)

Extinktion (450 nm)

in Serum gelöst in Zellmedium gelöst

Abb. 3-2. Extinktionswerte verschiedener Estronkonzentrationen in Abhängigkeit des Lösungs-mittels. – Die Estronstandards des kommerziell erhältlichen Estron-ELISA-Testkits sind in Serum gelöst. Zum Vergleich wurde mit Estron eine Matrixkalibrierung in Zellmedium durchgeführt (n = 1, Doppelbestimmung, Angabe der Mittelwerte).

3 Material und Methoden

Es zeigte sich, dass sich bei Verwendung von Zellmedium als Lösungsmittel die Messwerte im Vergleich zu Serum als Lösungsmittel parallel in einen höheren Extinktionsbereich ver-schieben. Aufgrund dieses ausgeprägten Unterschieds musste daher für die quantitative Estronbestimmung der Zellüberstände generell eine Matrixkalibrierung in Zellmedium vorge-nommen werden. Nach weiteren Tests, in denen neben den bereits erwähnten Estronkonzen-trationen noch weitere KonzenEstronkonzen-trationen ausgetestet wurden, wurde der Umfang der matrixka-librierten Kalibrierkurve auf folgende Konzentrationen festgesetzt: 50, 100, 200, 800, 2 000, 4 000, 6 000 und 8 000 pg/mL Estron.

Die Estron-Stammlösung wurde aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Am Tag der Probenaus-wertung wurde zur Durchführung der Matrixkalibrierung stets ein neues Aliquot mit Behand-lungsmedium verdünnt. Das Bestimmtheitsmaß R² als Maß für den linearen Zusammenhang zwischen den angesetzten Estronkonzentrationen und den ermittelten Messwerten lag generell über einem Wert von 0,99.

3.2.2.3 Kreuzreaktivität

Auf Grundlage der Versuchsergebnisse zur Matrixkalibrierung konnte bereits ausgeschlossen werden, dass Inhaltsstoffe des Behandlungsmediums mit dem Estron-ELISA kreuzreagieren, d. h. an die Antikörper binden (s. Kap. 3.2.2.2). Darüber hinaus mussten auch die Test- und Kontrollsubstanzen auf Anzeichen einer Kreuzreaktivität mit dem ausgewählten Assay über-prüft werden, denn kreuzreagierende Substanzen hätten sonst eine Verfälschung der Tester-gebnisse zur Folge gehabt.

Es wurden daher alle in Behandlungsmedium gelösten Test- und Kontrollsubstanzen ohne vorherige Inkubation mit den Zellen im Estron-ELISA getestet. Von den Testsubstanzen wur-den zwei Konzentrationen überprüft: die höchste angewandte Testkonzentration und eine 1:10-Verdünnung daraus. Es wurde diese Vorgehensweise gewählt, um eine Fehlinterpreta-tion infolge eines etwaigen High-Dose-Hook-Effektes zu vermeiden. Dieser Effekt beschreibt die falsch-niedrige Bestimmung eines Analyten, der in sehr hoher Konzentration in einer Probe vorliegt, infolge einer Sättigung der Antikörperbindungsstellen.

3 Material und Methoden

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Die Ergebnisse in Tab. 3-3 zeigen, dass die Kreuzreaktivität der Testsubstanzen und der Kontrollsubstanz 8-Br-cAMP-Na in dem angewandten Assay vernachlässigbar ist. So liegt die Kreuzreaktivität von 100 µM Cyprodinil immer noch unter 0,001 %.

Auch die Kontrollsubstanz 4-OH-Androstendion weist eine niedrige Kreuzreaktivität von weniger als 0,3 % auf, auch wenn es ein ähnlich hohes Messsignal auslöst wie 800 pg/mL Estron. Es ist denkbar, dass die beobachtete Kreuzreaktivität durch die strukturelle Ähnlich-keit mit dem Estronmolekül hervorgerufen wird (s. Abb. 3-3). Da es sich bei 4-OH-Andro-stendion allerdings um eine Kontroll- und nicht um eine Testsubstanz handelte und dieser Stoff in den H295R-Zellen eine messbare Erniedrigung des Estrongehaltes von durchschnitt-lich 55 % bewirkt, konnte dieser als Kontrollsubstanz verwendet werden.

Tab. 3-3. Kreuzreaktivität der Test- und Kontrollsubstanzen im Estron-ELISA. – Es wurde über-prüft, ob die Test- und Kontrollsubstanzen unspezifisch an die Antikörper des Estron-ELISAs binden. Hierfür wurden sie auf derselben ELISA-Platte parallel mit verschiedenen matrixkalibrierten Estronkonzentrationen gemäß Protokoll behandelt, und die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen. Auflistung der Extinktionswerte in abfallender Reihenfolge. Fett und kursiv gedruckt = matrixkalibrierte Estronkonzentrationen (n = 1, Doppel-bestimmung, Angabe der Mittelwerte, Zahlenwerte aufgerundet).

Probe Extinktion

(450 nm)

Probe Extinktion

(450 nm) Iprodion, 10 µM 2,22 Pyrimethanil, 100 µM 2,08

0 pg/mL Estron 2,22 Pyrimethanil, 10 µM 2,07

Methomyl, 100 µM 2,20 Iprodion, 100 µM 2,05

8-Br-cAMP-Na, 100 µM 2,20 Mylcobutanil, 10 µM 2,03

Captan, 10 µM 2,18 100 pg/mL Estron 2,03

Methomyl, 10 µM 2,12 Procymidon, 100 µM 2,02

Kresoxim-methyl, 10 µM 2,12 Myclobutanil, 100 µM 2,01 Tebuconazol, 10 µM 2,10 Tebuconazol, 100 µM 1,91 Kresoxim-methyl, 100 µM 2,10 Cyprodinil, 100 µM 1,90 Azoxystrobin, 3 µM 2,10 200 pg/mL Estron 1,88 Cyprodinil, 10 µM 2,10 4-OH-Androstendion, 1 µM 1,47

Captan, 100 µM 2,10 800 pg/mL Estron 1,45

Procymidon, 10 µM 2,09 2000 pg/mL Estron 1,04 Azoxystrobin, 30 µM 2,09

3 Material und Methoden

HO

O O

OH O

A B Abb. 3-3. Vergleichende

Dar-stellung der Molekülstrukturen von Estron (A) und 4-OH-Androstendion (B).

3.2.2.4 Durchführung des Estron-ELISAs

Nach 24-stündiger Behandlungszeit der H295R-Zellen wurden aus jedem Well 70 µL des Zellüberstandes entnommen, in ein 1,5 mL-Reaktionsgefäß überführt und bei -20 °C gelagert.

Am Tag der Probenauswertung wurden matrixkalibrierte Estronkonzentrationen neu ange-setzt. Der Testkit bestehend aus flüssigen Reagenzien und der ELISA-Platte im 96-well-Format wurde ebenso wie die tiefgekühlten Zellüberstände auf Raumtemperatur gebracht. In einem Mischverhältnis von 1:40 wurde eine Waschlösung aus dem mitgelieferten Wasch-lösungskonzentrat und Reinstwasser hergestellt. Die Proben sowie die matrixkalibrierten Estronkonzentrationen wurden zunächst auf eine 96-well-PCR-Platte überführt. Von allen Estronstandards wurde eine Doppelbestimmung vorgenommen. Nachfolgend erfolgte die Durchführung des ELISA-Protokolls nach Herstellerangaben unter Verwendung einer Mehr-kanalpipette:

Überführung von jeweils 50 µL der Estronstandards und Proben auf die ELISA-Platte;

Zugabe von 100 µL Enzymkonjugat pro Well;

Schütteln der Platte für zehn Sekunden;

Einstündige Inkubation der Platte bei Raumtemperatur;

Kräftiges Ausklopfen der Platte auf mehreren Lagen saugfähigen Papiers;

Waschen der Wells mit jeweils 400 µL verdünnter Waschlösung, gefolgt von erneutem, kräftigen Ausklopfen. Beide Schritte wurden dreimal wiederholt;

Zugabe von 150 µL Substratlösung pro Well;

30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur;

3 Material und Methoden

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Zugabe von 50 µL Stopplösung (0,5 M H2SO4) pro Well;

Kurzes Schütteln der Platte;

Sofortige Messung der Extinktion bei 450 nm.

Es wurden die durchschnittlichen Extinktionswerte jedes Sets an Estronstandards und Proben bestimmt, und anhand der Standards wurde die Kalibrierkurve ermittelt. Lag der durchschnitt-liche Extinktionswert einer Probe außerhalb des bestimmbaren Messbereichs, wurde das Ergebnis nicht gewertet. Stattdessen wurde zu einem späteren Zeitpunkt die entsprechende Behandlung in einem neuen Versuch mit den H295R-Zellen wiederholt und die Estronkon-zentration erneut mittels ELISA bestimmt. Die Darstellung der Messergebnisse erfolgte als prozentuale Veränderung des Estrongehaltes im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle.

3.2.3 Untersuchungen mittels CytoTox-ONE^TM Homogeneous Membrane Integrity