Procymidon

-20

Iprodion (µM) Veränderung des Estrongehaltes (% Kontrolle)

Abb. 4-18. Veränderungen des Estronge-haltes nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Iprodion. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 3).

4.2.8 Procymidon

Auch bei Procymidon bilden sich im Verlauf der 24-stündigen Inkubationszeit bei der höchsten Testkonzentration Wirkstoffkristalle aus. Diese sind ebenfalls nach Auflösung der Zellen deutlich unter dem Mikroskop zu erkennen (s. Abb. 4-19).

Abb. 4-19. Kristallbildung nach 24-stündiger Inkubation der H295R-Zellen mit 100 µM Procymidon. – Die Zellen sind lysiert.

Aufnahme bei 10-facher Vergrößerung.

4 Ergebnisse

Die Ergebnisse der LDH-Messungen weisen auf keinen nennenswerten Einfluss von Procymidon auf die Vitalität der H295R-Zellen hin (s. Abb. 4-20). Die Zytotoxizitätswerte liegen über alle Testkonzentrationen hinweg auf einem Niveau von durchschnittlich 5 %.

0,01 0,1 0,3 1 3 10 30 100

Abb. 4-20. Gesamt-LDH-Gehalt (A) und Zytotoxizität (B) nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Procymidon. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen. Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 3).

Wie die Ergebnisse in Abb. 4-21 zeigen, nimmt der Estrongehalt in Abhängigkeit der Wirkstoffdosis um bis zu durchschnittlich 40 % zu. Bei einer Konzentrationserhöhung des Wirkstoffes von 30 auf 100 µM nimmt der Estrongehalt durchschnittlich um 27 % zu.

0.01 1 10 100

Abb. 4-21. Veränderungen des Estronge-haltes nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Procymidon. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 3).

4 Ergebnisse

81 4.2.9 Captan

Bei mikroskopischer Kontrolle der H295R-Zellen nach der 24-stündigen Behandlungszeit zeigen Zellen, deren Medium 10 µM oder höhere Captan-Konzentrationen enthalten, morpho-logische Veränderungen auf. In Abb. 4-22 sind mikroskopische Aufnahmen von H295R-Zellen abgebildet, die mit 3 µM (A), 10 µM (B), 30 µM (C) oder 100 µM (D) Captan behan-delt wurden.

Abb. 4-22. Mikroskopische Aufnahmen von H295R-Zellen, die zuvor 24 Stunden lang mit 3 µM (A), 10 µM (B), 30 µM (C) oder 100 µM Captan (D) behandelt wurden. – Aufnahmen bei 4-facher Vergrößerung.

(A) Normales Erscheinungsbild vitaler H295R-Zellen. (B-D) Mit zunehmender Captan-Konzentration verlieren die H295R-Zellen ihre spindelförmige Morphologie, nehmen stattdessen eine Kugelform ein und lösen infolge-dessen den engen Zellverband auf.

Zellen, die mit 3 µM Captan inkubiert wurden, weisen eine spindelförmige Morphologie auf und bilden durch engen Kontakt zu Nachbarzellen einen einschichtigen Zellrasen aus (A).

Dies entspricht dem normalen Erscheinungsbild vitaler H295R-Zellen und wird in dieser

A B

C D

4 Ergebnisse

Form auch bei mit niedrigeren Captan-Konzentrationen behandelten sowie unbehandelten Zellen beobachtet.

Bei einer Konzentration von 10 µM Captan sind bei einer Vielzahl der Zellen bereits morpho-logische Veränderungen sichtbar. Diese äußern sich durch einen Verlust der spindelförmigen Gestalt hin zu einer Kugelform. Der enge Zell-Zell-Kontakt ist bei den betroffenen Zellen nicht mehr zu erkennen. Stattdessen liegen sie einzeln oder in kleinen Zellansammlungen vor (B). Ab einer Konzentration von 30 µM Captan sind alle Zellen morphologisch verändert und weisen eine Kugelform auf. Ein zusammenhängender Zellrasen ist nicht zu erkennen (C, D).

Die Ergebnisse zum Gesamt-LDH-Gehalt und zur Zytotoxizität zeigen deutliche Verände-rungen in den zwei höchsten Wirkstoffkonzentrationen (s. Abb. 4-23). Der Gesamt-LDH-Gehalt nimmt ab 30 µM Captan deutlich ab und fällt in der höchsten Testkonzentration auf durchschnittlich 27 % ab (A). Parallel dazu steigen die Zytotoxizitätswerte ab 30 µM Captan deutlich an und erreichen bei 100 µM den höchsten Mittelwert mit 74 % (B).

0,01 0,1 0,3 1 3 10 30 100

0 50 100 150

Captan (µM) Gesamt-LDH-Gehalt (% Kontrolle)

0 0,01 0,1 0,3 1 3 10 30 100 0

20 40 60 80 100

Captan (µM)

Zytotoxizität (%)

A B

Abb. 4-23. Gesamt-LDH-Gehalt (A) und Zytotoxizität (B) nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Captan. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen. Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 3).

Unter Berücksichtigung der morphologischen Veränderungen der H295R-Zellen, der auffälligen Abnahme des Gesamt-LDH-Gehaltes sowie der Zytotoxizitätszunahme wurde auf eine quantitative Estronbestimmung der Zellüberstände bei der höchsten Wirkstoffkonzentra-tion verzichtet. In Abb. 4-24 sind daher die Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung

4 Ergebnisse

83

lediglich bis zu einer Konzentration von 30 µM Captan dargestellt. Der Estrongehalt nimmt um bis zu durchschnittlich 66 % ab.

1 10

Abb. 4-24. Veränderungen des Estronge-haltes nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Captan. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 3).

4.2.10 Methomyl

Bei der experimentellen Untersuchung des Wirkstoffes Methomyl wurden weder bei den Messungen zum Gesamt-LDH-Gehalt oder zur Zytotoxiziät noch bei der quantitativen Estron-bestimmung nennenswerte Unterschiede im Vergleich zu den unbehandelten Zellen festgestellt (s. Abb. 4-25 und Abb. 4-26).

0,01 0,1 0,3 1 3 10 30 100

Abb. 4-25. Gesamt-LDH-Gehalt (A) und Zytotoxizität (B) nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Methomyl. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen. Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 3).

4 Ergebnisse

Abb. 4-26. Veränderungen des Estronge-haltes nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Methomyl. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 3).

4.2.11 Zusammenfassung: Ergebnisse der Einzelstoffversuche

In Tab. 4-16 sind die Ergebnisse zu den experimentellen Untersuchungen der einzelnen Pflan-zenschutzmittelwirkstoffe zusammengefasst. Die Testsubstanzen wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf den Gesamt-LDH- und Estrongehalt der H295R-Zellen und ihr zytotoxisches Potenzial untersucht.

Tab. 4-16. Zusammenfassung der Messergebnisse aus den Einzelstoffversuchen. – Die einzelnen Testsubstanzen wurden in der H295R-Zelllinie hinsichtlich ihres Einflusses auf die Messparameter Gesamt-LDH-Gehalt (als indirektes Maß für die Zellzahl), relative Zytotoxizität und Estrongehalt im Zellüberstand untersucht (n = 3).

a im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle: --- keine Veränderung; Zunahme; Abnahme.

b Veränderung im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle; MW: Mittelwert; SA: Standardabweichung.

c 100 µM Azoxystrobin wurde nicht getestet.

d bei 100 µM Kresoxim-methyl

e bei 100 µM Kresoxim-methyl

f 100 µM Captan wurde nicht getestet.

4 Ergebnisse

85

Alle Wirkstoffe bis auf Captan, Azoxystrobin und Kresoxim-methyl weisen hinsichtlich des Gesamt-LDH-Gehaltes und der Zytotoxizität keine Unterschiede zur Lösungsmittelkontrolle auf. Bei den Strobilurinen verläuft hingegen mindestens ein Vitalitätsparameter biphasisch, auch wenn es sich hierbei – absolut betrachtet – um geringe Veränderungen handelt. Ab 30 µM Captan fällt der Gesamt-LDH-Gehalt ab und nimmt die relative Zytotoxizität zu. Unter dem Einfluss der Anilinopyrimidine und Dicarboximide nimmt der Estrongehalt zu. Die Triazole, Strobilurine und Captan vermindern den Estrongehalt. Methomyl löst keine messba-ren Veränderungen des Estrongehaltes aus.

In Tab. 4-17 wurde von allen zehn untersuchten Pflanzenschutzmittelwirkstoffen auf Grund-lage der zur Verfügung stehenden Rückstandsdaten jeweils der höchste nachgewiesene Rück-standsgehalt in mg/kg Lebensmittel ermittelt. Unter Berücksichtigung der Fruchtsorte wurden von diesen die jeweiligen NESTI-Werte in mg/kg Körpergewicht mithilfe des VELS-Modells des BfR berechnet. Zudem wurde in Anlehnung an die vorliegenden Untersuchungsergeb-nisse jeweils die niedrigste Wirkstoffkonzentration einer Testsubstanz, bei der durchschnitt-lich die ersten Anzeichen einer Veränderung des Estrongehaltes der H295R-Zellen festzustel-len sind (= LOAEL), von µM in mg/kg umgerechnet. Der grobe Vergleich zwischen NESTI-Wert und LOAEL zeigt, dass die effektiven Wirkstoffkonzentrationen um den Faktor 3 (Cyprodinil) bis >1000 (Methomyl) über den jeweiligen NESTI-Werten liegen. Bei Myclobu-tanil sind die Gehalte hingegen fast identisch.

Tab. 4-17. Gegenüberstellung der NESTI- und LOAEL-Werte der zehn getesteten Pflanzenschutzmittelwirkstoffe. – Datenbasis = Rückstandsdaten von Obst- und Gemüseproben 2005-2008 (LAVES). NESTI = National Estimated Short Term Intake (s. auch Kap. 1.1 und Kap. 3.2.4.2). LOAEL = Lowest Observed Adverse Effect Level bezogen auf Veränderungen des Estrongehaltes der H295R-Zellen und auf Grundlage der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse (n = 3). LM = Lebensmittel; KG = Körper-gewicht; * = im Vels-Modell berechnet als „Mandarine“; ** = im VELS-Modell berechnet als „übrige

Tebuconazol 0,32 rote Johannisbeere 0,003 0,92

Myclobutanil 1,85 Clementine 0,08* 0,09

Azoxystrobin 1,1 Erdbeere 0,02 4,03

Kresoxim-methyl 0,4 Stachelbeere 0,0025 0,94

Iprodion 14,1 Feldsalat 0,04 33,02

Procymidon 2,36 Blattgemüse 0,04** 2,84

Captan 27,51 rote Johannisbeere 0,26 3,01

Methomyl 0,89 Blattgemüse 0,01 > 16,22

4 Ergebnisse

4.3 Auswahl binärer Wirkstoffkombinationen

Im Anschluss an die Einzelstoffversuche folgten die Kombinationsversuche. Hierbei sollten jeweils zwei Stoffe miteinander kombiniert und hinsichtlich ihrer Gesamtwirkung auf die Estronbiosynthese der H295R-Zellen untersucht werden. Bei zehn Testsubstanzen wären ins-gesamt 45 verschiedene binäre Kombinationen möglich gewesen – eine Anzahl, die bei weitem den möglichen Untersuchungsumfang überstiegen hätte. Es wurden daher zwei Aus-wahlkriterien angewendet, um die Vielzahl der Kombinationsmöglichkeiten effektiv und sinn-voll einzuschränken:

1) Berücksichtigung der Häufigkeit der Rückstandsnachweise einer binären Wirkstoffkombi-nation in den untersuchten Lebensmitteln;

2) Berücksichtigung der spezifischen Wirkpotenz und Wirkungsweise der einzelnen Wirk-stoffe in Anlehnung an die Untersuchungsergebnisse der vorliegenden Arbeit.

zu 1) Häufigkeit der Rückstandsnachweise

Es sollten vorrangig diejenigen Wirkstoffkombinationen getestet werden, die in den einzelnen Lebensmittelproben auch vergleichsweise häufig als Rückstandskombination nachgewiesen werden konnten und die der Verbraucher somit in erhöhtem Maße über den Verzehr eines belasteten Lebensmittels aufnehmen könnte. Für alle 45 denkbaren Wirkstoffpaare wurde daher jeweils die Anzahl der Lebensmittelproben bestimmt, in denen diese als Rückstands-kombination tatsächlich nachgewiesen worden waren. Als Grundlage dienten Untersuchungs-ergebnisse von Obst- und Gemüseproben, die vom LAVES in den Jahren 2005 bis einschließ-lich 2008 auf Pflanzenschutzmittelrückstände untersucht worden waren. Anschließend wurde in Abhängigkeit der Anzahl der Lebensmittelproben eine Rangliste mit den einzelnen Wirk-stoffkombinationen erstellt. Ein Ausschnitt dieser Liste ist in Tab. 4-18 gezeigt (vollständige Rangliste s. Anhang Tab. A 7).

Bis auf Methomyl traten unter den fünfzehn häufigsten binären Wirkstoffkombinationen alle Testsubstanzen mindestens einmal auf. Cyprodinil war mit sieben Kombinationen am häufigsten vertreten. Es handelte sich überwiegend um Kombinationen, die hinsichtlich des Einflusses auf den Estrongehalt der H295R-Zellen aus zwei entgegengesetzt wirkenden Stoffen oder aus Substanzen, die beide den Estrongehalt erhöhen, bestanden.

4 Ergebnisse

87

Tab. 4-18. Rangliste der fünfzehn am häufigsten nachgewiesenen binären Wirkstoffkombinationen.

– In die Auswahl wurden nur binäre Wirkstoffkombinationen einbezogen, die sich aus jeweils zwei der zehn aus-gewählten Testsubstanzen zusammensetzten. Datenbasis = Untersuchungsergebnisse von Obst- und Gemüse-proben, die in den Jahren 2005 bis einschließlich 2008 auf Pflanzenschutzmittelrückstände untersucht wurden (LAVES). Es wurde bestimmt, in wie vielen Lebensmittelproben die einzelnen Wirkstoffpaare als Rückstands-kombination tatsächlich nachgewiesen worden waren.

Rang Anzahl der

* Kursiv und Fett: Wirkstoffe, die in der vorliegenden Arbeit dosisabhängig den Estrongehalt von H295R-Zellen erhöhen.

Normal: Wirkstoffe, die in der vorliegenden Arbeit dosisabhängig den Estrongehalt von H295R-Zellen ernied- rigen.

zu 2) Berücksichtigung der Wirkpotenz und Wirkungsweise der einzelnen Testsubstanzen Es sollten von den häufigsten binären Kombinationen vorrangig diejenigen Wirkstoffpaare getestet werden, die auch aus toxikologischer Sicht in erhöhtem Maße interessant waren. Bei der endgültigen Auswahl wurden daher auch die Ergebnisse der Einzelstoffversuche berück-sichtigt. Von besonderem Interesse waren hierbei die Wirkpotenz und die Wirkungsweise der einzelnen Testsubstanzen. Letztlich wurden vier binäre Wirkstoffkombinationen ausgewählt:

Kombination 1: Cyprodinil und Azoxystrobin

Beide Stoffe wurden mit Abstand am häufigsten als Rückstandskombination nachgewiesen (208 Mal). Sie verändern als Einzelstoffe den Estrongehalt der H295R-Zellen in entgegen-gesetzter Weise: Cyprodinil erhöht den Estrongehalt, Azoxystrobin erniedrigt ihn. Sehr wahr-scheinlich findet die Einflussnahme der Substanzen an verschiedenen Angriffspunkten

inner-4 Ergebnisse

halb des Biosyntheseweges statt. So beeinflusst Azoxystrobin nachweislich die Funktion von Mitochondrien (PFEIL 2007, S. 1366), wobei bei Cyprodinil eher nicht davon ausgegangen wird. Vielmehr wird bei diesem Wirkstoff eine Wirkungsweise vermutet, die derjenigen des Pyrimidins Fenarimol ähnelt und somit eher Enzyme der Steroidbiosynthese oder steroidale Rezeptoren betrifft (s. Kap. 4.1.3.1 und 4.1.4).

Kombination 2: Cyprodinil und Pyrimethanil

Rückstände dieser Wirkstoffkombination wurden in insgesamt 80 Lebensmittelproben und damit am zweithäufigsten nachgewiesen. Beide Substanzen gehören der Pestizidklasse der Anilinopyrimidine an und erhöhen mit unterschiedlicher Potenz den Estrongehalt der H295R-Zellen.

Kombination 3: Cyprodinil und Procymidon

Beide Stoffe wurden in insgesamt 49 Obst- und Gemüseproben als Rückstandskombination nachgewiesen und stehen damit auf Rang 5. Es wurde ihnen vor den Kombinationen Iprodion und Azoxystrobin sowie Iprodion und Cyprodinil Vorrang gegeben, da Procymidon aus der gleichen Pestizidklasse stammt wie Iprodion, jedoch bei den Einzelstoffversuchen eine höhere Wirkpotenz aufweist (Procymidon: höchster Mittelwert +40 %, s. Abb. 4-21; Iprodion:

höchster Mittelwert +27 %, s. Abb. 4-18). Zudem ist der gemessene Effekt von Iprodion kritisch zu betrachten, da in der Konzentration, bei welcher der Estrongehalt der H295R-Zellen erhöht ist, auch eine Kristallbildung stattfindet (s. Abb. 4-16). Sowohl unter der Behandlung von Procymidon als auch unter derjenigen von Cyprodinil nimmt der zelluläre Estrongehalt zu, wobei die Substanzen unterschiedlichen Pestizidklassen angehören.

Kombination 4: Cyprodinil und Myclobutanil

Rückstände dieser Kombination wurden in 43 Lebensmittelproben nachgewiesen. Beide Stoffe erwiesen sich in den Einzelstoffversuchen als die potentesten Substanzen und wirken entgegengesetzt: Cyprodinil erhöht den Estrongehalt, Myclobutanil hingegen senkt ihn.

4 Ergebnisse

89

4.4 Einfluss der Zellzahl auf das Wirkungsausmaß der Testsubstanzen

Der Versuchsaufbau zur Untersuchung der Einzelsubstanzen und binären Kombinationen unterschied sich in der Anzahl der ausgesäten Zellen: 35 000 Zellen/Well bei den Einzelstoff-versuchen gegenüber 25 000 Zellen/Well bei den KombinationsEinzelstoff-versuchen. Durch die Reduk-tion der Zellzahl sollte vermieden werden, dass die Estrongehalte der zu untersuchenden Zell-überstände insbesondere bei Kombinationen mit zwei stimulatorisch wirksamen Substanzen außerhalb der Kalibrierkurve lagen (s. auch Kap. 3.2.1.5). Es wurde nun in diesem Zusammenhang überprüft, ob die Zellzahl einen Einfluss auf die Empfindlichkeit der H295R-Zellen gegenüber der hormonellen Wirksamkeit der fünf ausgewählten Testsubstanzen Azoxystrobin, Cyprodinil, Myclobutanil, Procymidon und Pyrimethanil hat (s. Abb. 4-27).

-40

Abb. 4-27. Darstellung der Ergebnisse zur Veränderung des Estrongehaltes in Abhängigkeit der Zellzahl. – Die Versuche wurden mit den Wirkstoffen Cyprodinil (A), Procymidon (B), Pyrimethanil (C), Azoxystrobin (D) und Myclobutanil (E) durchgeführt. Es sind die prozentualen Veränderungen des Estronge-haltes relativ zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 1, Dreifachbestimmung).

4 Ergebnisse

Für diese Versuche wurden parallel auf der gleichen Mikrotiterplatte sowohl 25 000 Zellen als auch 35 000 Zellen/Well ausgesät und mit denjenigen Wirkstoffkonzentrationen behan-delt, die sowohl in den Einzelstoff- als auch in den Kombinationsversuchen eingesetzt wurden. Bei den Testsubstanzen, die den Estrongehalt im Vergleich zur Kontrolle erhöhen, sind in diesem einmaligen Versuch je nach Konzentration und Wirkstoff, Unterschiede in Abhängigkeit der Zellzahl festzustellen. Diese treten insbesondere in der jeweils höchsten Testkonzentration von Cyprodinil (A), Procymidon (B) und Pyrimethanil (C) sowie bei Procymidon auch in der niedrigsten Konzentration auf. Bei den Testsubstanzen Azoxystrobin (D) und Myclobutanil (E) treten die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes bei beiden Zellaussaaten in vergleichbarem Ausmaß auf.

4.5 Ergebnisse der Kombinationsversuche 4.5.1 Cyprodinil und Azoxystrobin

Wie in Tab. 4-19 dargestellt, wurden die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Azoxystrobin in neun verschiedenen Konzentrationsverhältnissen miteinander kombiniert.

Tab. 4-19. Kombinationsquadrat für die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Azoxystrobin. – Von jeder Substanz wurden drei Konzentrationen festgelegt (s. Kap. 3.2.1.4) und miteinander kombiniert, so dass die H295R-Zellen insgesamt mit neun verschiedenen Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin behandelt wurden. Die hier genannten Bezeichnungen (A1 bis C3) werden in den folgenden Abbildungen für die einzelnen Kombinationen ebenfalls verwendet.

0,1 µM 10 µM 30 µM

3 µM A1 B1 C1

10 µM A2 B2 C2

30 µM A3 B3 C3

Cyprodinil-Konzentration

Azoxystrobin-Konzentration

Analog zu den Einzelstoffversuchen wurde auch bei den Kombinationsversuchen sowohl der Gesamt-LDH-Gehalt als auch die relative Zytotoxizität durch den CytoTox-ONE^TM-Assay bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-28 wiedergegeben.

Der Gesamt-LDH-Gehalt schwankt zwischen durchschnittlich 92 und 110 % (A). Er ist jeweils am höchsten, wenn die H295R-Zellen zuvor mit Kombinationen behandelt wurden,

4 Ergebnisse

91

die 10 µM Azoxystrobin enthielten (Kombinationen A2, B2 und C2). Er ist jeweils am niedrigsten, wenn die Kombinationslösungen 30 µM Azoxystrobin enthielten (Kombinationen A3, B3 und C3). Auch die relative Zytotoxizität ändert sich bei näherer Betrachtung in Abhängigkeit der Azoxystrobin-Konzentration (C): Mit ansteigender Dosis dieses Wirkstoffes erhöhen sich ebenfalls die Zytotoxizitätswerte und erreichen Mittelwerte zwischen 6 und 9 %.

Werden die Verläufe des Gesamt-LDH-Gehaltes und der Zytotoxiziät in einer einzigen Abbildung zusammengefasst, so ist zu erkennen, dass die niedrigsten Gesamt-LDH-Gehalte stets zusammen mit den höchsten Zytotoxizitätswerten gemessen wurden (s. Abb. 4-29). Es handelt sich dabei um die Kombinationen A3, B3 sowie C3 und somit um diejenigen Kombinationen, die jeweils die höchste Azoxystrobin-Konzentration enthielten.

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen.

Darstellung der Zytotoxizität mit unterschiedlichen Skalierungen (B, C). Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 5). K: Lösungsmittelkontrolle. Die Bezeichnungen A1 bis C3 verweisen auf die verschiedenen Konzentrationsverhältnisse der Kombinationen, Bedeutungen s. Tab. 4-19.

4 Ergebnisse

0 50 100 150

0 5 10 15 20

Gesamt-LDH-Gehalt Zytotoxizität

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3

Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin

Gesamt-LDH-Gehalt (% Kontrolle) Zytotoxizität (%) Abb. 4-29. Vergleichende Darstellung der Messergebnisse zum Gesamt-LDH-Gehalt und zur Zytotoxizität nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin. – In dieser Abbildung werden die Messergebnisse aus Abb.

4-28 zusammengefasst. Es sind die Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 5).

In Abb. 4-30 sind die Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung nach Behandlung der H295R-Zellen sowohl mit den Einzelsubstanzen als auch mit den binären Kombinationen aus Cyprodinil und Azoxystrobin vergleichend dargestellt. Cyprodinil erhöht als Einzelstoff den Estrongehalt dosisabhängig um bis zu durchschnittlich 84 %. Azoxystrobin hingegen senkt als Einzelstoff den Estrongehalt um bis zu durchschnittlich 19 %. Bei Kombination der niedrigsten Konzentrationen beider Wirkstoffe ist im Gegensatz zu den Einzelwirkungen eine Abnahme des Estrongehaltes um durchschnittlich 18 % festzustellen (A1). Wird Azoxy-strobin erhöht, fällt der Estrongehalt um bis zu durchschnittlich 26 % ab (A2 und A3).

Bei höheren Cyprodinil-Konzentrationen werden in Kombination mit Azoxystrobin Estrongehalte gemessen, die zwar im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle erhöht sind, die jedoch durchgehend niedrigere Zunahmen aufweisen als bei alleiniger Cyprodinil-Behandlung (B1 – C3). In Kombination B3 heben sich die entgegengesetzten Einzelwir-kungen der beiden Wirkstoffe im Mittel annähernd auf.

4 Ergebnisse

93

-40 -20 0 20 40 60 80 100 120

Cyprodinil (µM) 0,1 0,1 0,1 10 10 10 30 30 30 Azoxystrobin (µM) 3 10 30 3 10 30 3 10 30

Kombination A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Veränderung des Estrongehaltes (% Kontrolle)

Abb. 4-30. Vergleichende Darstellung der Veränderungen des Estrongehaltes nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Cyprodinil und Azoxystrobin als Einzelsubstanzen sowie in binären Kombinationen. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes relativ zur Lösungsmittelkon-trolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (Einzelsubstanzen: n = 3, Kombinationen:

n = 5).

4.5.2 Cyprodinil und Pyrimethanil

Tab. 4-20 zeigt die neun verschiedenen Konzentrationsverhältnisse, mit denen die H295R-Zellen behandelt wurden.

Tab. 4-20. Kombinationsquadrat für die Pflanzenschutzmittelwirkstoffe Cyprodinil und Pyrimethanil. – Von jeder Substanz wurden drei Konzentrationen festgelegt (s. Kap. 3.2.1.4) und miteinander kombiniert, so dass die H295R-Zellen insgesamt mit neun verschiedenen Kombinationen aus Cyprodinil und Pyrimethanil behandelt wurden. Die hier genannten Bezeichnungen (A1 bis C3) werden in den folgenden Abbildungen für die einzelnen Kombinationen ebenfalls verwendet.

0,1 µM 10 µM 30 µM

3 µM A1 B1 C1

30 µM A2 B2 C2

100 µM A3 B3 C3

Cyprodinil-Konzentration

Pyrimethanil-Konzentration

4 Ergebnisse

Die Messergebnisse zur Bestimmung des Gesamt-LDH-Gehaltes und der Zytotoxizität geben keine Hinweise auf Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Zellen. Die Zyto-toxizitätswerte liegen durchschnittlich bei 7 % (s. Abb. 4-31).

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3

Abb. 4-31. Gesamt-LDH-Gehalt (A) und Zytotoxizität (B) nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Kombinationen aus Cyprodinil und Pyrimethanil. – Der Gesamt-LDH-Gehalt dient als indirektes Maß für die Zellzahl. In (A) sind die Messwerte auf die Lösungsmittelkontrolle (= 100 %) bezogen.

Angabe der Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 5). K: Lösungsmittelkontrolle. Die Bezeichnungen A1 bis C3 verweisen auf die verschiedenen Konzentrationsverhältnisse der Kombinationen, Bedeutungen s. Tab. 4-20.

In Abb. 4-32 ist vergleichend dargestellt, welchen Einfluss Cyprodinil und Pyrimethanil als Einzelsubstanzen sowie in binärer Kombination auf die Estronbiosynthese der H295R-Zellen ausüben. Beide Wirkstoffe erhöhen den Estrongehalt: Cyprodinil um bis zu durchschnittlich 84 % und Pyrimethanil um bis zu durchschnnittlich 47 %.

Werden beide Substanzen in ihrer jeweils niedrigsten Konzentration miteinander kombiniert, wird die Estronkonzentration im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle im Durchschnitt nicht verändert (A1). Wird jeweils die Konzentration von Pyrimethanil (A2 und A3) oder Cyprodinil (B1 und C1) erhöht, nimmt der Estrongehalt unter der Kombinationsbehandlung zu. Die Zunahmen sind vergleichbar hoch wie unter Behandlung mit den jeweiligen Einzel-substanzen.

Die prozentualen Estronzunahmen bleiben annähernd konstant, wenn die H295R-Zellen mit einer Kombination aus der höchsten Cyprodinil-Konzentration (30 µM) und mit 30 oder 100 µM Pyrimethanil behandelt werden (C2 und C3). Ein wenig differenzierter sehen die Ergebnisse aus, wenn die mittlere Cyprodinil-Konzentration (10 µM) mit 30 oder 100 µM

4 Ergebnisse

95

Pyrimethanil kombiniert wird: Die Zunahme des Estrongehaltes ist unter der Kombinations-behandlung im Durchschnitt höher als unter der jeweiligen Behandlung mit den Einzelsub-stanzen (B2 und B3).

Cyprodinil (µM) 0,1 0,1 0,1 10 10 10 30 30 30 -20

0 20 40 60 80 100 120 140

Pyrimethanil (µM) 3 30 100 3 30 100 3 30 100

Kombination A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Veränderung des Estrongehaltes (% Kontrolle)

Abb. 4-32. Vergleichende Darstellung der Ergebnisse zur quantitativen Estronbestimmung nach 24-stündiger Behandlung der H295R-Zellen mit Cyprodinil und Pyrimethanil als Einzelsubstanzen sowie in binären Kombinationen. – Es sind die prozentualen Veränderungen des Estrongehaltes relativ zur Lösungs-mittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (Einzelsubstanzen: n = 3, Kombina-tionen: n = 5).

4.5.3 Cyprodinil und Procymidon

In Tab. 4-21 ist dargestellt, in welchen Konzentrationsverhältnissen Cyprodinil und Procymidon getestet wurden. Die Messwerte zum Gesamt-LDH-Gehalt schwanken zwischen durchschnittlich 92 und 110 % bei zugleich annähernd konstanten Zytotoxizitätswerten um durchschnittlich 7 % (s. Abb. 4-33).

In Abb. 4-34 sind die Wirkungen der Einzelstoffe Cyprodinil und Procymidon sowie ihrer binären Kombinationen auf den Estrongehalt der H295R-Zellen dargestellt. Procymidon erhöht den Estrongehalt als Einzelsubstanz um bis zu durchschnittlich 40 % und ist damit

4 Ergebnisse

etwa halb so potent wie Cyprodinil, das die Estronkonzentration um bis zu durchschnittlich

etwa halb so potent wie Cyprodinil, das die Estronkonzentration um bis zu durchschnittlich

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