Tierärztliche Hochschule Hannover
Hormonell wirksame Pflanzenschutzmittelwirkstoffe:
Risikoorientierte Auswahl und zellexperimentelle Untersuchung von Einzelsubstanzen und binären Kombinationen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Wiebke Prutner
Pforzheim
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. rer. nat. Gerd Hamscher
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Gerd Hamscher 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 18. Mai 2010
Gefördert durch
das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, LAVES
Für meine Familie
&
meine Freunde
Inhaltsverzeichnis
V Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis...IX
1 Einleitung... 1
1.1 Begriffserläuterungen ... 3
1.2 Ursachen für die Entstehung von Mehrfachrückständen durch Pflanzenschutz- mittelwirkstoffe ... 5
1.3 Allgemeine Grundsätze der kumulativen Risikobewertung von Mehrfachrück- ständen... 7
1.3.1 Effekt-Additivität... 7
1.3.2 Dosis-Additivität ... 8
1.3.3 Wechselwirkung ... 10
1.4 Identifizierung von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen für eine kumulative Bewer- tungsgruppe ... 10
2 Aufgabenstellungen und Ziele der Arbeit... 13
3 Material und Methoden... 15
3.1 Material ... 15
3.1.1 Geräte... 15
3.1.2 Laborhilfsmittel ... 15
3.1.3 Verbrauchsmaterialien... 16
3.1.4 Biochemikalien ... 16
3.1.5 Medium und Mediumzusätze ... 17
3.1.5.1 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Pufferlösungen ... 17
3.1.6 Testsubstanzen... 18
3.1.7 Kontrollsubstanzen ... 18
3.1.8 Zelllinie H295R ... 19
3.1.9 Estron-ELISA ... 19
3.1.10 CytoTox-ONETM Homogeneous Membrane Integrity Assay ... 19
3.1.11 Rückstandsdaten ... 20
3.2 Methoden... 20
3.2.1 Zellkultur ... 20
Inhaltsverzeichnis
3.2.1.1 Dauerkultivierung der H295R-Zellen... 20
3.2.1.2 Gefrierkonservierung der H259R-Zellen ... 21
3.2.1.3 Behandlung der H295R-Zellen mit Einzelsubstanzen... 22
3.2.1.4 Behandlung der H295R-Zellen mit binären Wirkstoffkombinationen... 22
3.2.1.5 Allgemeines Behandlungsprotokoll der H295R-Zellen ... 25
3.2.2 Untersuchungen mittels Estron-ELISAs ... 26
3.2.2.1 Testprinzip des Estron-ELISAs ... 26
3.2.2.2 Matrixkalibrierung... 27
3.2.2.3 Kreuzreaktivität ... 28
3.2.2.4 Durchführung des Estron-ELISAs ... 30
3.2.3 Untersuchungen mittels CytoTox-ONETM Homogeneous Membrane Integrity Assay (CytoTox-ONETM-Assay) ... 31
3.2.3.1 Testprinzip des CytoTox-ONETM-Assays ... 31
3.2.3.2 Durchführung des CytoTox-ONETM-Assays... 32
3.2.3.3 Berechnung der Zytotoxizität ... 34
3.2.4 Auswertung der Rückstandsdaten ... 35
3.2.4.1 Auswahl der Testsubstanzen und binären Wirkstoffkombinationen... 35
3.2.4.2 Berechnung der prozentualen ARfD-Ausschöpfung... 35
3.2.5 Statistische Auswertung ... 36
4 Ergebnisse ... 38
4.1 Risikoorientierte Auswahl der Testsubstanzen ... 38
4.1.1 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung der Häufigkeit der Rückstandsbefunde ... 38
4.1.2 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung EU-weiter Anwendungsvorschriften für Pflanzenschutzmittelwirkstoffe ... 38
4.1.3 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung der spezifischen Toxizität... 39
4.1.3.1 Wirkstoffe mit Einfluss auf die Biosynthese der Sexualsteroide und die Funktion steroidaler Rezeptoren... 41
4.1.3.2 Wirkstoffe mit Einfluss auf mitochondriale Funktionen... 45
4.1.4 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung der Pestizidklassenzugehörigkeit.. 48
4.1.5 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung der prozentualen ARfD-Ausschöp- fung der Rückstandsbefunde ... 49
4.1.6 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung des In-vitro-Testsystems... 52
4.1.7 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung des kombinatorischen Auftretens: zwei Vorgehensweisen ... 54
4.1.7.1 Vorgehensweise Nr. 1... 56
4.1.7.2 Vorgehensweise Nr. 2... 65
4.1.8 Zusammenfassung: Risikoorientierte Auswahl der Testsubstanzen ... 66
Inhaltsverzeichnis
VII
4.2 Ergebnisse der Einzelstoffversuche... 70
4.2.1 Cyprodinil... 70
4.2.2 Pyrimethanil... 71
4.2.3 Myclobutanil... 72
4.2.4 Tebuconazol... 73
4.2.5 Azoxystrobin ... 74
4.2.6 Kresoxim-methyl ... 76
4.2.7 Iprodion ... 78
4.2.8 Procymidon... 79
4.2.9 Captan... 81
4.2.10 Methomyl... 83
4.2.11 Zusammenfassung: Ergebnisse der Einzelstoffversuche... 84
4.3 Auswahl binärer Wirkstoffkombinationen... 86
4.4 Einfluss der Zellzahl auf das Wirkungsausmaß der Testsubstanzen... 89
4.5 Ergebnisse der Kombinationsversuche ... 90
4.5.1 Cyprodinil und Azoxystrobin ... 90
4.5.2 Cyprodinil und Pyrimethanil ... 93
4.5.3 Cyprodinil und Procymidon ... 95
4.5.4 Cyprodinil und Myclobutanil ... 97
4.5.5 Zusammenfassung: Ergebnisse der Kombinationsversuche... 99
5 Diskussion ... 102
5.1 Bedeutung der Sexualsteroide für den Menschen ... 102
5.2 Risikoorientierte Auswahl der Testsubstanzen ... 104
5.2.1 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung der Verbraucherexposition ... 106
5.2.2 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung der spezifischen Toxizität... 107
5.2.3 Wirkstoffauswahl unter Berücksichtigung des kombinatorischen Auftretens 108 5.3 Einzelstoffversuche ... 109
5.3.1 Cyprodinil, Pyrimethanil (Anilinopyrimidine)... 109
5.3.2 Myclobutanil, Tebuconazol (Triazole) ... 111
5.3.3 Azoxystrobin, Kresoxim-methyl (Strobilurine) ... 114
5.3.4 Iprodion, Procymidon (Dicarboximide) ... 115
5.3.5 Captan (Phthalimid)... 117
5.3.6 Methomyl (Oximcarbamat) ... 119
Inhaltsverzeichnis
5.4 Einfluss der Zellzahl auf das Wirkungsausmaß der Testsubstanzen... 119
5.5 Kombinationsversuche ... 120
5.5.1 Cyprodinil und Azoxystrobin ... 120
5.5.2 Cyprodinil und Pyrimethanil ... 122
5.5.3 Cyprodinil und Procymidon ... 124
5.5.4 Cyprodinil und Myclobutanil ... 125
5.6 Risikobewertung... 126
5.7 Ausblick... 129
6 Zusammenfassung... 132
7 Summary... 134
8 Anhang ... 136
8.1 Einfluss des Serums auf basale Estronproduktion der H295R-Zellen ... 136
8.2 Antikörperwechsel verändert Messeigenschaften des Estron-ELISAs ... 139
8.3 Tabellenanhang ... 141
8.4 Abbildungsverzeichnis ... 148
8.5 Tabellenverzeichnis... 150
8.6 Abbildungsanhangsverzeichnis ... 151
8.7 Tabellenanhangsverzeichnis... 151
9 Literaturverzeichnis... 153
10 Zitierfähige Publikationen ... 167
11 Danksagung ... 168
Abkürzungsverzeichnis
IX Abkürzungsverzeichnis
4-OH-Androstendion 4-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion
8-Br-cAMP-Na (engl.) 8-Bromoadenosine 3’,5’-cyclic monophosphate sodium
salt
µg Mikrogramm
µL Mikroliter
µm Mikrometer
µM Mikromolar
Abb. Abbildung
Abl. Amtsblatt der Europäischen Union
ADI (engl.) Acceptable Daily Intake Aqua dest. (lat.) Aqua destillata
ARfD (engl.) Acute Reference Dose; Akute Referenzdosis
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosintriphosphat
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
BVL Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
CA California
CAG (engl.) Cumulative Assessment Group
CAS (engl.) Chemical Abstracts Service
CMG (engl.) Common Mechanism Group
CoA Coenzym A
COT (engl.) Committee on Toxicity of Chemicals in Food, Consumer
Products and the Environment
CVUA Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt
CYP Cytochrom P450
DES Diethylstilbestrol
DG SANCO Generaldirektion Gesundheit und Verbraucher DMEM (engl.) Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNS Desoxyribonukleinsäure
Abkürzungsverzeichnis
E Einheit
EC50 (engl.) Half Maximal Effective Concentration
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA (engl.) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EFSA (engl.) European Food Safety Authority EPA (engl.) Environmental Protection Agency
ER Estrogenrezeptor
et al. (lat.) et alii
EU Europäische Union
EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft
FAO (engl.) Food and Agriculture Organization of the United States
FBS (engl.) Fetal Bovine Serum
FFL (engl.) Feed-Forward Loop
g Erdbeschleunigung
GMBl. Gemeinsames Ministerialblatt
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HSD Hydroxysteroid-Dehydrogenasen
IC50 (engl.) Half Maximal Inhibitory Concentration
Kap. Kapitel
KG Körpergewicht
LAVES Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
LDH Laktatdehydrogenase
LFGB Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch LOAEL (engl.) Lowest Observed Adverse Effect Level
M Molar
MAP-Kinase (engl.) Mitogen-Activated Protein-Kinase
mL Milliliter
mM Millimolar
MRL (engl.) Maximum Residue Level
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-Bromid
Abkürzungsverzeichnis
XI
n Anzahl der Versuche
NAD+/NADH Nikotinamiddinukleotid (oxidierte/reduzierte Form) NESTI (engl.) National Estimated Short Term Intake NOAEL (engl.) No Observed Adverse Effect Level
mg Milligramm
nm Nanometer
OECD (engl.) Organization for Economic Co-operation and
Development
PCB Polychlorierte Biphenyle
PBS (engl.) Phosphate Buffered Saline
PCR (engl.) Polymerase Chain Reaction
pg Picogramm
pH (lat.) potentia Hydrogenii
PPDB (engl.) Pesticide Properties Database
PPR Panel (engl.) Panel on Plant Production Products and their Residues
R2 Bestimmtheitsmaß
RASFF (engl.) Rapid Alert System for Food and Feed RPF (engl.) Relative Potency Factor
StAR-Protein (engl.) Steroidogenic Acute Regulatory-Protein
Tab. Tabelle
VA Virginia
VELS Verzehrsstudie zur Ermittlung der Lebensmittelaufnahme von Säuglingen und Kleinkindern für die Abschätzung eines akuten
Toxizitätsrisikos durch Rückstände von Pflanzenschutzmitteln
v/v (engl.) volume per volume
WHO (engl.) World Health Organization
WiGRAMP (engl.) Working Group on Risk Assessment of Mixtures of
Pesticides and Similar Substances
w/v (engl.) weight per volume
1 Einleitung
1 1 Einleitung
Im Rahmen der amtlichen Lebensmittelüberwachung werden Lebensmittel regelmäßig beprobt und u. a. mit Hinblick auf den Schutz der Verbrauchergesundheit auf verschiedene Parameter untersucht. So werden Lebensmittelproben beispielsweise dahingehend überprüft, ob und in welchen Konzentrationen sie Rückstände von Pflanzenschutzmitteln enthalten.
Pflanzenschutzmittel werden in der Landwirtschaft bewusst eingesetzt, um die Gesundheit der Pflanzen zu schützen, hohe Ernteerträge zu sichern und die Qualität der pflanzlichen Produkte zu wahren. In Form von Rückständen können Pflanzenschutzmittelwirkstoffe, die während der Vegetationsphase oder Lager- und Transportzeit angewandt wurden, schließlich auch in oder auf Lebensmitteln nachgewiesen werden. Handelt es sich dabei um Rückstände von mehr als nur einem Wirkstoff, spricht man von einer Belastung mit sogenannten „Mehrfach- rückständen“.
In den letzten Jahren war mindestens ein Drittel der auf Pflanzenschutzmittelrückstände unter- suchten Lebensmittelproben mit Mehrfachrückständen belastet (s. Abb. 1-1). Dies zeigen bundesweite Untersuchungsergebnisse, die regelmäßig vom Bundesamt für Verbraucher- schutz und Lebensmittelsicherheit veröffentlicht werden (BVL 2005a; 2005b; 2006; 2007;
2008; 2009a; 2010).
0 10 20 30 40 50
2008 2007 2006 2005 2004 2003 2002
33 % 32,8 %
36,6 % 41,5 % 41,6 % 40,9 % 36,6 %
Anteil der mit Mehrfachrückständen belasteten Lebensmittelproben am
Gesamtprobenumfang (%)
Untersuchungsjahr Abb. 1-1. Übersicht über das Vorkommen
von Pflanzenschutzmittelmehrfachrückständen in bundesweit untersuchten Lebensmittelproben in den Jahren 2002 bis 2008. – Die prozentualen Angaben wurden den BVL-Berichten „Nationale Berichterstattung Pflanzenschutzmittelrückstände“
entnommen, die jährlich vom BVL veröffentlicht werden. Der Gesamtprobenumfang umfasst neben Plan- und Monitoringproben auch Verdachts-, Beschwerde- und Verfolgsproben. Werden in einer Lebensmittelprobe zwei oder mehr Rückstände nachgewiesen, wird von einer Belastung mit Mehr- fachrückständen gesprochen.
Das bedeutet, dass in durchschnittlich jeder dritten Probe Rückstände von mindestens zwei Pflanzenschutzmittelwirkstoffen nachgewiesen werden konnten. Besonders davon betroffen
1 Einleitung
waren Erzeugnisse pflanzlichen Ursprungs (einschließlich Obst und Gemüse, ohne Getreide), die mit einem Anteil von durchschnittlich 86 % auch die am häufigsten auf Pflanzenschutz- mittelrückstände beprobte Lebensmittelgruppe darstellten.
Mandarine, Johannisbeere und Erdbeere waren in den letzten vier Untersuchungsjahren stets unter den ersten fünf Lebensmitteln vertreten, deren Proben am häufigsten mit Mehrfachrück- ständen belastet waren. Im Durchschnitt enthielten drei Fünftel aller mehrfach belasteten Lebensmittel Rückstände von zwei oder drei Pflanzenschutzmittelwirkstoffen, doch gab es auch Erzeugnisse, in denen weit mehr als 20 verschiedene Wirkstoffrückstände ermittelt wurden. „Spitzenreiter” waren bislang Proben aus Paprikapulver Fruchtgewürz, in denen im Untersuchungsjahr 2007 bis zu 30 verschiedene Wirkstoffrückstände nachgewiesen wurden.
In der Regel handelte es sich dabei um Rückstände, die (deutlich) unterhalb ihrer gesetzlich festgelegten Höchstmenge (Maximum Residue Level, MRL) sowie toxikologischen Referenz- werte (Acceptable Daily Intake, ADI, und Acute Reference Dose, ARfD) lagen und somit per definitionem kein gesundheitliches Risiko für den Verbraucher darstellten. In der Tat mussten die deutschen Untersuchungsbehörden zwischen den Jahren 2005 und 2008 generell bei weniger als 0,3 % der Proben eine Meldung an das Europäische Schnellwarnsystem RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) machen, als eine Gefährdung des Verbrauchers durch einen Pflanzenschutzmittelrückstand nicht ausgeschlossen werden konnte. Dieser Fall tritt immer dann ein, wenn die nachgewiesene Rückstandskonzentration über der korrespon- dierenden ARfD oder deutlich über dem jeweils gültigen ADI-Wert liegt.
Generell jedoch werden diese beiden toxikologischen Referenzwerte nur für Einzelstoffe er- stellt und sind damit nur für eine Einzelstoffbewertung anwendbar. In diesem Zusammenhang stellt sich damit die Frage, ob mit dem bisher angewandten Risikobewertungskonzept auf Grundlage von MRL, ADI und ARfD die von Mehrfachrückständen möglicherweise ausge- henden Risiken überhaupt ausreichend erfasst werden. Die Sorge richtet sich insbesondere auf mögliche additive oder sogar überadditive Kombinationswirkungen, die im menschlichen Körper nach Aufnahme von mit Mehrfachrückständen belasteten Lebensmitteln auftreten könnten. In dieser Hinsicht stellt sich daher die weitere Frage, ob anstelle der Einzelstoffbe- wertung eine kumulative Bewertungsstrategie treten sollte, um Wirkstoffkombinationen adäquat auf ihr Gesamtrisiko einschätzen zu können.
1 Einleitung
3
In diesem Zusammenhang wurden bereits im Verlauf der letzten Jahre sowohl auf nationaler als auch internationaler Ebene verstärkt Anstrengungen unternommen, um grundsätzliche Vorgehensweisen sowie konkrete Konzepte für eine kumulative Risikobewertung von Pflanzenschutzmittelrückständen auszuarbeiten. Seit Inkrafttreten der EU-Verordnung 396/2005 ist zudem im europäischen Recht offiziell verankert, dass es „auch wichtig [ist], dass weitere Arbeiten durchgeführt werden, um Methoden zur Erfassung kumulativer und synergistischer Wirkungen zu entwickeln“. Es gilt dabei nicht nur zu klären, mit welchen Methoden und auf Grundlage welcher Informationen eine kumulative Risikobewertung vor- genommen werden soll. Es muss darüber hinaus eine Vorgehensweise festgelegt werden, an- hand derer toxikologisch relevante Wirkstoffgruppen und -kombinationen für eine kumulative Risikobewertung identifiziert werden.
Wie den nachfolgenden Kapiteln entnommen werden kann, konzentrieren sich die bisher aus- gearbeiteten Strategien auf die Identifizierung und Bewertung additiv wirkender Pflanzen- schutzmittelwirkstoffe. Allerdings wird weiterhin ein Konzept zur Identifizierung potenziell interagierender Pflanzenschutzmittelwirkstoffe und Rückstandskombinationen benötigt. In der vorliegenden Arbeit wird eine solche Vorgehensweise vorgestellt. Sie soll dazu beitragen, die theoretisch denkbare Fülle an möglicherweise wechselwirkenden Rückstandskombina- tionen auf eine für die Risikobewertung toxikologisch relevante sowie für die experimentelle Untersuchung praktikable Anzahl einzuschränken
1.1 Begriffserläuterungen
An dieser Stelle werden zunächst einige Begriffe definiert, die für die Risikobewertung von Rückständen in Lebensmitteln eine wichtige Rolle spielen und in der vorliegenden Arbeit häufig verwendet werden.
NOAEL (mg/kg Körpergewicht) = No Observed Adverse Effect Level
Der NOAEL-Wert entspricht der höchsten Dosis eines Wirkstoffes, der in der empfindlichs- ten Tierspezies unter Berücksichtigung des empfindlichsten toxischen Effekts (noch) keine schädigende Wirkung hervorruft. Der NOAEL-Wert aus Langzeitstudien wird für die Ermitt- lung des ADI-Wertes herangezogen, derjenige aus Kurzzeitstudien für die Berechnung des ARfD-Wertes.
1 Einleitung
ADI (mg/kg Körpergewicht) = Acceptable Daily Intake = Duldbare tägliche Aufnahmemenge Der ADI-Wert legt die Konzentration fest, die ein Mensch von einem Wirkstoff täglich und lebenslang aufnehmen kann, ohne davon gesundheitliche Risiken zu befürchten. Die festge- legte Konzentration berücksichtigt hierbei auch spezifische Verzehrsgewohnheiten oder be- sonders empfindliche Personengruppen.
Bei der Berechnung des ADI-Wertes wird der NOAEL-Wert aus Langzeitstudien mit Sicher- heitsfaktoren dividiert, um der Extrapolation der Versuchsergebnisse aus dem Tierversuch auf den Menschen Rechnung zu tragen. Außerdem sollen auf diese Weise individuelle Unter- schiede zwischen Personen berücksichtigt werden. So liegt der ermittelte ADI-Wert je nach Wahl des Sicherheitsfaktors 10- bis 1000-fach niedriger als der korrespondierende NOAEL- Wert.
ARfD (mg/kg Körpergewicht) = Acute Reference Dose = Akute Referenzdosis
Die ARfD entspricht der Wirkstoffkonzentration, die ein Mensch mit einer Mahlzeit bzw. im Verlauf von 24 Stunden aufnehmen kann, ohne dadurch gesundheitliche Schäden zu erleiden.
Ausgangspunkt für die Festlegung der ARfD ist der NOAEL-Wert aus Kurzzeitstudien.
Dieser wird mit Sicherheitsfaktoren dividiert, um etwaige Unterschiede zwischen Tier und Mensch (Interspezies-Unterschiede) sowie zwischen verschiedenen Personen (Intraspezies- Unterschiede) mit Hinblick auf die Empfindlichkeit gegenüber einer toxischen Substanz aus- reichend zu berücksichtigen.
LOAEL (mg/kg Körpergewicht) = Lowest Observed Adverse Effect Level
Der LOAEL-Wert entspricht der niedrigsten Konzentration, bei welcher im Tierversuch erste Anzeichen einer toxischen Wirkung beobachtet werden.
MRL (mg/kg Lebensmittel) = Maximum Residue Level = Gesetzlich festgelegte Rückstands- höchstmenge
Der MRL-Wert stellt in erster Linie einen Richtwert für den Warenhandel dar: Wird er über- schritten, ist das betroffene Erzeugnis nicht verkehrsfähig. Seine Höhe wird im Rahmen von Feldstudien unter Beachtung der Guten Landwirtschaftlichen Praxis ermittelt. Bei der Unter- suchung auf Einhaltung der Rückstandshöchstwerte wird somit vorrangig kontrolliert, ob ein Pflanzenschutzmittelwirkstoff ordnungsgemäß eingesetzt wurde.
1 Einleitung
5
Auch wenn der MRL-Wert von den toxikologischen Grenzwerten ADI und ARfD nicht direkt abgeleitet wird, müssen diese bei der Festlegung des Höchstwertes berücksichtigt und dürfen von diesem keinesfalls überschritten werden. So hilft die Einhaltung des MRL-Wertes darüber hinaus, unnötige Risiken durch Pflanzenschutzmittelrückstände für den Verbraucher zu vermeiden, auch wenn es sich in den meisten Fällen um keinen toxikologisch begründeten Grenzwert handelt.
NESTI (mg/kg Körpergewicht) =National Estimated Short Term Intake = National geschätzte kurzzeitige Aufnahmemenge
Es handelt sich hierbei um eine Kenngröße zur Abschätzung der kurzfristigen Aufnahme von Pflanzenschutzmittelrückständen über die Nahrung. Sie berechnet sich aus der Konzentration des Wirkstoffrückstandes, der in bzw. auf einem Lebensmittel nachgewiesen wurde, aus der durchschnittlichen Verzehrsmenge des Lebensmittels und aus dem Körpergewicht. Mithilfe dieser Kenngröße kann der prozentuale Ausschöpfungsgrad einer ARfD berechnet und somit das kurzfristige Risiko eines Pflanzenschutzmittelrückstandes für den Verbraucher abge- schätzt werden (nähere Details zur Berechnung s. Kap. 3.2.4.2).
1.2 Ursachen für die Entstehung von Mehrfachrückständen durch Pflanzenschutz- mittelwirkstoffe
Die Gründe für die Entstehung von Mehrfachrückständen durch Pflanzenschutzmittelwirk- stoffe sind vielfältig. So können sie Folge einer Anwendung von Kombinationspräparaten mit mehreren Wirkstoffen sein. Doch auch der bewusste Einsatz vieler verschiedener, spezifisch wirkender Monopräparate im Verlauf einer Vegetationsperiode ist als Ursache denkbar, denn dies entspricht den Grundsätzen des integrierten Pflanzenschutzes, der im Gesetz zum Schutz der Kulturpflanzen (Pflanzenschutzgesetz) verankert ist. Dessen Ziel ist es, u. a. durch eine zielgerichtete Schädlingsbekämpfung und ein effektives sowie umweltschonendes Resistenz- management den Einsatz chemischer Pflanzenschutzmittel auf ein Mindestmaß zu reduzieren.
Darüber hinaus werden Ernteprodukte zum Teil während der Lagerung und/oder beim Trans- port zusätzlich mit Pflanzenschutzmitteln behandelt. Auch dies kann letztlich dazu beitragen, dass mehrere Wirkstoffrückstände in einer Probe nachgewiesen werden können.
1 Einleitung
Auch die Art der Lebensmitteluntersuchung kann unter Umständen den Nachweis von Mehr- fachrückständen begünstigen, da in der Regel keine einzelnen Früchte, sondern homogeni- sierte Mischproben aus mehreren Früchten auf Rückstände untersucht werden. Diese Vorge- hensweise ist in der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §64 des LFGB (Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch) vorgeschrieben. Handelt es sich nun um eine Lebensmittelprobe, deren Einzelfrüchte von einer Partie entnommen wur- den, die aus Erzeugnissen verschiedener Erzeuger zusammengesetzt war, so werden in der Gesamtheit möglicherweise mehr Wirkstoffe nachgewiesen als in den einzelnen Früchten ur- sprünglich vorhanden waren.
Grundsätzlich kann auch nicht ausgeschlossen werden, dass Erzeuger entgegen der Guten Landwirtschaftlichen Praxis mehrere Wirkstoffe mit gleichem Wirkmechanismus einsetzen, um unterhalb der jeweils gesetzlich festgelegten Höchstmenge zu bleiben.
Des Weiteren sind auch die erheblichen technischen Fortschritte zu nennen, die in den letzten Jahren im Bereich der Analytik von Pflanzenschutzmittelrückständen erzielt werden konnten.
Diese führten nicht nur zu einer erhöhten Empfindlichkeit der Messmethoden, sondern auch zu einem erweiterten Wirkstoffspektrum, auf das einzelne Lebensmittelproben untersucht werden können.
Je nach zugrunde liegender Ursache kann der Verbraucher somit über den Verzehr von Lebensmitteln auf zwei unterschiedliche Weisen Mehrfachrückstände aufnehmen: Entweder wird ein einziges Produkt verzehrt, das bereits mehrere Wirkstoffrückstände enthält; in diesem Fall spricht man von einem „Primary Cocktail“. Oder es werden mehrere Erzeugnisse im Sinne eines zusammengesetzten Lebensmittels (z. B. Salatmischung) oder eine Verkaufs- einheit verschiedener Erzeuger (z. B. bunter Paprika-Mix) konsumiert, deren Rückstands- belastung das gesamte Spektrum aller angewandten Pflanzenschutzmittelwirkstoffe widerspiegelt. Auf diese Weise entstandene Mehrfachrückstände werden als „Secondary Cocktail“ bezeichnet (BANASIAK u. HOHGARDT 2007, S. 1245).
1 Einleitung
7
1.3 Allgemeine Grundsätze der kumulativen Risikobewertung von Mehrfachrück- ständen
Grundsätzlich werden im Bereich der Risikobewertung drei Formen unterschieden, die die toxikologische Gesamtwirkung eines Gemisches beschreiben: Effekt-Additivität, Dosis-Addi- tivität und Wechselwirkung (FERON u. GROTEN 2002). In Anlehnung an diese Einteilung werden verschiedene Bewertungskonzepte angewandt bzw. entwickelt, anhand derer Pflan- zenschutzmittelmehrfachrückstände auf ihr mögliches Gesamtrisiko eingeschätzt werden.
1.3.1 Effekt-Additivität
Bei einem Wirkstoffgemisch wird von Effekt-Additivität gesprochen, wenn die einzelnen Substanzen nicht nur auf unterschiedliche Weisen wirken, sondern sich in ihren Wirkungen auch nicht gegenseitig beeinflussen. Das Gesamtrisiko einer solchen Stoffkombination geht von der Substanz aus, die die geringste Differenz zwischen der aufgenommenen Wirkstoff- menge und ihrem LOAEL-Wert aufweist.
Eine unabhängige Arbeitsgruppe unter dem Akronym WiGRAMP (Working Group on Risk Assessment of Mixtures of Pesticides and Similar Substances) des britischen Committee on Toxicity of Chemicals in Food, Consumer Products and the Environment (COT) empfiehlt in diesem Zusammenhang, Wirkstoffe mit unterschiedlichen Wirkmechanismen einzeln zu bewerten (COT 2002). Darüber hinaus vertritt die Europäische Behörde für Lebensmittel- sicherheit (European Food Safety Authority, EFSA) bei Gemischen mit Effekt-Additivität die Meinung, dass diese für eine kumulative Risikobewertung ohne Relevanz sind, solange die Konzentrationen der einzelnen Wirkstoffe unterhalb des jeweiligen NOAEL-Wertes liegen (EFSA 2007; 2008). Dies wiederum ist bei ordnungsgemäßem Einsatz der Pflanzenschutz- mittel der Regelfall und wird durch die Einhaltung des gesetzlich festgelegten Rückstand- höchstwertes gewährleistet. Es wird somit die Einzelstoffbewertung als ausreichend ange- sehen, um das Risiko eines Gemisches mit unabhängig voneinander und unterschiedlich wir- kenden Stoffen adäquat einzuschätzen.
1 Einleitung
1.3.2 Dosis-Additivität
Dosis-Additivität tritt ein, wenn die einzelnen Wirkstoffe eines Gemisches nicht nur die gleiche Wirkung ausüben, sondern ihnen auch der gleiche Wirkmechanismus zugrunde liegt.
Die Substanzen unterscheiden sich lediglich in ihren Potenzen, und die Einzeleffekte summieren sich auf. Das Risiko eines Gemisches geht von der Gesamtheit aller gleich wir- kenden Stoffe aus.
Die EFSA sieht es als wissenschaftlich erwiesen an, dass Dosis-Additivität auch bei niedrig konzentrierten Chemikaliengemischen auftreten kann, und hält diese daher auch bei Pflanzen- schutzmittelmehrfachrückständen grundsätzlich für möglich. Daher beurteilte sie eingehend bereits bestehende Konzepte zur kumulativen Risikobewertung von Pflanzenschutzmittel- wirkstoffen mit additiven Wirkungen (EFSA 2008). Die WiGRAMP empfiehlt grundsätzlich, Wirkstoffe mit gleichem toxikologischen Wirkmechanismus gemeinsam zu bewerten (COT 2002). Dieses Vorgehen wurde bereits in der Vergangenheit im Rahmen der Rückstands- höchstmengen-Verordnung und nunmehr durch die EU-Verordnung 396/2005 durch die Etab- lierung von Summenhöchstmengen für einige Wirkstoffkombinationen und Pestizidklassen in die Praxis umgesetzt. Die Summe aus einzelnen Rückstandskonzentrationen darf somit einen gemeinsamen Höchstwert in einer Lebensmittelprobe nicht überschreiten. Beispiele hierfür sind Carbendazim und Benomyl, Triadimefon und Triadimenol sowie die Dithiocarbamate Maneb, Mancozeb, Metiram, Propineb, Thiram und Ziram.
Darüber hinaus wurden bereits in den USA für Wirkstoffe aus vier verschiedenen Pestizid- klassen (Organophosphate, N-Methyl-Carbamate, Chloracetanilide und Triazine) kumulative Bewertungskonzepte auf Grundlage von relative potency factors (RPFs) entwickelt (EPA 2006a; 2006b; 2006c; 2007). Hierfür werden die Substanzen nach detaillierten Recherchen jeweils einer common mechanism group (CMG) zugeteilt, d. h. den Substanzen liegt der gleiche Wirkmechanismus zugrunde und sie unterscheiden sich lediglich in ihrer Wirkpotenz.
In jeder CMG wird eine Index-Substanz festgesetzt, auf welche die Wirkpotenzen der übrigen Stoffe bezogen und durch die Ermittlung von RPFs beschrieben werden. (Im Falle der Triazine wurden allerdings alle Stoffe als gleichpotent zur Index-Substanz betrachtet.) Treten nun Wirkstoffe einer CMG zusammen in einer Lebensmittelprobe auf, werden die einzelnen Konzentrationen durch Multiplikation mit dem entsprechenden RPF in gleichpotente Äquiva-
1 Einleitung
9
lente der Index-Substanz umgerechnet und addiert. Die Summe der relativen Konzentrationen wird anschließend mit einem toxikologischen Bezugspunkt (beispielsweise dem NOAEL) der Index-Substanz verglichen und darauf basierend eine Risikobewertung vorgenommen.
Neben den USA befassten sich auch andere Länder mit dieser Methode und wendeten diese mit modifizierten Vorgehensweisen insbesondere für eine kumulative Risikobewertung von Acetylcholinesterase-hemmenden Wirkstoffen an (Großbritannien (EFSA 2008), Niederlande (BOON u. VAN KLAVEREN 2003), Dänemark (JENSEN et al. 2003)).
Das Chemische und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Stuttgart schlägt im Gegensatz hier- zu ein sehr pragmatisches Modell zur toxikologischen Risikobewertung von Mehrfachrück- ständen in Obst- und Gemüseproben vor (CVUA 2007). Hierbei wird in einem ersten Schritt für jeden nachgewiesenen Wirkstoffrückstand einer Untersuchungsprobe die jeweilige national geschätzte kurzzeitige Aufnahmemenge (National Estimated Short Term Intake, NESTI) in mg/kg Körpergewicht berechnet. Anhand dieses Wertes wird anschließend für jede Rückstandskonzentration der prozentuale Ausschöpfungsgrad der korrespondierenden ARfD ermittelt. In einem zweiten Schritt erfolgt die Addition der einzelnen ARfD-Ausschöpfungs- raten aller Wirkstoffrückstände einer Untersuchungsprobe. Unterschreitet die Summe 100 %, wird eine Probe als toxikologisch unbedenklich eingestuft. Bei einer Überschreitung hingegen werden in einem dritten Schritt die Wirkstoffrückstände auf ihre tatsächlichen Wirkmechanis- men überprüft und auf Basis der Wirkprinzipien Dosis-Additivität und Effekt-Additivität spezifisch bewertet.
Wie zu erkennen ist, basiert das Stuttgarter Modell auf einer Worst-Case-Betrachtung, denn allen nachgewiesenen Pflanzenschutzmittelwirkstoffen einer Untersuchungsprobe wird zu- nächst der gleiche toxikologische Wirkmechanismus zugrunde gelegt, wonach angenommen wird, dass sich alle Einzelwirkungen aufaddieren. Durch dieses pragmatische Vorgehen sollen auffällige Lebensmittelproben schnell identifiziert und für eine nachfolgende detaillierte Risikobewertung zugänglich gemacht werden. Das CVUA Stuttgart weist allerdings darauf hin, dass dieses Bewertungsmodell noch Gegenstand aktueller Forschungen und Diskussionen sei.
1 Einleitung
1.3.3 Wechselwirkung
Man spricht von Wechselwirkung, wenn sich einzelne Wirkstoffe eines Gemisches in ihren Wirkungen gegenseitig beeinflussen. Dies hat zur Folge, dass der Gesamteffekt entweder kleiner (Antagonismus) oder größer (Synergismus) ist als die Summe der Einzelwirkungen.
Das Gesamtrisiko wird somit von der spezifischen Zusammensetzung der Wirkstoffkombina- tion bestimmt.
Experten auf dem Gebiet der Risikobewertung sind der Meinung, dass das etwaige Auftreten von Antagonismen keine Gefahr für die Verbrauchergesundheit darstelle und daher für eine kumulative Risikobewertung von untergeordneter Bedeutung sei (EFSA 2007). Synergis- tische Kombinationswirkungen hingegen könnten in bestimmten Fällen möglicherweise rele- vant sein.
In Anlehnung an diese erste Einschätzung sowie nach intensiver Literaturrecherche beurteilte die EFSA in einem wissenschaftlichen Gutachten das mögliche Auftreten von toxischen Inter- aktionen zwischen Wirkstoffen grundsätzlich als weniger relevant für die Risikobewertung von Pflanzenschutzmittelrückständen in Lebensmitteln (EFSA 2008). Sie betont jedoch, dass Wechselwirkungen zwischen Mehrfachrückständen nicht generell ausgeschlossen werden können. Es solle daher in den Fällen, in denen ein Wechselwirken zwischen einzelnen Wirk- stoffen aufgrund eines biologischen Zusammenhanges plausibel erscheint, eine individuelle Fall-zu-Fall-Bewertung durchgeführt werden. Bislang gibt es aber kein allgemein gültiges Konzept für die Risikobewertung interagierender Pflanzenschutzmittelrückstände.
1.4 Identifizierung von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen für eine kumulative Bewer- tungsgruppe
Im Zusammenhang mit Mehrfachrückständen von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen ist nicht nur zu klären, welche Konzepte zur kumulativen Risikobewertung angewendet, sondern auch welche Wirkstoffe hiervon überhaupt erfasst werden sollen. Es geht also um die Frage, auf welche Weise cumulative assessment groups (CAGs), d. h. kumulative Bewertungsgruppen ermittelt werden sollen.
In Bezug auf die Erstellung von CAGs mit Wirkstoffen, die einen gleichen Wirkmechanismus aufweisen, könnte für die Identifizierung der Substanzen eine Vorgehensweise dienlich sein,
1 Einleitung
11
die u. a. von der United States Environmental Protection Agency (EPA) in einer Leitlinie ausgearbeitet wurde (EPA 1999). Die EPA schlägt vor, Substanzen zunächst in eine vor- läufige Gruppe einzuordnen. Die Einordnung basiert auf Ähnlichkeiten der Wirkstoffe in der Molekülstruktur und/oder auf Gemeinsamkeiten in der Wirkung als Pflanzenschutzmittel und/oder in Säugerorganismen. Hinzu gezählt werden darüber hinaus alle Vorstufen, die im Säugerorganismus zu Wirkstoffen der vorläufig zusammengestellten Gruppe umgebaut werden. Anschließend erfolgt eine detaillierte Überprüfung der Stoffe hinsichtlich ihrer toxi- kologischen Wirkung und ihres toxikologischen Wirkmechanismus. Substanzen, die sowohl den gleichen toxikologischen Effekt ausüben als auch den gleichen toxikologischen Wirkme- chanismus aufweisen, werden dann in einer common mechanism group (CMG) zusammenge- fasst und gemeinsam bewertet.
Die EFSA stimmt in einem wissenschaftlichen Gutachten dieser Vorgehensweise grundsätz- lich zu (EFSA 2008). Sie gibt allerdings zu bedenken, dass eine detaillierte Recherche bis hin zum zugrunde liegenden Wirkmechanismus nicht in allen Fällen unbedingt notwendig oder sogar möglich sei. Angesichts der Vielzahl an Pflanzenschutzmittelwirkstoffen und infolge- dessen denkbar vieler CAGs empfiehlt die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit darüber hinaus, vorrangig diejenigen Bewertungsgruppen zu untersuchen, denen der Verbrau- cher in erhöhtem Maße über den Verzehr von Lebensmitteln ausgesetzt ist. Für die Entschei- dung, ob eine kumulative Risikobewertung durchgeführt wird, wird die Anwendung folgender Kriterien vorgeschlagen:
die Häufigkeit der chemisch-analytischen Nachweise von Wirkstoffen bestimmter CAGs in Monitoring-Programmen;
Informationen aus Verkaufsstatistiken;
Hinweise auf eine erhöhte Exposition aus Biomonitoring-Untersuchungen;
CAGs, die Substanzen mit hoher Exposition in Bezug zu ihren Referenzwerten enthalten;
unakzeptable Exposition in einem anderen Bereich (außerhalb des Pflanzenschutzes beispielsweise im Bereich der Medizin);
CAGs, die fünf oder mehr Substanzen aufweisen;
1 Einleitung
Vermutungen über zukünftige Anwendungstrends von Pflanzenschutzmitteln.
Im Falle von möglicherweise interagierenden Pflanzenschutzmittelwirkstoffen wurde hinge- gen bislang keine Vorgehensweise für ihre Identifizierung etabliert. Es besteht somit weiter- hin der Bedarf an einer Anleitung zur Bildung von CAGs mit potenziell wechselwirkenden Substanzen. Ein solches Vorhaben gestaltet sich insbesondere aufgrund der Vielzahl an theo- retisch denkbaren Wirkstoffkombinationen als schwierig.
2 Aufgabenstellungen und Ziele der Arbeit
13 2 Aufgabenstellungen und Ziele der Arbeit
Lebensmittel können in unterschiedlichem Ausmaß mit Pflanzenschutzmittelrückständen be- lastet sein und gegebenenfalls Rückstände von zwei oder mehr Wirkstoffen aufweisen. Am häufigsten sind davon Lebensmittel pflanzlichen Ursprungs betroffen. In diesem Zusammen- hang besteht die Sorge, dass diese so genannten Mehrfachrückstände durch die in der Regel angewandte Einzelstoffbewertung auf Grundlage von MRL, ADI und ARfD nicht ausrei- chend auf ihr Gesamtrisiko eingeschätzt werden. Es wurden daher im Verlauf der letzten Jahre sowohl auf nationaler als auch internationaler Ebene verstärkt Anstrengungen unter- nommen, um grundsätzliche Vorgehensweisen sowie konkrete Konzepte für eine kumulative Risikobewertung von Pflanzenschutzmittelrückständen auszuarbeiten. Im Fokus dieser Bemü- hungen stehen bislang Mehrfachrückstände, deren Einzelwirkungen sich basierend auf dem Prinzip der Dosis-Additivität im Organismus addieren könnten.
Es gibt bisher keine empirischen Hinweise dahingehend, dass von Wirkstoffgemischen mit Einzelkonzentrationen unterhalb des NOAEL auch eine Gefahr durch synergistische Wechsel- wirkungen ausgehen könnte. Die EFSA betont allerdings, dass dies nicht grundsätzlich ausge- schlossen werden könne. Sie empfiehlt daher, eine individuelle Fall-zu-Fall-Bewertung durchzuführen, sobald es aus biologischer Sicht plausibel erscheint, dass auch niedrig konzen- trierte Wirkstoffe interagieren könnten.
Ein allgemein gültiges Konzept für die Identifizierung von möglicherweise interagierenden Substanzen wurde in diesem Zusammenhang aber bislang nicht vorgelegt. Einerseits begrün- det sich dies auf der Einschätzung, dass Interaktionen für eine Risikobewertung von Mehr- fachrückständen von untergeordneter Relevanz sind, doch andererseits erschwert insbeson- dere die Vielzahl an theoretisch denkbaren Wirkstoffkombinationen solche Bemühungen. Es ergaben sich daher für die vorliegende Arbeit drei Aufgabenstellungen:
1) Es sollten auf der Grundlage von aktuellen Daten über das Rückstandsvorkommen von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen in Obst- und Gemüse diejenigen Wirkstoffe identifiziert werden, die auf ein gleiches biologisches System einwirken und damit vermuten lassen, dass sie in Kombination interagieren könnten.
2) Die Auswahl sollte nach risikoorientierten Kriterien vorgenommen werden, die nicht nur die toxikologischen Eigenschaften der Substanzen, sondern auch die Exposition des Ver-
2 Aufgabenstellungen und Ziele der Arbeit
brauchers gegenüber diesen Stoffen berücksichtigen sollte. Auf diese Weise sollten Sub- stanzen ausgewählt werden, denen der Verbraucher über den Verzehr von Obst und Gemüse in erhöhtem Maße ausgesetzt ist.
3) Die ausgewählten Wirkstoffe sollten in einer geeigneten Zelllinie zunächst als Einzelsub- stanz hinsichtlich des Ausmaßes ihrer toxischen Wirkung und anschließend in binärer Kombination hinsichtlich des möglichen Auftretens einer Wechselwirkung untersucht werden.
Hauptziel dieser Arbeit war es somit, eine schrittweise Vorgehensweise zur Identifizierung potenziell interagierender Pflanzenschutzmittelwirkstoffe zu etablieren, in deren Folge eine zielgerichtete, experimentelle Untersuchung spezifischer Wirkstoffkombinationen ermöglicht wird. Es sollte hierdurch die theoretisch denkbare Fülle an möglicherweise wechselwirkenden Rückstandskombinationen auf eine für die Risikobewertung toxikologisch relevante sowie für die experimentelle Untersuchung praktikable Anzahl eingeschränkt werden.
3 Material und Methoden
15 3 Material und Methoden
3.1 Material 3.1.1 Geräte
Analysenwaage MC 210 P Sartorius, Göttingen
CO2-Inkubator CB 150 Binder, Tuttlingen
inverses Mikroskop Axiovert 25 CFL Zeiss, Jena
Kühlzentrifuge GS-6KR Beckman/Coulter, Krefeld
Magnetrührer RCTbasic IKA Labortechnik, Staufen
Mikroliter-Zentrifuge Biofuge pico Heraeus Instruments, Osterode Orbitalschüttler Titramax 100 T Heidolph, Schwabach
Photometer infinite® M200 Tecan Deutschland, Crailsheim Plattenzentrifuge Universal 320 Hettich Zentrifugen, Tuttlingen Präzisionswaage LP 2200P Sartorius, Göttingen
Reagenzglasschüttler REAX top Heidolph, Schwabach Reinstwasseranlage GenPure UV TKA, Niederelbert
Sterilbank LaminAir Modell 1.8 und 0.9 Heto-Holten, Gydevang, Dänemark Tischzentrifuge Universal 320 Hettich Zentrifugen, Tuttlingen
Vakuumpumpe (LABOPORT) KNF Neuberger GmbH, Freiburg
Wasserbad Typ 1013 GFL, Burgwedel
3.1.2 Laborhilfsmittel
5100 Cryo 1 °C Freezing Container,
„Mr. Frosty”
Nalgene® Labware (Thermo Fisher Scientific), Roskilde, Dänemark Einkanal-Pipetten mit variabler Volumen-
einstellung, Typ Reference, diverse Volumina
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf Mehrkanalpipette Transferpette®-8 (20-200 µL) Brand, Wertheim
Messpipetten aus Glas, diverse Volumina Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Pipettierhelfer accu-jet® pro Brand, Wertheim
Zählkammer Neubauer improved Hecht, Sondheim
3 Material und Methoden
3.1.3 Verbrauchsmaterialien
1,5 mL-Reakionsgefäße Prod.-Nr. 0030 120.086,
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
2,0 mL-Reaktionsgefäße Prod.-Nr. 0030 120.094,
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
15 mL-Röhrchen Prod.-Nr. 188 271,
Greiner Bio-One, Frickenhausen
50 mL-Röhrchen Prod.-Nr. 227 261,
Greiner Bio-One, Frickenhausen
75 cm2-Zellkulturflaschen Prod.-Nr. 156499, Nunc, Langenselbold 96-well-Gewebekulturplatte Prod.-Nr. 655 180,
Greiner Bio-One, Frickenhausen 96-well-PCR-Mikrotiterplatte Prod.-Nr. 410088,
Agilent Technologies, Böblingen Deckläser für Hämozytometer Menzel, Braunschweig
Filteraufsatz „rapid“ 500 Prod.-Nr. 99505, TPP, Ibbenbüren
Kryoröhrchen Cryo.sTM Prod.-Nr. 122261,
Greiner Bio-One, Frickenhausen Pasteurpipetten aus Natron-Kalk-Glas Prod.-Nr. 7477 20, Brand, Wertheim Pipettenspitzen TipOne®, diverse Volumina Starlab, Ahrensburg
saugfähige Papiertücher Prod.-Nr. 0087.1, Roth, Karlsruhe serologische Pipetten Stripette®,
diverse Volumina
Corning, Wiesbaden
3.1.4 Biochemikalien
Dimethylsulfoxid Prod.-Nr. A994.2, Roth, Karlsruhe
Triton X 100 Prod.-Nr. 3051.2, Roth, Karlsruhe
Trypanblau 0,5 % (w/v) Prod.-Nr. L6323, Biochrom, Berlin Trypsin/EDTA (0,05 %/0,02 %) Prod.-Nr. L2143, Biochrom, Berlin
3 Material und Methoden
17 3.1.5 Medium und Mediumzusätze
Penicillin/Streptomycin 10 000 E/10 000 µg/mL Prod.-Nr. A 2213, Biochrom, Berlin HEPES Pufferlösung (1 M) Prod.-Nr. L1613, Biochrom, Berlin Natriumbicarbonat (7,5 %-ig) Prod.-Nr. L1713, Biochrom, Berlin ITS+TM Premix Universal Culture Supplement Prod.-Nr. 354352,
BD Biosciences, Heidelberg
NuSerumTM Prod.-Nr. 355500,
BD Biosciences, Heidelberg
DMEM/Ham’s F-12 Pulvermedium Prod.-Nr. T481-01, Biochrom, Berlin Serum Replacement 3 (50x) Prod.-Nr. S2640, Sigma-Aldrich,
Schnelldorf
Ultroser® SF Prod.-Nr. 12039-012,
Pall, Cergy, Frankreich
3.1.5.1 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Pufferlösungen Basalmedium DMEM/Ham’s F-12:
12,12 g DMEM/Ham’s F-12 Pulvermedium 20 mL HEPES Pufferlösung (1 M)
20 mL Natriumbicarbonat (7,5 %-ig) Aqua dest. (autoklaviert) ad 1 Liter
H295R-Erhaltungsmedium:
500 mL DMEM/Ham’s F-12 12,5 mL NuSerumTM
5 mL Penicillin/Streptomycin (10 000 E/10 000 µg/mL) 5 mL ITS+TM Premix Universal Culture Supplement
H295R-Einfriermedium:
7,5 mL H295R-Erhaltungsmedium 1,5 mL NuSerumTM
1 mL Dimethylsulfoxid
3 Material und Methoden
H295R- Behandlungsmedium:
DMEM/Ham’s F-12 2 % Ultroser® SF 0,1 % Dimethylsulfoxid
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS):
8,0 g Natriumchlorid (NaCl) 0,2 g Kaliumchlorid (KCl)
1,44 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) 0,24 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Aqua dest. ad 1 Liter
pH 7,4
3.1.6 Testsubstanzen
Azoxystrobin CAS Nr. 131860-33-8 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Captan CAS Nr. 133-06-2 Sigma-Aldrich, Schnelldorf
Cyprodinil CAS Nr. 121552-61-2 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Iprodion CAS Nr. 36734-19-7 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Kresoxim-methyl CAS Nr. 143390-89-0 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Methomyl CAS Nr. 16752-77-5 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Myclobutanil CAS Nr. 88671-89-0 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg Procymidon CAS Nr. 32809-16-8 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg Pyrimethanil CAS Nr. 53112-28-0 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg Tebuconazol CAS Nr. 107534-96-3 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
3.1.7 Kontrollsubstanzen
4-OH-Androstendion CAS Nr. 566-48-3 Sigma-Aldrich, Schnelldorf 8-Br-cAMP-Na CAS Nr. 76939-46-3 Sigma-Aldrich, Schnelldorf
Estron CAS Nr. 53-16-7 Sigma-Aldrich, Schnelldorf
3 Material und Methoden
19 3.1.8 Zelllinie H295R
Für die In-vitro-Versuche wurde die H295R-Zelllinie (Prod.-Nr. CRL-2128, ATCC, Manassas, VA, USA) verwendet, die eine Subpopulation der von GAZDAR et al. (1990) etablierten NCI-H295-Zelllinie ist. Sie stammen ursprünglich von Zellen eines humanen Nebennierenrindenkarzinoms ab und weisen Merkmale pluripotenter, zonal undifferenzierter, fetaler Nebennierenzellen auf. H295R-Zellen bilden daher nicht nur adrenale Steroidhormone wie Mineralo- und Glucocorticoide, sondern auch steroidale Geschlechtshormone, darunter Estron (STAELS et al. 1993; RAINEY et al. 1994; GRACIA et al. 2006; HECKER et al.
2006). Mit dieser Zelllinie können Testsubstanzen identifiziert werden, die die Bildung von Steroidhormonen beeinflussen. Es wurde daher ein mit den H295R-Zellen entwickelter Steroidgenese-Assay als Screening-Methode in die Testbatterie für die erste Stufe des Endocrine Disruptor Screening Program der EPA aufgenommen (HECKER u. GIESY 2008;
EPA 2009).
3.1.9 Estron-ELISA
Als empfindliche Bestimmungsmethode im pg/mL-Bereich wurde für die Quantifizierung des Estrongehaltes im Zellüberstand der H295R-Zellen ein Enzym-gekoppelter Immunadsorp- tionsassay verwendet (Prod.-Nr. EIA-4174, DRG Instruments, Marburg).
3.1.10 CytoTox-ONETM Homogeneous Membrane Integrity Assay
Für die indirekte Bestimmung der Zellzahl und der Zytotoxizität wurde der CytoTox-ONETM Homogeneous Membrane Integrity Assay (Prod.-Nr. G7891, Promega, Mannheim) angewen- det, welcher auf der Messung von Laktatdehydrogenase (LDH) beruht. Durch Kontrolle der beiden Parameter sollte ausgeschlossen werden, dass die Testsubstanzen durch unspezifische Einflussnahme auf das Wachstum und die Vitalität der H295R-Zellen den Estrongehalt verändern.
3 Material und Methoden
3.1.11 Rückstandsdaten
Als Grundlage für die Auswahl der Testsubstanzen dienten Untersuchungsergebnisse von Obst- und Gemüseproben aus dem Jahr 2006, in denen Rückstände von Pflanzenschutz- mittelwirkstoffen nachgewiesen worden waren. Es handelte sich dabei um Plan- und Monito- ringproben, die vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittel- sicherheit (LAVES) am Lebensmittelinstitut Oldenburg nach den üblichen amtlichen Analysemethoden im Rahmen der amtlichen Lebensmittelüberwachung und spezifischer Untersuchungsprogramme untersucht wurden. Sie umfassten insgesamt 3642 Einzelrück- standsbefunde von mehr als 160 Wirkstoffen, die in 1000 Lebensmittelproben von mehr als 70 verschiedenen Obst- und Gemüsesorten nachgewiesen worden waren.
Darüber hinaus wurden bei der Beantwortung der Frage, welche binären Wirkstoffkombina- tionen im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden sollen, Rückstandsdaten aus den Jahren 2005 bis einschließlich 2008 ausgewertet. Diese wurden ebenfalls vom Lebensmittelinstitut Oldenburg des LAVES zur Verfügung gestellt und umfassten Analysedaten von insgesamt 2945 Obst- und Gemüseproben, in denen Rückstände von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen nachgewiesen worden waren.
3.2 Methoden 3.2.1 Zellkultur
3.2.1.1 Dauerkultivierung der H295R-Zellen
Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 %-iger Kohlenstoffdioxid-Atmosphäre in 75 cm2-Zellkul- turflaschen in 20 mL ihres spezifischen Erhaltungsmediums inkubiert. Basis des Erhaltungs- mediums war DMEM/Ham’s F-12, welches im Labor unter sterilen Bedingungen selbst her- gestellt und anschließend mit einer Porengröße von 0,22 µm steril filtriert wurde. Darüber hinaus enthielt das Erhaltungsmedium Zusätze an Insulin, Transferrin und Selen (ITS+TM Premix) sowie Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) und wurde mit dem Serumersatz NuSerumTM supplementiert, welches zu 25 % aus Serum neugeborener Kälber besteht.
3 Material und Methoden
21
Jeden 2. bis 3. Tag wurde ein kompletter Mediumwechsel durchgeführt. Die Passagierung der Zellen erfolgte bei einer Konfluenz von 60 bis 80 %. Hierfür wurde das Medium abgesaugt und die Zellen in 5 mL PBS gewaschen. Nach Absaugen der Pufferlösung erfolgte die Ablö- sung der Zellen unter 2-minütiger Einwirkung von 2,5 mL einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,05 %/0,02 %) bei 37 °C. Der Trypsinisierungserfolg wurde mikroskopisch kontrolliert und durch leichtes Klopfen auf die Zellkulturflasche beschleunigt. Nach Zugabe von 7,5 mL Medium wurde die Zellsuspension bei 200 x g fünf Minuten zentrifugiert, der Überstand ver- worfen und das Zellpellet vorsichtig in einem definierten Mediumvolumen resuspendiert.
Ein 20 µL-Aliquot der Zellsuspension wurde mit 180 µL einer 0,5 %-igen (w/v) Trypanblau- Lösung vermischt und die Zahl der vitalen Zellen mithilfe einer Neubauerzählkammer bestimmt. Es wurden durchschnittlich 3,5 bis 4 Mio. Zellen – dies entsprach einem Splitting- Verhältnis von ungefähr 1:5 – in eine neue Zellkulturflasche mit 20 mL frischem Erhaltungs- medium überführt. Die Zellen wurden durchschnittlich fünf bis sechs Tage nach der Aussaat erneut passagiert.
3.2.1.2 Gefrierkonservierung der H259R-Zellen
Die Ausgangspassagezahl der Zellen war bei Erhalt durch die American Type Culture Collection (ATCC) nicht bekannt. Es wurde daher im eigenen Labor mit der Zählung der Zellpassagen neu begonnen.
Um eine große Zahl von Zellen mit niedriger Passagezahl zur Verfügung zu haben, wurden Zellaliquots in flüssigem Stickstoff gelagert. Um diese zu erhalten, wurden die Zellen zu- nächst nach gewohntem Protokoll aus der Zellkulturflasche gelöst und mittels Neubauerzähl- kammer gezählt (s. Kap. 3.2.1.1). Anschließend wurde eine Zellsuspension mit 5 Mio. Zellen in ein 2 mL-Kryoröhrchen überführt und H295R-Einfriermedium im Verhältnis 1:2 hinzuge- fügt. Die Kryoröhrchen wurden in eine vorgekühlte Einfrierbox gegeben und darin einige Tage bei -80 °C gelagert. Für eine langfristige Aufbewahrung wurden die Kryoröhrchen in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff umgelagert.
Kryokonservierte Zellen wurden für den Beginn einer neuen Kultivierungsphase im Wasser- bad bei 37 °C aufgetaut. Anschließend wurden sie zügig in ein 50 mL-Röhrchen mit 20 mL Erhaltungsmedium überführt. Nach vorsichtigem Resuspendieren der Zellen wurde die
3 Material und Methoden
gesamte Zellsuspension in eine neue Zellkulturflasche pipettiert. In der Regel wurden zwei Kryoröhrchen für eine Zellkulturflasche aufgetaut.
3.2.1.3 Behandlung der H295R-Zellen mit Einzelsubstanzen
Von jeder Testsubstanz wurde unter Berücksichtigung des jeweiligen Reinheitsgrads eine Stammlösung mit Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereitet, diese aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Die Konzentrationen der Stammlösungen lagen je nach Testsubstanz und Versuchs- phase (Kombinationsversuche miteinbezogen) zwischen 30 und 200 mM, d. h. je nach Wirk- stoff zwischen 12,2 und 40,3 mg/mL.
Die Aliquots wurden am Tag der Behandlung der Zellen mit Behandlungsmedium verdünnt.
Nach den Verdünnungsschritten betrug die Endkonzentration an DMSO im Medium maximal 0,1 % (v/v). Die H295R-Zellen wurden mit den zehn verschiedenen Einzelsubstanzen in jeweils acht Konzentrationen behandelt: 0,01 µM; 0,1 µM; 0,3 µM; 1 µM; 3 µM; 10 µM;
30 µM und 100 µM. Von Azoxystrobin konnte aufgrund des Lösungsverhaltens in wässriger Lösung eine 100 µM-Lösung nicht hergestellt werden.
3.2.1.4 Behandlung der H295R-Zellen mit binären Wirkstoffkombinationen
Von den zehn Testsubstanzen wurden im Rahmen der Kombinationsversuche fünf Wirkstoffe untersucht: Azoxystrobin, Cyprodinil, Myclobutanil, Procymidon und Pyrimethanil. Von jeder dieser Substanzen wurden jeweils drei Konzentrationen ausgewählt und in binärer Kombination an den H295R-Zellen getestet. Die Wahl der Wirkstoffkonzentrationen erfolgte in Anlehnung an die in dieser Arbeit ermittelten Dosis-Wirkung-Beziehungskurven. In Abb.
3-1 ist dies beispielhaft für den Wirkstoff Myclobutanil gezeigt. Es handelte sich bei den ausgewählten Konzentrationen um die Konzentration ohne Effekt, mit mittlerem Effekt und mit maximalem Effekt.
Die „Konzentration ohne Effekt“ entsprach dem NOAEL-Wert (= No observed adverse effect level), d. h. der Konzentration, bei der bezüglich des Estrongehaltes noch kein nennenswerter Unterschied zur Kontrolle und zu niedrigeren Wirkstoffkonzentrationen beobachtet wurde.
3 Material und Methoden
23
1 10 100
-100 -80 -60 -40 -20 0 20
0,01 0,1 K. ohne
Effekt
K. mit mittlerem
Effekt
K. mit maximalem
Effekt
Myclobutanil (µM) Veränderung des Estrongehaltes (%)
Abb. 3-1. Darstellung der drei Konzentrationen, die für die Kombinationsver- suche ausgewählt wurden, am Beispiel von Myclobutanil. – Es sind die prozentualen Ver- änderungen des Estrongehaltes im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (= 0 %) als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben (n = 3). K = Kon- zentration.
Bei der „Konzentration mit mittlerem Effekt“ handelte es sich näherungsweise um den EC50- Wert, d. h. um die Wirkstoffkonzentration, bei welcher ein halbmaximaler Effekt erzielt wurde (EC50 = mittlere effektive Konzentration). Eine genaue Berechnung der EC50 wurde nicht vorgenommen, um in den Kombinationsversuchen aus Gründen der Vergleichbarkeit der Ergebnisse die gleichen Konzentrationen wie in den Einzelstoffversuchen anzuwenden.
Bei der „Konzentration mit maximalem Effekt“ wurde hinsichtlich des Estrongehaltes nach Behandlung der H295R-Zellen mit der entsprechenden Wirkstoffkonzentration die größte Veränderung festgestellt. Im Falle von Myclobutanil wurden allerdings 30 µM als die
„Konzentration mit maximalem Effekt“ festgesetzt, obwohl die durchschnittlich höchste Estronabnahme erst bei 100 µM gemessen wurde (s. Abb. 3-1). Diese Entscheidung lag darin begründet, dass sich der inhibitorische Effekt bei einer Erhöhung der Myclobutanil-Konzen- tration um mehr als 200 % lediglich um durchschnittlich 5 % verstärkt. Mit Rücksicht auf die Kombinationsversuche, in denen zwei Wirkstoffe auch in ihrer jeweils höchsten Konzentra- tion miteinander kombiniert wurden, wurden daher 30 µM Myclobutanil als die „Konzentra- tion mit maximalem Effekt“ bevorzugt. Es sollte vermieden werden, dass durch die Kombina- tion zweier Wirkstoffe zytotoxische Effekte hervorgerufen werden.
In Tab. 3-1 ist zusammengefasst, welche drei Konzentrationen von den jeweiligen Stoffen, die in den Kombinationsversuchen getestet wurden, ausgewählt wurden.
3 Material und Methoden
Tab. 3-1. Konzentrationen der Pflanzenschutzmittelwirkstoffe, die in den Kombinationsversuchen getestet wurden. – Mit „Effekt“ wird die prozentuale Veränderung des Estrongehaltes nach Behandlung der H295R-Zellen mit den Wirkstoffen bezeichnet. Konzentration ohne Effekt = NOAEL; Konzentration mit mittlerem Effekt = EC50-Wert (näherungsweise, keine genaue Berechnung); Konzentration mit maximalem Effekt = Konzentration mit größter messbarer Veränderung des Estrongehaltes.
Wirkstoff
ohne Effekt mit mittlerem Effekt mit maximalem Effekt
Azoxystrobin 3 10 30
Cyprodinil 0,1 10 30
Myclobutanil 0,01 1 30
Procymidon 3 10 30
Pyrimethanil 3 30 100
Konzentration (µM)
Die drei Konzentrationen zweier Wirkstoffe wurden in neun verschiedenen Konzentrations- verhältnissen miteinander kombiniert (s. Tab. 3-2). Am Tag der Behandlung der Zellen wur- den die einzelnen Wirkstoffkonzentrationen zunächst separat voneinander als doppelt konzen- trierte Lösungen vorbereitet. Hierfür wurde jeweils ein Aliquot der in DMSO angesetzten Stammlösungen mit Behandlungsmedium verdünnt. Die Endkonzentration an DMSO im Medium betrug nach den Verdünnungsschritten maximal 0,1 % (v/v). Zwei Wirkstofflö- sungen wurden anschließend im Verhältnis 1:2 zunächst miteinander vermischt, bevor sie auf die H295R-Zellen appliziert wurden.
Tab. 3-2. Kombinationsquadrat für die Herstellung binärer Wirkstoffkombinationen. – Von jeder Substanz, die in den Kombinationsversuchen getestet wurde, wurden in Anlehnung an die jeweilige Dosis- Wirkung-Beziehungskurve drei Konzentrationen festgelegt (s. Tab. 3-1) und mit einer zweiten Substanz in neun verschiedenen Konzentrationsverhältnissen kombiniert. Die hier genannten Bezeichnungen für die einzelnen Kombinationen werden auch im Ergebnisteil dieser Arbeit angewendet.
ohne Effekt
mit mittlerem
Effekt
mit maximalem
Effekt
ohne Effekt A1 B1 C1
mit mittlerem Effekt A2 B2 C2
mit maximalem Effekt A3 B3 C3
Konzentration des Wirkstoffes 1
Konzentration des Wirkstoffes 2
3 Material und Methoden
25
3.2.1.5 Allgemeines Behandlungsprotokoll der H295R-Zellen
Die Zellen wurden nach dem Auftauen mindestens fünfmal passagiert, bevor sie für die Ver- suche Anwendung fanden. An maximal acht aufeinander folgenden Zellpassagen und höchs- tens bis zur Passagenummer sechzehn wurden die Experimente in 96-well-Gewebekultur- platten durchgeführt.
Zunächst wurden die Zellen nach gewohntem Protokoll (s. Kap. 3.2.1.1) aus der Zellkultur- flasche gelöst. Anschließend wurden im Rahmen der Einzelstoffversuche 35 000 Zellen pro Well und im Rahmen der Kombinationsversuche 25 000 Zellen pro Well in einem Volumen von jeweils 150 µL auf die Platte ausgesät.
Die Reduktion der Zellzahl bei den Kombinationsversuchen war eine Konsequenz, die aus den Einzelstoffversuchen gezogen wurde: Es zeigte sich, dass in einigen Fällen die Estronge- halte von Zellüberständen, deren Zellen zuvor mit hohen Konzentrationen stimulatorisch wirksamer Testsubstanzen behandelt worden waren, außerhalb der Kalibrierkurve für die quantitative Estronbestimmung lagen. Die entsprechenden Ansätze mussten daher wiederholt werden, da generell keine Probenverdünnungen bei der Durchführung des Estron-ELISAs vorgenommen wurden. Es wurde daher bei Durchführung der Kombinationsversuche eine niedrigere Zellzahl gewählt, um zu vermeiden, dass die gleiche Problematik insbesondere bei Kombinationen mit zwei stimulatorisch wirksamen Testsubstanzen verstärkt auftritt.
In die äußeren Wells der Testplatte wurden jeweils 150 µL PBS pipettiert. An die Zellaussaat schloss sich eine 24-stündige Inkubation bei 37 °C und 5 %-iger Kohlenstoffdioxid- Atmosphäre an.
Am folgenden Tag wurden unmittelbar vor der Behandlung der Zellen die verschiedenen Konzentrationslösungen der Testsubstanzen durch Verdünnung mit Behandlungsmedium her- gestellt. Die Zellen wurden mikroskopisch auf den Konfluenzgrad und das Vorhandensein morphologischer Veränderungen oder Kontaminationen kontrolliert, bevor das Erhaltungs- medium mittels einer Pasteurpipette vorsichtig abgesaugt und durch die vorbereiteten Wirk- stofflösungen ersetzt wurde. Bei einer erneuten mikroskopischen Kontrolle der Wells wurde geprüft, ob die Wirkstoffe in wässriger Lösung (= Zellmedium) auskristallisierten. Es schloss sich eine Inkubationszeit der Testplatte für weitere 24 Stunden bei 37 °C und 5 %-iger Kohlenstoffdioxid-Atmosphäre an.
3 Material und Methoden
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen zunächst mikroskopisch auf etwaige Besonderheiten untersucht. Dann wurde für die quantitative Estronbestimmung mittels ELISA ein Teilvolumen (70 µL) der Zellüberstände entnommen und bei -20 °C eingelagert. Das Restmedium wurde für die LDH-Messungen zur indirekten Bestimmung der Zellzahl und der Zytotoxizität verwendet.
Auf jeder Testplatte wurden neben den Testbehandlungen auch eine Blank-Kontrolle ohne Zellen, eine Lösungsmittelkontrolle (= Negativkontrolle) sowie zwei Positivkontrollen (1 µM 4-OH-Androstendion (Inhibitor der Estronbiosynthese) und 100 µM 8-Br-cAMP-Na (Stimu- lator der Estronbiosynthese)) mitgeführt. Die DMSO-Konzentration betrug in allen Lösungen maximal 0,1 % (v/v). Alle Ansätze wurden in Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Einzel- stoffversuche wurden zweimal und die Kombinationsversuche viermal wiederholt.
3.2.2 Untersuchungen mittels Estron-ELISAs 3.2.2.1 Testprinzip des Estron-ELISAs
Das Testprinzip beruht auf der kompetitiven Bindung von Estron und eines Estron-Tracers (Marker) an spezifische Antikörper, die fest an den Wellboden der ELISA-Platte gebunden sind. Das sich in der Probe befindliche Estron der H295R-Zellen konkurriert dabei mit dem Marker aus einer zugesetzten Enzymkonjugatlösung um die freien Bindungsstellen der Anti- körper. Der Marker ist mit einem Enzym (Meerrettichperoxidase) verbunden, welches das zunächst farblose Substrat Tetramethylbenzidin zu einem blauen Farbstoff oxidiert.
Vor Zugabe der Substratlösung wird das Well mehrmals gewaschen, um sicherzustellen, dass nur Markermoleküle, die an Antikörper gebunden sind, an der Farbumsetzung beteiligt sind.
Durch spektroskopische Bestimmung der Farbstoffkonzentration bei 450 nm können an- schließend Rückschlüsse auf die Höhe des Estrongehaltes in der Probe gemacht werden: Je mehr Antikörper-gebundene Markermoleküle vorhanden sind, desto mehr blauer Farbstoff wird aus dem farblosen Substrat generiert. Je intensiver die Blaufärbung des Reaktions- mediums, desto höher der Extinktionswert. Im Umkehrschluss bedeutet dies wiederum: Je höher der Messwert, desto weniger native Estron-Moleküle der H295R-Zellen sind in der Probe vorhanden. Der von den Zellen gebildete Estrongehalt verhält sich somit umgekehrt proportional zum Extinktionswert.
3 Material und Methoden
27 3.2.2.2 Matrixkalibrierung
In der vorliegenden Arbeit sollte der Estrongehalt im Zellüberstand bestimmt werden, d. h.
bei der Untersuchungsmatrix handelte es sich um Zellmedium. Der anzuwendende Estron- ELISA ist aber nur für die Untersuchung von Serum- und Plasmaproben validiert, was bedeutet, dass die mitgelieferten Estron-Standards in Serum gelöst sind. Es musste daher vor Einsatz der Testmethode überprüft werden, ob sich die Messwerte in Abhängigkeit des Lösungsmittels (Serum oder Zellmedium) in ihrer Höhe wesentlich voneinander unterschei- den.
Hierfür wurde zunächst eine 1 mg/mL-Estron-Stammlösung unter Berücksichtigung des Rein- heitsgrads in DMSO angesetzt. Durch anschließende Verdünnung mit Behandlungsmedium wurden daraus Estronkonzentrationen hergestellt, die den mitgelieferten Standardkonzentra- tionen des Testkits entsprachen (0, 15, 50, 200, 800 und 2 000 pg/mL Estron). Die selbst her- gestellten Estronkonzentrationen und die Estronstandards des Testkits wurden parallel auf derselben ELISA-Platte gemäß Protokoll (s. Kap. 3.2.2.4) behandelt und hinsichtlich ihrer Messwerte miteinander verglichen. In Abb. 3-2 sind die Extinktionswerte dieses Vergleiches dargestellt (0 pg/mL Estron ist bei dieser graphischen Darstellung nicht berücksichtigt).
0 0,5 1 1,5 2
10 100 1000 10000
Estron (pg/mL)
Extinktion (450 nm)
in Serum gelöst in Zellmedium gelöst
Abb. 3-2. Extinktionswerte verschiedener Estronkonzentrationen in Abhängigkeit des Lösungs- mittels. – Die Estronstandards des kommerziell erhältlichen Estron-ELISA-Testkits sind in Serum gelöst. Zum Vergleich wurde mit Estron eine Matrixkalibrierung in Zellmedium durchgeführt (n = 1, Doppelbestimmung, Angabe der Mittelwerte).
