3 Material und Methoden
3.1 Material
Analysenwaage MC 210 P Sartorius, Göttingen
CO2-Inkubator CB 150 Binder, Tuttlingen
inverses Mikroskop Axiovert 25 CFL Zeiss, Jena
Kühlzentrifuge GS-6KR Beckman/Coulter, Krefeld
Magnetrührer RCTbasic IKA Labortechnik, Staufen
Mikroliter-Zentrifuge Biofuge pico Heraeus Instruments, Osterode Orbitalschüttler Titramax 100 T Heidolph, Schwabach
Photometer infinite® M200 Tecan Deutschland, Crailsheim Plattenzentrifuge Universal 320 Hettich Zentrifugen, Tuttlingen Präzisionswaage LP 2200P Sartorius, Göttingen
Reagenzglasschüttler REAX top Heidolph, Schwabach Reinstwasseranlage GenPure UV TKA, Niederelbert
Sterilbank LaminAir Modell 1.8 und 0.9 Heto-Holten, Gydevang, Dänemark Tischzentrifuge Universal 320 Hettich Zentrifugen, Tuttlingen
Vakuumpumpe (LABOPORT) KNF Neuberger GmbH, Freiburg
Wasserbad Typ 1013 GFL, Burgwedel
3.1.2 Laborhilfsmittel
5100 Cryo 1 °C Freezing Container,
„Mr. Frosty”
Nalgene® Labware (Thermo Fisher Scientific), Roskilde, Dänemark Einkanal-Pipetten mit variabler
Volumen-einstellung, Typ Reference, diverse Volumina
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf Mehrkanalpipette Transferpette®-8 (20-200 µL) Brand, Wertheim
Messpipetten aus Glas, diverse Volumina Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Pipettierhelfer accu-jet® pro Brand, Wertheim
Zählkammer Neubauer improved Hecht, Sondheim
3 Material und Methoden
3.1.3 Verbrauchsmaterialien
1,5 mL-Reakionsgefäße Prod.-Nr. 0030 120.086,
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
2,0 mL-Reaktionsgefäße Prod.-Nr. 0030 120.094,
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
15 mL-Röhrchen Prod.-Nr. 188 271,
Greiner Bio-One, Frickenhausen
50 mL-Röhrchen Prod.-Nr. 227 261,
Greiner Bio-One, Frickenhausen
75 cm2-Zellkulturflaschen Prod.-Nr. 156499, Nunc, Langenselbold 96-well-Gewebekulturplatte Prod.-Nr. 655 180,
Greiner Bio-One, Frickenhausen 96-well-PCR-Mikrotiterplatte Prod.-Nr. 410088,
Agilent Technologies, Böblingen Deckläser für Hämozytometer Menzel, Braunschweig
Filteraufsatz „rapid“ 500 Prod.-Nr. 99505, TPP, Ibbenbüren
Kryoröhrchen Cryo.sTM Prod.-Nr. 122261,
Greiner Bio-One, Frickenhausen Pasteurpipetten aus Natron-Kalk-Glas Prod.-Nr. 7477 20, Brand, Wertheim Pipettenspitzen TipOne®, diverse Volumina Starlab, Ahrensburg
saugfähige Papiertücher Prod.-Nr. 0087.1, Roth, Karlsruhe serologische Pipetten Stripette®,
diverse Volumina
Corning, Wiesbaden
3.1.4 Biochemikalien
Dimethylsulfoxid Prod.-Nr. A994.2, Roth, Karlsruhe
Triton X 100 Prod.-Nr. 3051.2, Roth, Karlsruhe
Trypanblau 0,5 % (w/v) Prod.-Nr. L6323, Biochrom, Berlin Trypsin/EDTA (0,05 %/0,02 %) Prod.-Nr. L2143, Biochrom, Berlin
3 Material und Methoden
17 3.1.5 Medium und Mediumzusätze
Penicillin/Streptomycin 10 000 E/10 000 µg/mL Prod.-Nr. A 2213, Biochrom, Berlin HEPES Pufferlösung (1 M) Prod.-Nr. L1613, Biochrom, Berlin Natriumbicarbonat (7,5 %-ig) Prod.-Nr. L1713, Biochrom, Berlin ITS+TM Premix Universal Culture Supplement Prod.-Nr. 354352,
BD Biosciences, Heidelberg
NuSerumTM Prod.-Nr. 355500,
BD Biosciences, Heidelberg
DMEM/Ham’s F-12 Pulvermedium Prod.-Nr. T481-01, Biochrom, Berlin Serum Replacement 3 (50x) Prod.-Nr. S2640, Sigma-Aldrich,
Schnelldorf
Ultroser® SF Prod.-Nr. 12039-012,
Pall, Cergy, Frankreich
3.1.5.1 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Pufferlösungen Basalmedium DMEM/Ham’s F-12:
12,12 g DMEM/Ham’s F-12 Pulvermedium 20 mL HEPES Pufferlösung (1 M)
20 mL Natriumbicarbonat (7,5 %-ig) Aqua dest. (autoklaviert) ad 1 Liter
H295R-Erhaltungsmedium:
500 mL DMEM/Ham’s F-12 12,5 mL NuSerumTM
5 mL Penicillin/Streptomycin (10 000 E/10 000 µg/mL) 5 mL ITS+TM Premix Universal Culture Supplement
H295R-Einfriermedium:
7,5 mL H295R-Erhaltungsmedium 1,5 mL NuSerumTM
1 mL Dimethylsulfoxid
3 Material und Methoden
H295R- Behandlungsmedium:
DMEM/Ham’s F-12 2 % Ultroser® SF 0,1 % Dimethylsulfoxid
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS):
8,0 g Natriumchlorid (NaCl) 0,2 g Kaliumchlorid (KCl)
1,44 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) 0,24 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Aqua dest. ad 1 Liter
pH 7,4
3.1.6 Testsubstanzen
Azoxystrobin CAS Nr. 131860-33-8 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Captan CAS Nr. 133-06-2 Sigma-Aldrich, Schnelldorf
Cyprodinil CAS Nr. 121552-61-2 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Iprodion CAS Nr. 36734-19-7 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Kresoxim-methyl CAS Nr. 143390-89-0 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Methomyl CAS Nr. 16752-77-5 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
Myclobutanil CAS Nr. 88671-89-0 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg Procymidon CAS Nr. 32809-16-8 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg Pyrimethanil CAS Nr. 53112-28-0 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg Tebuconazol CAS Nr. 107534-96-3 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg
3.1.7 Kontrollsubstanzen
4-OH-Androstendion CAS Nr. 566-48-3 Sigma-Aldrich, Schnelldorf 8-Br-cAMP-Na CAS Nr. 76939-46-3 Sigma-Aldrich, Schnelldorf
Estron CAS Nr. 53-16-7 Sigma-Aldrich, Schnelldorf
3 Material und Methoden
19 3.1.8 Zelllinie H295R
Für die In-vitro-Versuche wurde die H295R-Zelllinie (Prod.-Nr. CRL-2128, ATCC, Manassas, VA, USA) verwendet, die eine Subpopulation der von GAZDAR et al. (1990) etablierten NCI-H295-Zelllinie ist. Sie stammen ursprünglich von Zellen eines humanen Nebennierenrindenkarzinoms ab und weisen Merkmale pluripotenter, zonal undifferenzierter, fetaler Nebennierenzellen auf. H295R-Zellen bilden daher nicht nur adrenale Steroidhormone wie Mineralo- und Glucocorticoide, sondern auch steroidale Geschlechtshormone, darunter Estron (STAELS et al. 1993; RAINEY et al. 1994; GRACIA et al. 2006; HECKER et al.
2006). Mit dieser Zelllinie können Testsubstanzen identifiziert werden, die die Bildung von Steroidhormonen beeinflussen. Es wurde daher ein mit den H295R-Zellen entwickelter Steroidgenese-Assay als Screening-Methode in die Testbatterie für die erste Stufe des Endocrine Disruptor Screening Program der EPA aufgenommen (HECKER u. GIESY 2008;
EPA 2009).
3.1.9 Estron-ELISA
Als empfindliche Bestimmungsmethode im pg/mL-Bereich wurde für die Quantifizierung des Estrongehaltes im Zellüberstand der H295R-Zellen ein Enzym-gekoppelter Immunadsorp-tionsassay verwendet (Prod.-Nr. EIA-4174, DRG Instruments, Marburg).
3.1.10 CytoTox-ONETM Homogeneous Membrane Integrity Assay
Für die indirekte Bestimmung der Zellzahl und der Zytotoxizität wurde der CytoTox-ONETM Homogeneous Membrane Integrity Assay (Prod.-Nr. G7891, Promega, Mannheim) angewen-det, welcher auf der Messung von Laktatdehydrogenase (LDH) beruht. Durch Kontrolle der beiden Parameter sollte ausgeschlossen werden, dass die Testsubstanzen durch unspezifische Einflussnahme auf das Wachstum und die Vitalität der H295R-Zellen den Estrongehalt verändern.
3 Material und Methoden
3.1.11 Rückstandsdaten
Als Grundlage für die Auswahl der Testsubstanzen dienten Untersuchungsergebnisse von Obst- und Gemüseproben aus dem Jahr 2006, in denen Rückstände von Pflanzenschutz-mittelwirkstoffen nachgewiesen worden waren. Es handelte sich dabei um Plan- und Monito-ringproben, die vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittel-sicherheit (LAVES) am Lebensmittelinstitut Oldenburg nach den üblichen amtlichen Analysemethoden im Rahmen der amtlichen Lebensmittelüberwachung und spezifischer Untersuchungsprogramme untersucht wurden. Sie umfassten insgesamt 3642 Einzelrück-standsbefunde von mehr als 160 Wirkstoffen, die in 1000 Lebensmittelproben von mehr als 70 verschiedenen Obst- und Gemüsesorten nachgewiesen worden waren.
Darüber hinaus wurden bei der Beantwortung der Frage, welche binären Wirkstoffkombina-tionen im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden sollen, Rückstandsdaten aus den Jahren 2005 bis einschließlich 2008 ausgewertet. Diese wurden ebenfalls vom Lebensmittelinstitut Oldenburg des LAVES zur Verfügung gestellt und umfassten Analysedaten von insgesamt 2945 Obst- und Gemüseproben, in denen Rückstände von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen nachgewiesen worden waren.
3.2 Methoden