Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3

Im zweiten Versuch zur Etablierung wurde der zeitliche Verlauf der Kolonisation, Infektion und der fäkalen Ausscheidung nach einer oralen Infektion mit

Gruppe A Gruppe B Gruppe C

Y. enterocolitica untersucht. Zwölf Minipig-Ferkel im Alter von fünf bis sieben Wochen [vgl. B.2.1] wurden mit je 10⁹ KBE YeO:3 Stamm Y1 infiziert [vgl. B.2.3].

Erwartungsgemäß zeigten auch diese Tiere keine klinischen Symptome. Je drei Tiere wurden am dritten, siebten, vierzehnten und einundzwanzigsten Tag post infectionem (p.i.) euthanasiert und seziert. Vier zusätzliche Tiere fungierten als Kontrollgruppe. Diese wurden separat aufgestallt, mit sterilem PBS „pseudoinfiziert“

und am 21. Tag p.i. seziert [vgl. B.2.2]. Mit Ausnahme des Rectums wurden von allen Tieren die gleichen Organe beprobt wie in der vorangegangenen Studie [vgl. C.1.1].

Alle Organproben wurden sowohl quantitativ als auch qualitativ untersucht, Rektal-, Tonsillentupfer und Kotproben hingegen nur qualitativ mittels Kälteanreicherung [vgl. B.1.3 bis B.1.5]. Zusätzlich wurden einmal wöchentlich Serumproben genommen und mit einem kommerziellen ELISA (PIGTYPE® YOPSCREEN) auf Antikörper gegen pathogene Yersinien untersucht [vgl. B.2.7].

Das Ileum und die mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales) jedes Tieres wurden pathologisch-histologisch untersucht [vgl. B.2.6].

C.1.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere

Auch in dieser Infektionsstudie zeigten weder die infizierten noch die Kontrolltiere klinische Symptome wie Fieber oder Diarrhoe. Sowohl vor als auch nach der Infektion konnten allerdings bei allen Tieren abweichende Befunde im Blutbild erfasst werden, diese wiesen jedoch nicht deutlich auf eine akute bakterielle Infektion hin [vgl. H.1].

C.1.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung

In den Sektionen wurden ebenfalls nur unspezifische, größtenteils geringgradige Befunde erhoben. Vergrößerte Darmlymphknoten und Anzeichen einer GALT-Hyperplasie konnten sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren beobachtet werden [vgl. H.2].

C.1.2.3 Histopathologische Beurteilung

Die histologische Untersuchung wurde in allen Versuchen in Kooperation mit Dr.

Frauke Seehusen aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Auch hier zeigten sich fast ausschließlich unspezifische Veränderungen, die auch in der nicht infizierten Kontrollgruppe auftraten. Im Ileum traten ggr. Nekrosen, Zottenveränderungen, Verluste von Epithelzellen und eine ggr.

entzündliche Infiltration der Lamina propria etwas häufiger am dritten und siebten Tag p.i., als am 14. und 21. Tag p.i. auf. Die mesenterialen Lymphknoten waren histologisch bis auf eine ggr. lymphatische Hyperplasie unauffällig [vgl. H.3].

Detaillierte Beschreibungen zu klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, H.2 und H.3].

C.1.2.4 Quantitative Organbelastung

Am dritten Tag nach der oralen Infektion konnten bei allen drei Tieren Yersinien in Tonsillen, Jejunum, Ileum und Caecum quantitativ nachgewiesen werden. In den Tonsillen und den Darmabschnitten, hier insbesondere dem Ileum, war die Organbelastung mit bis zu 1,35x10⁶ KBE/g am höchsten. Im Colon konnten nur von zwei Ferkeln Yersinien quantitativ nachgewiesen werden. In Leber, Milz und Niere waren die Bakterien nur von je einem der drei Minipigs direkt reisolierbar (10² KBE/g).

An Tag sieben p.i. war im Hinblick auf die befallenen Organe kein detektierbarer Unterschied zu Tag drei p.i. zu beobachten. Aus Jejunum, Ileum, Caecum und Colon konnte bei allen Tieren Y. enterocolitica reisoliert und quantifiziert werden. In den Tonsillen konnten nur bei zwei, in den mesenterialen Lymphknoten sowie in Leber und Niere bei einem von drei Schweinen quantitativ Yersinien nachgewiesen werden.

Aus der Milz war sieben Tage p.i. kein quantitativer Erregernachweis möglich. Die Organbelastung unterschied sich kaum von der an Tag drei p.i. ermittelten.

Zwei Wochen nach der Infektion konnte nur noch aus Ileum, Caecum und Colon aller drei Tiere Y. enterocolitica quantitativ reisoliert werden. Jeweils bei einem der drei Tiere konnten Yersinien aus dem Jejunum, den mesenterialen Lymphknoten, Nieren und Tonsillen quantitativ bestimmt werden. Proben von Leber und Milz blieben bei allen drei Ferkeln negativ. Die Keimbelastung lag allerdings in niedrigeren Bereichen,

in den Tonsillen beispielsweise bei 9,09x10² KBE/g. Deutliche Unterschiede bezüglich der Organbelastungen zeigten sich zwischen Tag drei und Tag 14 p.i. in Jejunum, Ileum, Caecum und Tonsillen. Zwischen Tag sieben und Tag 14 p.i.

konnten große Unterschiede in Jejunum, Caecum und Colon festgestellt werden.

Drei Wochen nach oraler Infektion waren schließlich nur noch in den Caeca aller drei Schweine Yersinien qualitativ nachweisbar. Sie konnten zudem aus zwei der drei Colon- und Tonsillenproben und aus einer Ileumprobe direkt reisoliert werden. Auch hier konnte eine weitere Abnahme der Organbelastung beobachtet werden, die im Vergleich zum dritten und siebten Tag post infectionem besonders stark hervortrat.

Deutliche Unterschiede zeigten sich zwischen Tag drei und Tag 21 p.i. in Jejunum, Ileum und Caecum, sowie zwischen Tag sieben und Tag 21 p.i. in Jejunum, Ileum, Caecum und Colon und auch zwischen Tag 14 und Tag 21 p.i. in der Belastung des Ileums (Abb. 5 und Abb. 6). Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4].

Aus den Organen der vier am 21. Tag p.i. sezierten Kontrolltiere konnten keine Yersinien isoliert werden.

Abb. 5: Quantitative Organbelastung der Minipigs zu vier Zeitpunkten nach der Infektion. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. Zu jedem Zeitpunkt (drei, sieben, 14 und 21 Tage p.i.) wurden drei Tiere seziert.

Tage p.i.

Abb. 6: Quantitative Belastung der intestinalen Organe (Jejunum, Ileum, Caecum, Colon) im Verlauf der Infektion. Je drei Tiere wurden am dritten, siebten, 14. und 21. Tag p.i. euthanasiert und seziert. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus des Mittelwerts der drei untersuchten Tiere. Die Balken zeigen die Standardabweichung an.

C.1.2.5 Qualitative Organbelastung

Qualitativ konnten mittels Kälteanreicherung von Organproben der an Tag drei p.i.

sezierten Schweine Yersinien aus allen Proben von Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum und Colon reisoliert werden. Somit waren zu diesem Zeitpunkt alle Proben von Tonsillen und Darmabschnitten positiv. In zwei von drei der beprobten mesenterialen Lymphknoten und Nieren, sowie in je einer Probe von Leber und Milz konnte Y. enterocolitica ebenfalls nachgewiesen werden. Sieben Tage p.i. erwiesen sich noch immer alle Darmproben und zwei der drei Darmlymphknoten als positiv.

Zudem waren die Yersinien in je einer der Proben von Tonsillen, Leber, Milz und Niere nachweisbar. Am 14. Tag p.i. fanden sich die Bakterien noch in allen drei Proben von Ileum, Caecum und Colon, in zwei der Tonsillenproben und in jeweils einer Probe der mesenterialen Lymphknoten und Nieren. Negativ blieben zu diesem Zeitpunkt alle Proben von Jejunum, Leber und Milz. Am 21. Tag nach der Infektion waren noch alle drei Colonproben positiv, zudem je zwei der drei Proben von Tonsillen und Caecum. In Jejunum, Ileum, mesenterialen Lymphknoten, Leber, Milz und Nieren aller drei Tiere konnten keine Yersinien nachgewiesen werden (Abb. 7).

In den Organproben der vier Kontrolltiere konnten auch in der Kälteanreicherung keine Yersinien nachgewiesen werden.

Abb. 7: Prozentualer Anteil positiv getesteter Organproben im Bezug zum Zeitpunkt nach der Infektion (Tage p.i.). Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung untersucht. Zu jedem der vier angegebenen Zeitpunkte wurden drei Tiere in der Sektion untersucht.

C.1.2.6 Bakterielle Ausscheidung

Um die Ausscheidung der Yersinien mit dem Kot zu untersuchen, wurden zweimal pro Woche Rektaltupfer aller Tiere und bei den Sektionen frisch aus dem Enddarm entnommener Kot qualitativ auf Y. enterocolitica untersucht. Auch hier kam die Kälteanreicherung zum Einsatz, aufgrund der extrem hohen Begleitflora in Kotproben wurde auf eine quantitative Untersuchung verzichtet.

Einen Tag nach der oralen Belastung der Ferkel waren in allen zwölf untersuchten Rektaltupfern Yersinien nachweisbar. Drei Tage p.i. wurden elf von zwölf Tupfern positiv getestet, sieben Tage p.i. waren in allen neun untersuchten Tupfern Yersinien nachweisbar. Zehn und 14 Tage p.i. waren alle Rektaltupfer der sechs Minipigs positiv. An Tag 17 p.i. konnten keine Yersinien nachgewiesen werden, 21 Tage p.i.

hingegen waren alle drei Proben dieser Tiere wieder positiv (Abb. 8).

Tage p.i.

Abb. 8: Prozentualer Anteil der infizierten Tiere, die Y. enterocolitica mit den Faeces ausschieden. Die Untersuchung erfolgte mittels Kälteanreicherung von Rektaltupfern. Am ersten und dritten Tag p.i. wurden 12 Tiere untersucht, am siebten Tag neun Tiere, am zehnten und 14. Tag sechs und am 17. und 21. Tag drei Tiere.

Auch aus Rektaltupfern oder Kotproben der vier Kontrolltiere konnten keine Yersinia spp. isoliert werden. In den, von jedem Tier sieben Tage vor der Infektion genommenen, Rektal- und Tonsillentupfern waren kulturell ebenfalls keine Yersinien nachweisbar.

C.1.2.7 Serologie

Serumanalysen wurden in allen Versuchen mittels eines kommerziellen ELISA-Systems [vgl. B.2.7] in Kooperation mit Dr. Alexandra von Altrock (Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover) durchgeführt. Die serologische Untersuchung zeigte einen starken Titeranstieg im Serum der infizierten Tiere ab dem siebten Tag nach der Infektion. Während die vier nicht infizierten Kontrolltiere negativ (unter dem „Cut-off“ von 20 OD %) blieben, zeigten die infizierten Tiere Werte von bis zu 85 OD % und einen steten Titeranstieg bis zum 21. Tag p.i. (Abb.

9). Bis zum siebten Tag p.i. unterschieden sich die Titer der Infektions- und der Kontrollgruppe kaum, ab dem 14. Tag p.i. konnte trotz deutlich ersichtlicher Unterschiede aufgrund der geringen Tierzahlen keine statistische Signifikanz nachgewiesen werden.

Abb. 9: