Vergleich der Koinfektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp

Auch die Koinfektionsstudien wurden sowohl im Minipig- als auch im Mausmodell durchgeführt. Hierbei sollten wirtsspezifische Unterschiede hinsichtlich der Auswirkungen der invA-Expression auf die Fähigkeit zur Kolonisation und Infektion durch Y. enterocolitica untersucht werden.

Die Ergebnisse aus dem Minipigmodell stammen aus der vorliegenden Arbeit, die Resultate aus Studien im Mausmodell hingegen aus dem Ph.D.-Projekt von Julia Schaake, M.Sc.. Die eingesetzten Bakterienstämme wurden im Abschnitt C.3.

beschrieben. In jeder Koinfektionsstudie wurden acht Minipigs [vgl. C.3] bzw. zehn BALB/c-Mäuse infiziert. Die Infektionsdosis betrug bei den Schweinen insgesamt 10⁹ KBE/Tier (je 5x10⁸ KBE YeO:3 Wildtyp + Mutante) und bei den Mäusen 5x10⁸ KBE (je 2,5x10⁸ KBE YeO:3 Wildtyp + Mutante).

C.4.2.1 Vergleich der Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-Stabilitätsmutante

In den Koinfektionsversuchen, in denen der YeO:3 Wildtypstamm Y1 mit der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) verglichen wurde, konnte sowohl im Minipig- als auch im Mausmodell ein signifikanter Unterschied in der Organbelastung nur im Ileum beobachtet werden. Dieser war nicht in Bezug auf die KBE/g Organ feststellbar, hinsichtlich der RVR (relative virulence ratio) im Schwein ausgeprägter als in der Maus, und im CI (competitive index) war nur im Minipigmodell ein signifikanter Unterschied zwischen dem Wildtypstamm Y1 und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 feststellbar (Abb. 33). Der signifikante Unterschied zwischen der RovA-Stabilitätsmutante und dem Wildtypstamm in der RVR war zudem gegensätzlich in den beiden Tiermodellen. Während die RovA-Mutante im Schwein einen Nachteil in der Besiedlung des Ileums zeigte [vgl. C.3.1], konnte im Mausmodell ein Vorteil der Mutante festgestellt werden.

Abbilduung 33: Fortssetzung undd Beschriftuung auf der ffolgenden SSeite

Fortsetzung Abbildung 33:

Abb. 33: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). Es wurden insgesamt acht (Schwein) bzw. zehn Tiere (Maus) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Darstellung der quantitativen Organbelastung mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) als log KBE/g (A, B), log relative virulence ratio (C, D) und competitive index (E, F))

C.4.2.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvAΔIS1667-Mutante

In Koinfektionsstudien mit dem YeO:3 Wildtypstamm YE13 und der PinvA ΔIS1667-Mutante YE15 konnte, wie auch in den zuvor beschriebenen Versuchen mit der RovA-Stabilitätsmutante YE14 , in Bezug auf die KBE/g Organ im student’s t-Test kein signifikanter Unterschied zwischen dem Wildtypstamm YE13 und der PinvAΔIS1667-Mutante YE15 nachgewiesen werden. In der RVR konnte ein Nachteil der RovA-Stabilitätsmutante YE14 gegenüber dem Wildtystamm YE13 im Minipigmodell im Ileum (P<0.01) und im Caecum (P<0.001), im Mausmodell nur im Caecum (P<0.05) gezeigt werden. Mithilfe des CI wurde im one sample t-Test im Schwein ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Stämmen im Jejunum, Ileum, Colon (P<0.05) und Caecum (P<0,001) nachgewiesen [vgl. C.3.2], während ein solcher in der Maus nicht zu beobachten war (Abb. 34).

Abbilduung 34: Fortssetzung undd Beschriftuung auf der ffolgenden SSeite

Fortsetz

Abbilduung 35: Fortssetzung undd Beschriftuung auf der ffolgenden SSeite

Fortsetzung Abbildung 35:

Abb. 35: Vergleich der Organbelastungen im Minipig- (A, C, E) und Mausmodell (B, D, F). Es wurden insgesamt acht (Schwein) bzw. zehn Tiere (Maus) untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Alle Versuche im Mausmodell wurden durchgeführt von Julia Schaake, M.Sc.. (Darstellung der quantitativen Organbelastung mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 (YeO:3 wt) und der ΔinvA-Mutante YE15 (YeO:3 ΔinvA) als log KBE/g (A, B), relative virulence ratio (C, D) und competitive index (E, F))

Fazit:

Es waren deutliche Unterschiede zwischen Ergebnissen aus dem Minipig- und dem Mausmodell zu beobachten.

Die Serotypen O:3 und O:8 verhalten sich gegensätzlich in den beiden Wirtsspezies.

Während YeO:8 in der Maus hoch virulent ist, verursachen beide Serotypen im Schwein keine klinisch manifeste Erkrankung. Allerdings findet durch YeO:3 eine Infektion, durch YeO:8 nur eine Kolonisation der Minipigs statt. Im Mausmodell konnten im Gegensatz zum Schwein keine Unterschiede in der Organbelastung durch die beiden Serotypen beobachtet werden.

Es konnte gezeigt werden, dass der Virulenzfaktor Invasin für die Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 sowohl in der Maus als auch im Schwein eine wichtige Rolle spielt. Allerdings ergaben die Koinfektionsversuche auch Hinweise darauf, dass das stabilere RovA und das Insertionselement IS1667 des Serotyps O:3 im Schwein von größerer Bedeutung sind als in der Maus.

D Diskussion

Yersinia (Y.) enterocolitica spielt als ein durch Nahrungsmittel übertragbarer Zoonoseerreger eine nicht zu unterschätzende Rolle im Verbraucherschutz und in der Lebensmittelhygiene sowohl in Deutschland als auch in Europa, den USA, Kanada und Japan (Tauxe et al., 1987; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a;

Fredriksson-Ahomaa et al., 2001b; Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005;

Thibodeau et al., 1999; Bhaduri et al., 2005). Die größte Bedeutung als Krankheitserreger hat der Bioserotyp 4/O:3 (Rosner et al., 2010; Batzilla et al., 2011a). Dieser ist nicht nur in humanen Patienten, sondern auch in Schweinebeständen der am häufigsten vorkommende Serotyp (Fukushima et al., 1983; Bottone, 1999; von Altrock et al., 2006). Das Schwein gilt als Reservoirwirt und rohes Schweinefleisch als Hauptinfektionsquelle für den Menschen (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006b). Während die Yersinien Schweine symptomlos kolonisieren, kommt es im Gegensatz dazu beim Menschen zu einer klinisch manifesten Infektion.

Die molekularen Grundlagen für das unterschiedliche Verhalten von Y. enterocolitica im Schwein und im Menschen sind weitgehend unbekannt. Für wissenschaftliche Untersuchungen dieser Mechanismen sind weitergehende Studien im natürlichen Wirtsorganismus erforderlich.

Etablierung des Infektionsmodells

Obwohl Schweine anatomisch dem Menschen in vielerlei Hinsicht ähneln, bestehen im Gastrointestinaltrakt auch Unterschiede, wie z.B. in der Ausprägung der Peyerschen Platten, die beim Schwein über die gesamte Länge des Ileums verlaufen, bei Menschen hingegen als einzeln umschriebene Ansammlungen von Lymphfollikeln vorkommen. Allerdings besitzen Schweine, wie auch Menschen, Tonsillen, die in der Maus natürlicherweise fehlen (Meurens et al., 2012). Inwiefern diese anatomischen Unterschiede sich auf die Kolonisation und Infektion durch Y. enterocolitica auswirken, ist noch nicht erforscht.

Bisher im Schwein durchgeführte experimentelle Infektionen (Fukushima et al., 1984;

Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Thibodeau et al., 2001; Nielsen et al., 1996; Platt-Samoraj et al., 2009a) variieren methodisch stark bezüglich des Alters und Immunstatus der Versuchstiere, der Infektionsdosen, der

eingesetzten Bakterienstämme sowie der kulturellen und molekularbiologischen Nachweismethoden.

Vor diesem Hintergrund sollte im ersten Teil der vorliegenden Dissertation ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica in Minipigs etabliert werden. In einem ersten Vorversuch mit Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 wurden verschiedene orale Infektionsdosen getestet, um eine optimale Infektionsdosis zu ermitteln. Das Ziel war es, eine symptomlose Kolonisation der Tonsillen und des Darmtrakts zu initiieren, ohne eine klinisch manifeste Erkrankung auszulösen, da dieses dem natürlichen Vorgang in Schweinemastbeständen entspricht. Die drei getesteten Dosen von 10⁸, 10⁹ und 10¹⁰ KBE pro Tier wurden in Anlehnung an bereits publizierte Infektionsdosen und mit dem Kot ausgeschiedene Bakterienmengen ausgewählt (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Thibodeau et al., 2001; Nielsen et al., 1996; Platt-Samoraj et al., 2009a).

Da ein fäkal-oraler Übertragungsweg und eine Persistenz in den Tonsillen angenommen werden, wurde der orale Infektionsweg mittels Applikation in die Maulhöhle gewählt. Um den natürlichen Infektionsvorgang zu simulieren, wurde auf eine zusätzliche Gabe von Bicarbonat, die nach Fukushima et al. (1984) die Ausscheidungsmenge mit den Faeces erhöht, verzichtet.

Sowohl nach einer Infektion mit 10¹⁰ als auch nach einer solchen mit 10⁹ oder 10⁸ KBE des Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) Stamms Y1 konnte eine Kolonisierung der Tonsillen und der verschiedenen Darmabschnitte am siebten Tag p.i. beobachtet werden. Auch eine Ausscheidung der Bakterien mit den Faeces fand vom ersten bis zum siebten Tag p.i. statt. In der höchsten Dosisgruppe (10¹⁰ KBE) konnten die Bakterien zusätzlich zu Tonsillen und Darmproben auch aus Lymphknoten, Leber und Milz reisoliert werden. Daher wurden alle weiteren experimentellen Infektionsstudien mit einer oralen Infektionsdosis von 10⁹ KBE durchgeführt, um das Risiko einer klinisch manifesten Erkrankung möglichst gering zu halten. Obwohl die Tierzahlen des Vorversuchs mit jeweils drei Tieren pro Gruppe zu gering waren, um eine statistisch absicherbare Aussage treffen zu können, geben sie zumindest Anhaltspunkte dafür, dass die Ausprägung einer generalisierten Infektion mit Y. enterocolitica abhängig von der Höhe der Infektionsdosis zu sein scheint [vgl. C.1.1]. Die rein qualitativ ermittelte Ausscheidung mit den Faeces zeigte allerdings keine deutlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Dosisgruppen [vgl.

C.1.1.4].

Diese Ergebnisse stimmen mit Beobachtungen aus früheren Infektionsversuchen überein. So konnte eine Kolonisation der Tonsillen und des Darms festgestellt werden, ohne dass die Tiere klinische Symptome zeigten. Diese Beobachtungen machten auch Schiemann (1988), Nielsen (1996) und Thibodeau et al. (1999 und 2001). Robins-Browne et al. (1985) fanden pathologisch-anatomische Veränderungen im Darmtrakt und konnten ernste klinische Symptome bis hin zu einem letalen Verlauf in Abhängigkeit von der Infektionsdosis in gnotobiotischen Ferkeln beobachten. Diese Ergebnisse sind allerdings nicht auf Ferkel mit normalem Immunstatus übertragbar. Auch der von Brügmann et al. (2001) berichtete Fall einer letalen Septikämie bei einem Minipig-Ferkel ist eher als Einzelfall einzustufen.

In einem weiteren orientierenden Vorversuch wurde der Infektionsverlauf nach einer oralen Infektion mit 10⁹ KBE des YeO:3 Stamms Y1 über einen Zeitraum von 21 Tagen untersucht. Auch wenn die Tierzahlen (n=3) pro Untersuchungszeitpunkt zu gering für eine statistische Auswertung waren, so konnte dennoch ein deutlicher Rückgang der Organbelastung der Schweine mit YeO:3 Stamm Y1 im Verlauf der Infektion zwischen dem siebten und dem 21. Tag p.i. beobachtet werden. Dieser Rückgang zeigte sich in den Proben der Darmabschnitte und auch in denen der extraintestinalen Organe, in denen am 14. und 21. Tag p.i. keine Yersinien nachgewiesen werden konnten, jedoch nicht in den Tonsillen. Diese Beobachtung bestätigt die Annahme einer Persistenz der Bakterien in den Tonsillen (Thibodeau et al., 1999; Gürtler et al., 2005). Zudem wurde der siebte Tag p.i. als ein günstiger Untersuchungszeitpunkt identifiziert, da im weiteren Verlauf der Infektion die Organbelastung durch Y. enterocolitica stark nachließ.

Die Ausscheidung mit dem Kot zeigte einen zum letzten Untersuchungszeitpunkt intermittierenden Verlauf, war aber vom ersten Tag bis zu drei Wochen nach der oralen Infektion nachweisbar. Ähnliches berichteten auch Fukushima et al. (1984), Schiemann (1988) und Nielsen (1996). Eine weitere Arbeitsgruppe berichtete sogar von einer Ausscheidung der Yersinien mit den Faeces bis zum 56. Tag p.i.

(Thibodeau et al., 2001).

Serologische Untersuchungen mit einem auf rekombinanten Yops basierenden ELISA-Testsystem (PIGTYPE^®YOPSCREEN) [vgl. B.2.7] zeigten eine deutliche Serokonversion der mit YeO:3 Stamm Y1 infizierten Tiere zwischen dem siebten und

(LPS) der Yersinien (Serovare O:3, O:5,27 und O:9) basierender ELISA eingesetzt wurde, konnte eine Serokonversion der Schweine erst zwischen dem 21. und 56.

Tag p.i. festgestellt werden (Thibodeau et al., 2001). Die eingesetzten Versuchstiere waren mit fünf Wochen nicht wesentlich jünger als die Minipigferkel in der vorliegenden Untersuchung, daher ist eine Erklärung dieses Unterschieds eher im Hinblick auf die verschiedenen ELISA-Testverfahren zurückzuführen. In experimentellen Infektionen mit Y. enterocolitica in trächtigen Sauen konnten mit dem PIGTYPE^®YOPSCREEN-ELISA hohe Antikörpertiter bei den Sauen innerhalb von zwei Wochen nach der Infektion festgestellt werden, die über mehrere Monate anhielten. Bei neugeborenen Ferkeln konnten nur niedrige Titer gemessen werden, die ab der sechsten Lebenswoche unter 20 OD % abfielen (Platt-Samoraj et al., 2009b). Diese Beobachtungen entsprechen den in der vorliegenden Arbeit bei nicht infizierten Ferkeln der Kontrollgruppe gemachten [vgl. C.1.1.4].

In den durchgeführten Infektionsversuchen zeigte keines der Minipigs ernste klinische Symptome, wie Diarrhoe, Fieber oder Veränderungen bezüglich Haltung und Verhaltens. Das Auftreten von leicht breiigem Kot kam selten sowohl vor als auch nach der Infektion mit Y. enterocolitica und auch bei nicht infizierten Kontrolltieren vor und scheint in keinem Zusammenhang mit der Infektion zu stehen.

Auffällige hämatologische Befunde im roten und weißen Blutbild konnten regelmäßig erhoben werden, allerdings traten auch diese schon vor der Belastung der Tiere mit Y. enterocolitica auf. Da es sich bei den eingesetzten Ferkeln nicht um SPF-Tiere handelte, kommen vielerlei Ursachen für diese Befunde infrage. Virale Infektionen können eine Leukozytopenie, eine Neutropenie oder Lymphozytose hervorrufen.

Auch nichtinfektiöse Einflüsse, wie Eisenmangel, zu geringe Flüssigkeitsaufnahme, erhöhte Umgebungstemperatur und Stress, führen zu Auffälligkeiten im Blutbild. So vermag Stress beispielsweise eine Leukozytose, Neutrophilie oder Lymphozytopenie zu verursachen. Erschwerend für die Beurteilung hämatologischer Parameter ist zudem das Fehlen von aktuellen Referenzwerten für die Rasse Mini-Lewe. Ob die für Mast- und Zuchtschweine der gängigen Rassen (Deutsche Landrasse, Deutsches Edelschwein, Pietrain, Hampshire, Duroc) geltenden Referenzwerte übertragbar sind, ist bislang nicht näher untersucht worden. In den vorliegenden Studien beziehen sich beschriebene Abweichungen jedoch auf diese „Normalwerte“.

Deutliche Hinweise auf eine akute entzündliche Infektion (Kernlinksverschiebung) fanden sich in der hämatologischen Untersuchung nicht.

Auch die erhobenen pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunde waren überwiegend von milder Ausprägung und für die Infektion mit Y. enterocolitica unspezifisch, da sie auch in den Tieren der Kontrollgruppe auftraten. Eine nur milde Ausprägung histopathologischer Befunde berichteten auch Thibodeau et al. (1999) nach einer oralen Infektion von Hybridschweinen mit 10⁸ KBE Y. enterocolitica Serotyp O:3.

Obwohl zwischen Minipigs und den üblicherweise zur Mast genutzten Hybridschweinen anatomische und physiologische Unterschiede bestehen (Meurens et al., 2012), lassen die vorliegenden Parallelen zwischen den Ergebnissen aus Infektionsversuchen in Mastschweinen und Minipigs eine Übertragbarkeit des Minipigmodells auf kommerzielle Schweinebestände vermuten.

Insgesamt ist es gelungen, ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Minipig zu etablieren, das dazu geeignet ist, die Kolonisation und Infektion dieses Erregers im Schwein als natürlichem Wirtsorganismus weitergehend zu untersuchen.

Vergleichende Untersuchung der Serotypen O:3 und O:8 im Minipigmodell Im zweiten Teil der vorliegenden wissenschaftlichen Arbeit wurde das Minipigmodell eingesetzt, um den in humanen Patienten und in Schweinebeständen am häufigsten vorkommenden Bioserotyp 4/O:3 mit dem bisher molekularbiologisch am besten untersuchten und im Mausmodell hoch virulenten Bioserotyp 2B/O:8 zu vergleichen.

Hierzu wurden jeweils insgesamt zehn Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) Stamm Y1 oder Serotyp O:8 (YeO:8) Stamm 8081v infiziert. Die Versuche wurden zeitlich versetzt einmal mit vier und einmal mit sechs Tieren durchgeführt, wobei die Ergebnisse beider Versuche reproduzierbar waren. YeO:3 Stamm Y1 konnte wesentlich häufiger und in größerer Anzahl aus den Organen der Ferkel reisoliert werden als YeO:8 Stamm 8081v. Eine quantitative Bestimmung des Keimgehalts war bei YeO:8 Stamm 8081v ausschließlich in den Tonsillen möglich [vgl. C.2.4]. In der qualitativen Untersuchung mittels Kälteanreicherung konnte der Serotyp O:8 ebenfalls nur in den Tonsillen und dem Ileum nachgewiesen werden, während Serotyp O:3 sowohl aus intestinalen als auch aus extraintestinalen Organen (Lymphknoten, Milz, Niere) reisoliert wurde [vgl. C.2.5]. Auch in Kotproben bzw.

Rektaltupfern konnte YeO:3 ab dem dritten Tag p.i. deutlich häufiger nachgewiesen werden als YeO:8, was für eine wesentlich längere Ausscheidung mit den Faeces

beiden Serotypen eine sehr unterschiedliche Reaktion der infizierten Tiere. Während bei Ferkeln, die mit Serotyp O:3 Stamm Y1 infiziert worden waren, eine deutliche Serokonversion zu beobachten war, trat diese nach Infektion mit Serotyp O:8 Stamm 8081v nicht auf [vgl. C.2.7].

Diese Ergebnisse zeigen, dass sich Serotyp O:3 im Schwein wesentlich invasiver verhält und im Gegensatz zu Serotyp O:8 eine Infektion verursacht. Serotyp O:8 hingegen scheint ausschließlich die Tonsillen und nur minimal den Darm der Tiere zu kolonisieren.

Da die eingesetzten Stämme Y1 und 8081v beide das Virulenzplasmid (pYV) beinhalten, das bei allen Biotypen von Y. enterocolitica bis auf Biotyp 1A vorhanden ist (Batzilla et al., 2011b), ist es wahrscheinlich, dass beide die gleichen Yops exprimieren können. Möglich ist allerdings eine unterschiedliche Regulation der Expression dieser virulenzassoziierten Proteine. Das Fehlen Yop-spezifischer Antikörper nach erfolgter Infektion mit YeO.8 ist aber eher durch die geringe Invasivität des Bakteriums begründet.

Zusammenfassend konnte im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 im Gegensatz zu Serotyp O:8 Stamm 8081v in der Lage ist, im Schwein eine generalisierte Infektion zu zeigen und eine Serokonversion zu induzieren. Da die Tiere dennoch keine Klinik zeigten, ist YeO:3 Stamm Y1 mit großer Wahrscheinlichkeit besser an das Schwein angepasst als YeO:8 Stamm 8081v. Dieser Umstand könnte auch die weite Verbreitung und Verdrängung anderer Serotypen durch YeO:3 als Erreger der humanen Yersiniose begründen. Eine Übertragbarkeit der Ergebnisse auf andere Stämme desselben Serotyps ist anzunehmen, da insbesondere für Serotyp O:3 eine große Homogenität beschrieben wurde (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a); sie bedarf aber weiterer Untersuchungen. Auch andere humanpathogene Serotypen, wie O:9 und O:5,27, konnten, wenn auch selten, aus Mastschweinen isoliert werden (Thibodeau et al., 1999; Gürtler et al., 2005). Wie sich diese Serotypen im Schwein verhalten, ist allerdings bislang nur wenig untersucht worden. Fukushima et al. (1984) beobachteten in experimentellen Infektionen im Schwein, dass Ferkel anfälliger für Serotyp O:5,27 waren als adulte Tiere. Bei Serotyp O:3 fanden sie keine altersabhängigen Unterschiede. Robins-Browne et al. (1985) infizierten gnotobiotische Ferkel mit den Bioserotypen 4/O:3 und 1/O:5. Sie konnten feststellen, dass der Bioserotyp 1/O:5 weniger virulent und nicht invasiv war. Auch Schiemann

(1988) beobachtete eine geringe Virulenz der Serotypen O:8, O:13 und O:21 in Ferkeln. Diese Studien unterstützen die Hypothese, dass der Serotyp O:3 an das Schwein adaptiert ist. Allerdings besteht der Bedarf nach weiteren Untersuchungen der verschiedenen humanpathogenen Bioserotypen im Schwein.

Bedeutung des Invasins

Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Frage nach den molekularen Grundlagen für den unterschiedliche Phänotyp der beiden Serotypen behandelt. YeO:3 und YeO:8 unterscheiden sich unter anderem in der Expression des Virulenzfaktors Invasin. In YeO:3 bewirkt eine Punktmutation im rovA-Gen eine größere Stabilität und verbesserte DNA-Bindungskapazität des RovA-Proteins. Bei YeO:8 hingegen verändert sich die Faltung des RovAs bei Temperaturen um 37°C (im Wirtsorganismus) und es unterliegt vermehrt einer Spaltung durch ATP-abhängige Proteasen (Uliczka et al., 2011). Da RovA die invA-Expression aktiviert, kommt es dadurch zu einer verminderten Bildung von Invasin in Serotyp O:8-Stämmen.

Ein weiterer bekannter Unterschied liegt im Vorhandensein eines Insertionselements (IS1667) im invA-Promotorbereich bei Serotyp O:3, das einen zusätzlichen Promotor beinhaltet und dadurch ebenfalls zu einer vermehrten invA-Expression in YeO:3 führt. Im YeO:8 fehlt dieses Insertionselement (Uliczka et al., 2011). Um herauszufinden, inwieweit die genannten Unterschiede zwischen den beiden Serotypen einen Einfluss auf die Kolonisation und Infektion des Schweins haben, wurden Koinfektionsversuche mit verschiedenen Mutanten im Minipigmodell durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Mutanten des Serotyp O:3 Stamms Y1 eingesetzt, die eine absteigende Invasinbildung aufwiesen. Die RovA-Stabilitätsmutante YE14 exprimiert das weniger stabile RovA des YeO:8, der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 fehlt das Insertionselement im invA-Promotorbereich und der ΔinvA-Mutante YE21 fehlt das gesamte invA (Uliczka et al., 2011).

In den Koinfektionsversuchen wurden die Schweine jeweils mit einer der Mutanten und dem YeO:3 Wildtypstamm gleichzeitig infiziert. Auf diese Art konnten die beiden eingesetzten Stämme innerhalb eines Tieres miteinander verglichen und der Einfluss individueller Unterschiede zwischen den einzelnen Schweinen auf die Ergebnisse umgangen werden (Monk et al., 2008) [vgl. C.3].

In Koinfektionsversuchen mit der RovA-Stabilitätsmutante YE14 und dem

signifikanter Unterschied zwischen der Mutante und dem Wildtyp nachgewiesen werden. Allerdings war im competitive index eine leichte Tendenz zu beobachten, nach der die Mutante auch in anderen Darmabschnitten einen geringen Nachteil gegenüber dem Wildtyp aufwies. Bezüglich der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces konnte keine verringerte Ausscheidung der RovA-Stabilitätsmutante festgestellt werden [vgl. C.3.1].

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression eines stabileren RovAs allein nicht zu der erfolgreicheren Infektion des Schweins durch YeO:3 gegenüber dem YeO:8 führt.

Vielmehr scheint die invA-Expression auch von weiteren Faktoren abhängig zu sein.

Zudem beeinflusst RovA als globaler Regulator nicht nur die Invasinexpression, sondern aktiviert bzw. hemmt die Transkription von über 60 verschiedenen Genen (Cathelyn et al., 2007). Dube et al. (2003) konnten zeigen, dass eine YeO:8 rovA-Mutante in der Maus attenuiert war. Die molekularen Mechanismen, die dieser Attenuierung zugrunde liegen, sind allerdings noch größtenteils unbekannt.

In der Untersuchung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 in Koinfektionsversuchen mit einem YeO:3 Wildtypstamm zeigte sich eine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 deutlich signifikant unter Berücksichtigung des Anteils dieser am Inokulum (relative virulence ratio, RVR) und im individuellen Vergleich mit dem Wildtypstamm YE13 innerhalb desselben Tieres (competitive index, CI) [vgl. C.3.2]. Hinsichtlich der qualitativen Organbelastung und der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces konnte jedoch keine Attenuierung der PinvA∆IS1667-Mutante beobachtet werden.

Auch im direkten Vergleich der quantitativen Organbelastung aller Tiere konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Diese Resultate bekräftigen wiederum die Hypothese, dass Invasin zwar eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen spielt (Miller und Falkow, 1988), die invA-Expression allerdings von weiteren Faktoren zusätzlich zu RovA reguliert wird.

Andererseits ist bekannt, dass Invasin für die Infektion in Mäusen nicht essentiell ist

Andererseits ist bekannt, dass Invasin für die Infektion in Mäusen nicht essentiell ist

Im Dokument Charakterisierung der Yersinia enterocolitica-Infektion im Minipigmodell (Seite 87-121)