Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und

In einem ersten Koinfektionsversuch wurden acht Mini-Lewe-Ferkel jeweils mit ca.

5x10⁸ KBE YeO:3 Stamm Y1 (wt) und 5x10⁸ KBE der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (Y1 RovAP98, Kn^R) infiziert. YE14 ist mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 identisch, bis auf ein weniger stabiles RovA-Protein, das ihn in diesem einen Punkt dem Serotyp O:8 Stamm 8081v gleichen lässt. Außerdem besitzt YE14 eine Kanamycin-Resistenzkassette, die es ermöglicht, ihn kulturell vom Wildtypstamm Y1 zu unterscheiden.

Jeweils vier Schweine pro Gruppe wurden in einem ersten Koinfektionsversuch am siebten und am 21. Tag p.i. euthanasiert und seziert. In einem zweiten Koinfektionsversuch wurden nochmals vier Minipigs mit je 5x10⁸ KBE YeO:3 Stamm Y1 (wt) und 5x10⁸ KBE der RovA-Stabilitätsmutante YE14 infiziert und nach sieben Tagen seziert. Die Ergebnisse vom siebten Tag p.i. wurden aus beiden Versuchen zusammengefasst und umfassen daher die Daten von insgesamt acht Tieren. Vier Kontrolltiere wurden mit sterilem PBS pseudoinfiziert und am 21. Tag p.i. seziert.

Um das Verhältnis der Organbelastung durch die Mutante zu der Belastung durch den Wildtyp zu ermitteln, wurden zwei unabhängige Verdünnungsreihen auf CIN-Agarplatten mit und ohne Kanamycin-Zusatz ausplattiert und ausgezählt. Danach wurde die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Gramm (KBE/g) Organ aus dem Verhältnis der auf Agarplatten mit und ohne Kanamycinzusatz gewachsenen Kolonien errechnet. Für die Berechnung der RVR (engl.: relative virulence ratio) wurde zudem der Bezug zum exakten Anteil der beiden Stämme am Inokulum hergestellt. Der CI (engl.: competitive index) zeigt das Verhältnis der RVRs der beiden Stämme zueinander innerhalb eines Tieres [vgl. B.3].

C.3.1.1 Klinische Beurteilung der Tiere

Die Versuchstiere wiesen sowohl vor als auch nach der Infektion diverse unspezifische Befunde in der hämatologischen Untersuchung auf. Klinische Symptome konnten abgesehen von gelegentlich auftretendem breiigen Kot nicht beobachtet werden [vgl. H.1].

C.3.1.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung

In den Sektionen konnten sowohl am siebten als auch am 21. Tag p.i. nur unspezifische Befunde erhoben werden, die überwiegend von milder Ausprägung und sowohl bei den infizierten als auch bei den Kontrolltieren zu beobachten waren [vgl. H.2].

C.3.1.3 Histopathologische Beurteilung

In der histopathologischen Beurteilung der mesenterialen Lymphknoten und des Ileums konnten überwiegend geringgradige unspezifische Befunde erhoben werden, die sowohl bei den Tieren der Koinfektions- als auch den Ferkeln der Kontrollgruppen auftraten. Im Ileum eines der koinfizierten Tiere konnten Bakterienkolonien in der Darmwand beobachtet werden [vgl. H.3].

Detaillierte Beschreibungen zu klinischen, pathologisch-anatomischen und histopathologischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1, 2 und 3].

C.3.1.4 Quantitative Organbelastung

Von den insgesamt acht am siebten Tag p.i. sezierten Ferkeln, konnten sowohl der Wildtypstamm Y1 als auch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 in den Tonsillen und den verschiedenen Darmabschnitten (Jejunum, Ileum, Caecum und Colon) aller Tiere quantitativ nachgewiesen werden. Hiervon gab es nur drei Ausnahmen, bei einem Tier kam der Wildtypstamm nicht in den Tonsillen vor, bei einem weiteren Tier nicht im Caecum und bei einem dritten nicht im Colon. Die Organbelastung mit dem Wildtypstamm lag in den Tonsillen zwischen 10² und 10⁴ KBE/g, in einer der acht

werden. Im Jejunum schwankte die Belastung zwischen 10² und 10⁵ KBE/g, das Ileum war mit 10⁴ bis 10⁶ KBE/g besonders stark belastet und im Caecum konnten zwischen 10³ und 10⁴ KBE/g, mit Ausnahme der einen negativen Probe, gefunden werden. Auch das Colon war mit bis zu 10⁶ KBE/g Organ sehr hoch belastet, nur in einer Probe konnte der Wildtypstamm nicht nachgewiesen werden.

Im Gegensatz zum Wildtyp konnte die RovA-Stabilitätsmutante YE14 in allen intestinalen Organ- und Tonsillenproben quantitativ nachgewiesen werden. Sie wurde in den Tonsillen mit 10² bis 10⁴ KBE/g Organ gefunden. Die Belastung des Jejunums schwankte wie auch beim Wildtypstamm sehr stark (zwischen 10¹ und 10⁵ KBE/g). Ileum (10³ bis 10⁶ KBE/g) und Colon (10² und 10⁵ KBE/g) waren auch hier besonders hoch belastet. Im Caecum fanden sich zwischen 10² und 10⁴ KBE/g der RovA-Stabilitätsmutante. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4].

In den extraintestinalen Organen, wie den mesenterialen Lymphknoten, Leber, Milz und Nieren, konnte weder der Wildtypstamm noch die Mutante quantitativ nachgewiesen werden.

Im Student’s t-Test und Signed Rank Test konnten keine signifikanten Unterschiede in der quantitativen Organbelastung (KBE/g Organ) durch den Wildtyp und die RovA-Stabilitätsmutante nachgewiesen werden (Abb. 15).

Abb. 15: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3 wt) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98). (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben in log KBE/g Organ)

Hinsich

Abb. 17: Quantitative Belastung der Tonsillen und der intestinalen Organe der einzelnen Minipig-Ferkel durch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 (RovAP98) im Verhältnis zur Belastung durch den Wildtypstamm Y1 innerhalb desselben Tieres. (Zeitpunkt der Probenahme am siebten Tag p.i., untersucht wurden insgesamt acht koinfizierte Ferkel, Angaben als CI (competitive index))

Am 21. Tag nach der Infektion wurden nur im ersten Koinfektionsversuch vier Tiere untersucht. Zu diesem Zeitpunkt konnte quantitativ nur in den Tonsillen eines Tieres sowohl der Wildtyp als auch die Mutante nachgewiesen werden. Die Organbelastung lag bei 3,17x10⁴ KBE/g (Y1) und 1,5x10⁴ KBE/g (YE14). Es konnte somit zwar kein Unterschied zwischen den beiden Stämmen, jedoch ein starker Rückgang der Organbelastung durch sowohl den Wildtypstamm als auch die RovA-Stabilitätsmutante zwischen dem siebten und dem 21. Tag p.i. festgestellt werden.

C.3.1.5 Qualitative Organbelastung

Mit Hilfe der Kälteanreicherungstechnik konnten am siebten Tag p.i. sowohl der Wildtypstamm Y1 als auch die RovA-Stabilitätsmutante YE14 aus allen vier Proben von Tonsillen, Jejunum, Caecum, Colon und Ileum reisoliert werden. Eine Probe von mesenterialen Lymphknoten konnte positiv auf Wildtyp und Mutante getestet werden, in einer weiteren war nur die Mutante nachweisbar. Aus den vier Proben von Leber, Milz und Nieren konnte keiner der beiden Stämme reisoliert werden. Die Daten zur qualitativen Organbelastung der vier Tiere aus dem ersten Versuch waren nicht auswertbar, daher beziehen sich diese Ergebnisse nur auf vier Tiere (Abb. 18 A).

Vom 21. Tag p.i. liegen ebenfalls qualitative Daten von jeweils vier Tieren vor. Zu diesem Zeitpunkt war der Wildtypstamm Y1 in drei, die RovA-Stabilitätsmutante nur

in einer von vier Tonsillen nachweisbar. In Ileum, Caecum und Colon wurden allerdings mehr Tiere positiv auf die Mutante getestet, als auf den Wildtyp. So fand sich der Wildtypstamm Y1 nur in einer Caecum- und zwei Colonproben, die RovA-Stabilitätsmutante hingegen in einer Ileum-, zwei Caecum- und drei Colonproben.

Das Jejunum und alle extraintestinalen Organe außer den Tonsillen wurden drei Wochen nach der Infektion mit negativem Ergebnis auf Y. enterocolitica untersucht (Abb. 18 B).

Abb. 18: Qualitative Organbelastung mit Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovAP98) am siebten (A) und am 21. (B) Tag p.i..

Die Organproben wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht, die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden zu jedem Zeitpunkt Organproben von je vier Tieren ausgewertet.

A

B

C.3.1.6 Bakterielle Ausscheidung

Bis einschließlich zum siebten Tag p.i. wurden Daten zur bakteriellen Ausscheidung von insgesamt zwölf Minipigs erhoben, vom zehnten bis zum 21. Tag p.i. beziehen sich die Werte nur noch auf vier Tiere.

Einen Tag nach der Infektion konnte der Wildtypstamm Y1 in acht und die RovA-Stabilitätsmutante in zehn von zwölf Rektaltupfern nachgewiesen werden. Am dritten Tag p.i. wurden alle Proben positiv auf beide Stämme getestet, am siebten ebenfalls bis auf eine Probe, in der der Wildtypstamm nicht nachweisbar war (Abb. 19). Am zehnten Tag p.i. konnte die Mutante in allen vier, der Wildtypstamm in drei Rektaltupfern nachgewiesen werden. Nach 14 Tagen konnten Wildtyp und Mutante aus je drei Proben reisoliert werden, am 17. Tag p.i. war der Wildtypstamm in allen vier, die Mutante in drei Proben nachweisbar. Drei Wochen nach der Infektion waren wieder drei von vier Proben positiv in der Untersuchung auf beide Stämme.

Abb. 19: Bakterielle Ausscheidung mit den Faeces nach Koinfektion mit YeO:3 Stamm Y1 (YeO:3) und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 (YeO:3 RovA_P98). Rektaltupfer wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht; die Isolate wurden biochemisch differenziert. Es wurden zwölf Tiere untersucht. Die Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst.

Mit Hilfe des McNemar’s Test konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Ausscheidung zwischen dem YeO:3 Wildtypstamm Y1 und der RovA-Stabilitätsmutante YE14 nachgewiesen werden.

C.3.1.7

eine Tendenz, nach der die Mutante attenuiert war. Hinsichtlich der bakteriellen Ausscheidung mit den Faeces konnte kein Unterschied zwischen den beiden Stämmen beobachtet werden.

C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und