Charakterisierung der Yersinia enterocolitica–
Infektion im Minipigmodell
INAUGURAL- DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Anna Charlotte Drees
aus Berlin Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand Institut für Mikrobiologie
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Karl-Heinz Waldmann
Tag der mündlichen Prüfung: 15.10.2013
Diese Forschungsarbeit wurde unterstützt vom Bundesministerium für Bildung undForschung (BMBF) im Rahmen des Forschungsverbunds Food-Borne Zoonotic Infections of Humans (FBI-Zoo) und des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung (DZIF).
Gewidmet all meinen Sponsoren an Liebe, Zeit, Geduld und Geld
A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, A. von Altrock, F. Seehusen, P. Dersch, P.
Valentin-Weigand (2011):
Establishment of a Yersinia enterocolitica infection model in minipigs
Poster auf dem National Symposium on Zoonoses Research, 06.10. – 07.10. 2011, Berlin
In: National Symposium on Zoonoses Research, 6-7 October 2011, Berlin, Programme und Abstracts
A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, P. Dersch, A. von Altrock, F. Seehusen, P. Valentin-Weigand (2012):
Serotyp-abhängige Kolonisation von Yersinia enterocolitica im Minipig-Modell
Vortrag auf der Tagung der Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie” der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG), 27.06. – 29.06. 2012, Leipzig
In: DVG Tagung der Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie”, Leipzig, 27. bis 29.
Juli 2012, ISBN 978-3-86345-080-9
A. Drees, P. Grüning, J. Schaake, P. Dersch, A. von Altrock, P. Valentin-Weigand (2012):
Serotype dependent Colonization of Yersinia enterocolitica in a Minipig Infection Model
Vortrag auf dem 3rd National Yersinia 13.07. – 14.07. 2012, Tübingen In: 3rd National Yersinia Meeting, 13. bis 14. Juli 2012, Tagungsband
A Einleitung ... 11
A.1 Einleitung und Zielsetzung ... 11
A.2 Literaturübersicht ... 13
A.2.1 Allgemeine Eigenschaften von Yersinia enterocolitica ... 13
A.2.2 Yersinia enterocolitica: Epidemiologie und zoonotische Bedeutung ... 14
A.2.3 Yersiniose bei Menschen und Tieren: Klinische Symptome... 17
A.2.4 Virulenzfaktoren enteropathogener Yersinien ... 18
A.2.5 Bedeutung des Virulenzfaktors Invasin ... 19
A.2.6 Kultureller Nachweis pathogener Yersinien ... 21
A.2.7 Infektionsversuche im Mausmodell ... 22
A.2.8 Infektionsversuche im Schwein ... 23
B Material und Methoden ... 26
B.1 Bakterienstämme, Kultivierung und Differenzierung ... 26
B.1.1 Verwendete Yersinia enterocolitica-Stämme ... 26
B.1.2 Herstellung der Bakteriensuspension für die orale Infektion ... 27
B.1.3 Quantitative Isolierung der Yersinien und Differenzierung durch Resistenzen ... 28
B.1.4 Qualitative Isolierung der Yersinien mittels Kälteanreicherung ... 28
B.1.5 Biochemische Differenzierung der Isolate ... 29
B.2 Versuchstiere, experimentelle Infektionen und Versuchsdesign ... 30
B.2.1 Herkunft, Unterbringung und Versorgung der Versuchstiere ... 30
B.2.2 Versuchsaufbau ... 31
B.2.3 Orale Infektion der Minipigs ... 32
B.2.4 Probenentnahme ... 32
B.2.5 Pathologisch-anatomische Untersuchung ... 33
B.2.6 Histopathologische Untersuchung ... 34
B.2.7 Serologische Untersuchung ... 34
B.3 Statistische Auswertung... 34
C Ergebnisse ... 36 C.1 Etablierung eines Infektionsmodells für Yersinia enterocolitica im
C.1.2 Zeitverlauf der Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 ... 40
C.2 Vergleichende Infektionsstudie der Serotypen O:3 und O:8 ... 48
C.2.1 Klinische Beurteilung der Tiere ... 49
C.2.2 Pathologisch-anatomische Beurteilung ... 49
C.2.3 Histopathologische Beurteilung ... 49
C.2.4 Quantitative Organbelastung ... 50
C.2.5 Qualitative Organbelastung ... 52
C.2.6 Bakterielle Ausscheidung ... 53
C.2.7 Serologie ... 55
C.3 Koinfektionsversuche mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invasinassoziierten Gendefekten im Minipig- Modell ... 57
C.3.1 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer RovA-Stabilitätsmutante ... 58
C.3.2 Koinfektionsversuche mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer PinvA∆IS1667- Mutante ... 67
C.3.3 Koinfektionsstudien mit einem Serotyp O:3 Wildtypstamm und einer ∆invA-Mutante ... 75
C.4 Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse aus Infektionsversuchen im Maus- und Minipig-Modell ... 85
C.4.1 Vergleich der Infektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 und O:8 Stämmen ... 86
C.4.2 Vergleich der Koinfektionsstudien mit Y. enterocolitica Serotyp O:3 Wildtyp und Mutanten mit invA-assoziierten Gendefekten ... 87
D Diskussion ... 95
E Zusammenfassung ... 106
F Summary ... 108
G Literaturverzeichnis ... 110
H Anhang ... 121
H.1 Detaillierte klinische Beurteilung der Minipigs ... 121
H.3 Detaillierte histopathologische Beurteilung ... 134
H.4 Tabellarische Auflistung der quantitativen Organbelastung ... 145
H.5 Nährböden, Medien und Antibiotika ... 150
H.5.1 Nährböden ... 150
H.5.2 (Nähr-) Medien ... 151
H.5.3 „Bunte Reihe“ ... 151
H.5.4 Zusätze ... 154
H.5.5 Verwendete Antibiotika ... 155
H.6 Tabellenverzeichnis ... 155
A. bidest. Aqua bidestilliert
A. dest Aqua destilliert
Ail engl.: attachment and invasion locus
allg. allgemein
API engl.: analytical profile index
ATP Adenosintriphosphat bspw. beispielsweise
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CI engl.: competitive index
CIN-Agar Cefsulodin- Irgasan- Novobiocin- Agar
d.p.i. engl.: days post infection
ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assay g Gramm GALT engl.:gut associated lymphoid tissue ggr. geringgradig
GIT Gastrointestinaltrakt
H2S Schwefelwasserstoff
hgr. hochgradig H-NS engl.: Histone-like nucleoid-structuring protein
h lat.: hora
i.c. intracardial i.m. intramuskulär
InvA Invasin (Invasin A)
i.p. intraperitoneal IS Insertionselement i.v. intravenös
Yops engl.: Yersinia outer proteins
k.A. keine Angaben
KBE koloniebildende Einheiten
KnR Kanamycinresistent
L. propria Lamina propria
LB Medium Luria Bertani Medium
Lnn. Lymphonodi
LPS Lipopolysaccharide lymph. lymphatisch
M Molar
MCH Mittleres korpuskuläres Hämoglobin (engl.: mean corpuscular hemoglobin)
MCHC Mittlere korpuskuläre Hämoglobin-Konzentration (engl.: mean corpuscular hemoglobin
concentration)
MCV Mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (engl.: mean corpuscular volume)
mg Milligramm ml Milliliter mM Millimolar μg Microgramm μl Microliter min Minute mgr. mittelgradig
Myf engl.: Mucoid Yersinia factor
neg. negative
OD optische Dichte
ODC Ornithindecarboxylase
O/F Oxidativ/ Fermentativ
PBS engl.: phosphate buffered saline
PCR engl.: polymerase chain reaction
pH pondus hydrogenii
p.i. post infectionem
pos. positiv
PP Peyersche Platten
pYV engl.: Yersinia Virulence plasmid
RovA engl.: regulator of virulence A
SPF spezifiziert pathogenfrei ST Serotyp
Std. Stunde Tab. Tabelle
T3SS Typ 3 Sekretionssystem
u.a. unter anderem
vgl. vergleiche wt Wildtyp
YadA Yersinia Adhäsin A
Y. enterocolitica Yersinia enterocolitica
YeO:3 Yersinia enterocolitica Serotyp O:3 YeO:8 Yersinia enterocolitica Serotyp O:8
YmoA engl.: Yersinia modulator A
Yops engl.: Yersinia outer proteins
Y. pseudotuberculosis Yersinia pseudotuberculosis
Yst engl.: Yersinia stable toxin
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
A Einleitung
A.1 Einleitung und Zielsetzung
Yersinien gehören in Europa zu den häufigsten bakteriellen Erregern von gastrointestinalen Infekten beim Menschen (Epidemiologisches Bulletin des Robert Koch Instituts (RKI), 2012; ECDC-Annual epidemiological report, 2011; European Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). Die in erster Linie durch Yersinia (Y.) enterocolitica verursachte Yersiniose ist eine durch Lebensmittel übertragene Zoonose und zeichnet sich klinisch durch Diarrhoe, krampfhafte Bauchschmerzen (Pseudoappendizitis), Fieber und Erbrechen aus. Besonders häufig betroffen sind Kleinkinder (Wehebrink et al., 2008; ECDC-Annual epidemiological report, 2011).
Selten kommt es zu einer Sepsis oder zu ernsten Spätfolgen, wie reaktiver Arthritis oder Erythema nodosum (Bottone, 1997; Bottone, 1999). Das Schwein gilt als Reservoirwirt und rohes Schweinefleisch als eine der Hauptinfektionsquellen (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). Y. enterocolitica konnte in mehreren Studien aus Proben von klinisch unauffälligen Mastschweinen isoliert werden (von Altrock et al., 2010; von Altrock et al., 2006; Gürtler et al., 2005). Weitere Untersuchungen zeigten eine serologische Prävalenz von bis zu 66,8 % in Mastbeständen (von Altrock et al., 2006). In Infektionsversuchen im Schwein konnte gezeigt werden, dass der Erreger in der Lage ist, die Tonsillen und den Darmtrakt zu kolonisieren, ohne eine klinisch apparente Erkrankung auszulösen (Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Nielsen et al., 1996). Sowohl in Schweinebeständen als auch in humanen Patienten kommt in Europa und Japan hauptsächlich der Bioserotyp 4/O:3 vor (Wehebrink et al., 2008; Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999; Fukushima et al., 1983). Die meisten Studien in den letzten Jahren wurden allerdings mit Stämmen des Bioserotyps 1B/O:8 (YeO:8) durchgeführt. Dieser zeigt sich in Mäusen sehr viel virulenter als Serotyp O:3 (YeO:3) (Schiemann, 1988; Robins-Browne und Prpic, 1985) und war bis vor einigen Jahren in Nordamerika endemisch, wird dort aber zunehmend von YeO:3 verdrängt (Schiemann, 1988; Epidemiologisches Bulletin des Robert Koch Instituts (RKI), 2012; Bottone, 1999).
Die beiden Serotypen YeO:3 und YeO:8 unterscheiden sich u.a. durch ihre unterschiedliche Expression des Virulenzfaktors Invasin und dessen Regulation
antigenpräsentierender M-Zellen (Grützkau et al., 1990; Clark et al., 1998). Die invA- Expression wird durch RovA temperaturabhängig aktiviert und reguliert (Herbst et al., 2009; Uliczka et al., 2011). Da Y. enterocolitica auch in der Umwelt vorkommt und sich als psychrotrophes Bakterium bei Temperaturen zwischen 0°C und 43°C vermehren kann (Wehebrink et al., 2008), stellt die Temperaturänderung im Wirtsorganismus auf 37°C wahrscheinlich einen auslösenden Stimulus für die Aktivierung bestimmter Virulenzgene dar.
Zum Serotyp O:3 gehörende Stämme weisen im RovA-Gen eine Punktmutation auf, die den Austausch einer Aminosäure im Protein bedingt (Prolin wird durch Serin ersetzt). Dies führt zu einer größeren Stabilität des RovAO:3 (RovAS98) bei höheren Temperaturen (37°C). RovAO:3 ist weniger empfänglich für den Abbau durch ATP- abhängige Proteasen und weist eine verbesserte DNA-Bindung auf als RovAO:8
(RovAP98) (Herbst et al., 2009; Uliczka et al., 2011). Außerdem befindet sich bei Serotyp O:3 ein Insertionselement in der invA-Promotorregion (PinvAIS1667). Dieses beinhaltet einen zusätzlichen Promotor und führt somit zu einer erhöhten invA- Expression. Der Serotyp O:8 verfügt nicht über ein solches Insertionselement.
Beides führt zu einer vermehrten invA-Exprimierung in YeO:3 verglichen mit YeO:8 (Uliczka et al., 2011). Diese Vorteile könnten ursächlich für das häufigere Vorkommen von Bioserotyp 4/O:3 in Schweinebeständen und auch in humanen Patienten sein.
Die Mechanismen, die zu einer symptomlosen Kolonisation des Schweins führen, sind noch unbekannt. Infektionsversuche mit Yersinia enterocolitica in Schweinen wurden zwar bereits durchgeführt (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999; Nielsen et al., 1996), allerdings stammen Veröffentlichungen hierzu größtenteils aus den 1980er Jahren und sind nur schwer miteinander vergleichbar. Ein einheitliches Infektionsmodell existiert bisher nicht. Auch vergleichende Untersuchungen zu den beiden Serotypen O:3 und O:8 wurden im Schwein bislang nicht durchgeführt.
Vor diesem Hintergrund war es das erste Ziel der vorliegenden Arbeit, ein Infektionsmodell für Y. enterocolitica im Schwein zu etablieren. Minipigs wurden aufgrund ihrer Vorteile in Bezug auf Unterbringung und Handhabung ausgewählt.
Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurden experimentelle Infektionen mit den Serotypen O:3 und O:8 durchgeführt. In diesen Studien sollte untersucht werden, inwieweit die eingesetzten Stämme in der Lage sind, das Schwein als Wirt zu kolonisieren bzw. zu
infizieren und ob sich hier Unterschiede in der Virulenz zeigen, wie sie zuvor bereits im Mausmodell beobachtet wurden.
Anschließend wurden im dritten Abschnitt die Effekte der vermehrten Invasin- Expression in Serotyp O:3 durch Koinfektionsversuche im Minipig untersucht.
Eingesetzt wurden verschiedene Mutanten des Serotyp O:3 Stamms Y1, die eine stufenweise verringerte Invasinbildung zeigten. Die Mutagenese „transformiert“ quasi den Serotyp O:3 bezüglich der Invasin-Expression in den Serotyp O:8. So wurden eine RovA-Stabilitätsmutante (YeO:3RovAP98), die das weniger stabile RovA des YeO:8 (RovAP98) aufwies und eine PinvAΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement im Promotorbereich des invA-Gens fehlte, untersucht. Schließlich wurde eine Invasin-Knockout-Mutante (ΔinvA) eingesetzt, die kein Invasin exprimierte, um zu untersuchen, wie wichtig dieser Virulenzfaktor für eine Infektion des Schweins durch Y. enterocolitica ist.
Abschließend wurden die Ergebnisse der Infektionsversuche im Minipigmodell mit denen des Mausmodells verglichen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu beitragen, durch Untersuchungen im natürlichen Wirtsorganismus Erkenntnisse zu den Anpassungsmechanismen enteropathogener Yersinien an ihre Wirtshabitate gewinnen zu können.
A.2 Literaturübersicht
A.2.1 Allgemeine Eigenschaften von Yersinia enterocolitica
Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein gramnegatives, kokkoides bis pleomorphes Stäbchenbakterium. Die Gattung Yersinia gehört zur Familie der Enterobacteriaceae.
Bisher wurden 15 Spezies beschrieben, von denen drei als humanpathogene Erreger von Bedeutung sind: Y. pestis, der Erreger der Pest, und die beiden enteropathogenen Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis. Yersinien wachsen fakultativ anaerob und können sich als psychrophile Bakterien bei Temperaturen von 4– 42°C vermehren. Diese Eigenschaft wird in der bakteriologischen Diagnostik mit der „Kälteanreicherung“ genutzt. Die optimale Kultivierungstemperatur liegt bei 30°C. Y. enterocolitica ist Oxidase- und Laktose- negativ, Katalase-positiv und bildet weder eine Kapsel noch Sporen (Grötzbach,
25°C ist Y. enterocolitica peritrich begeißelt und beweglich, bei 37°C weist das Bakterium keine Begeißelung und somit auch keine Beweglichkeit mehr auf (Bottone, 1977). Y. enterocolitica wird in zwei Subspezies, Y. enterocolitica ssp. palearctica und Y. enterocolitica ssp. enterocolitica, unterteilt (Neubauer et al., 2000). Zudem lassen sich biochemisch sechs Biotypen (Biotyp 1A, 1B, 2- 5) und serologisch 28 Serotypen (nach Oberflächenantigenen) unterscheiden. Die als hoch virulent geltende Y. enterocolitica ssp. enterocolitica umfasst den Biotyp 1B, Y. enterocolitica ssp. palearctica die als weniger virulent angesehenen Biotypen 1A und 2-5 (Batzilla et al., 2011a; Neubauer et al., 2000). Die Einteilung in Bio- und Serovare ist neben molekularbiologischen Methoden diagnostisch von großer Bedeutung, um pathogene Bioserotypen von apathogenen Umweltisolaten zu unterscheiden (Neubauer et al., 2001).
A.2.2 Yersinia enterocolitica: Epidemiologie und zoonotische Bedeutung Verbreitung
Y. enterocolitica gilt als ein wichtiger durch Lebenmittel übertragbarer Krankheitserreger und hauptsächlicher Verursacher der Yersiniose. Durch Y.
pseudotuberculosis verursachte Fälle treten nur selten auf (European Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). In Deutschland besteht seit 2001 eine Meldepflicht für humane Yersiniosefälle. Das Robert-Koch-Institut (RKI) registrierte im Jahr 2011 in Deutschland 3.397 gemeldete Erkrankungen (Epidemiologisches Bulletin des Robert Koch Instituts (RKI), 2012), in der Europäischen Union wurden im Jahr 2009 laut European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) 7.686 Fälle erfasst (ECDC-Annual epidemiological report, 2011). Weltweit am häufigsten werden Erkrankungen beim Menschen durch Bioserotyp 4/O3 verursacht (Wehebrink et al., 2008; Bottone, 1999; European Food Safety Authority (EFSA) Journal, 2011). In Deutschland verursacht Serotyp O:3 annähernd 90 % aller gemeldeten humanen Yersiniosefälle (Rosner et al., 2010), auch in Japan, Australien, Südafrika, Kanada und den USA kommt Serotyp O:3 vor (Bottone, 1999) und scheint in Nordamerika den zuvor dort endemischen Serotyp O:8 zu verdrängen (Schiemann, 1988; Lee et al., 1990; Tauxe, 2002; Bottone, 1999). Seltener kommen Isolate der ebenfalls humanpathogenen Bioserotypen 1B/O:8, 2/O:5,27, 2/O:9 und 3/O:3 vor (Fredriksson-
Ahomaa et al., 2006a). Biotyp 1A gilt als apathogen, wobei eine fakultative Pathogenität diskutiert wird (Batzilla et al., 2011b; Bottone, 1999).
Das Schwein als Reservoirwirt
Schweine, insbesondere Mastschweine, gelten als Reservoir für humanpathogene Yersinien (Bottone, 1999; Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). In zahlreichen Studien konnte Y. enterocolitica aus Proben von klinisch gesunden Schweinen isoliert werden (Fukushima et al., 1983). Die serologische Prävalenz in Mastschweinen lag bei bis zu 66,8 % (von Altrock et al., 2006). Kulturell konnten Yersinien mit ähnlich hoher Prävalenz aus Tonsillen von Schlachtschweinen isoliert werden, aus Faeces waren die Nachweisraten allerdings geringer (Thibodeau et al., 1999; Fredriksson- Ahomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005; von Altrock et al., 2006). Dabei wurden z.T. große Unterschiede zwischen den Prävalenzen innerhalb der einzelnen Betriebe festgestellt (Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005). In epidemiologischen Untersuchungen, die mittels PCR durchgeführt wurden, war die Nachweisrate oftmals höher als in Studien mit rein kulturellen Nachweismethoden (Johannessen et al., 2000; Fredriksson-Ahomaa und Korkeala, 2003; Bhaduri et al., 2005). Die von Schweinen gewonnenen Isolate gehörten fast ausschließlich zu Bioserotyp 4/O:3 (Gürtler et al., 2005; Thibodeau et al., 1999; Fukushima et al., 1983; Pilon et al., 2000; von Altrock et al., 2010), der auch bei humanen Yersiniosepatienten dominiert.
Mit kulturell-biochemischen (Fukushima et al., 1983; Lee et al., 1990) und molekularbiologischen (Andersen und Saunders, 1990; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001b; Wojciech et al., 2004) Methoden konnte eine große Übereinstimmung zwischen Y. enterocolitica Stämmen aus Proben humanen und porzinen Ursprungs festgestellt werden. Auch für pathogene Yersinien typische Virulenzfaktoren konnten in Isolaten aus Schweinebeständen nachgewiesen werden (Korte et al., 2004;
Gürtler et al., 2005).
Innerhalb der Schweinebestände ist eine fäkal-orale Übertragung und Verbreitung der Yersinien durch Zukauf von Absetzferkeln von verschiedenen Ferkelerzeugern oder über Transportfahrzeuge anzunehmen (Fukushima et al., 1983; Skjerve et al., 1998; Thibodeau et al., 1999). Während von Mastschweinen sehr frequent Y. enterocolitica -Stämme isoliert werden konnten, gelang der Nachweis in Proben von neugeborenen Ferkeln und Sauen nur selten oder z.T. überhaupt nicht (Korte et
Quelle für Saugferkelinfektionen. Nach experimenteller Infektion von tragenden Sauen mit Y. enterocolitica konnte der Erreger aus dem Organmaterial totgeborener Ferkel und der Plazenta isoliert werden (Platt-Samoraj et al., 2009a). Gürtler et al.
(2005) zeigten außerdem eine Persistenz von Y. enterocolitica in den Tonsillen von Mastschweinen. In Untersuchungen von Umweltproben aus Schweinebeständen (Futter, Oberflächen, Staub, Fliegen) konnten keine Yersinien nachgewiesen werden (Gürtler et al., 2005), was für eine direkte Übertragung von Tier zu Tier spricht.
Infektionsquellen für den Menschen
Die psychrophile Eigenschaft von Y. enterocolitica führt zu einer großen Bedeutung des Erregers in der Lebensmittelsicherheit, da eine Vermehrung auch unter Kühlbedingungen (ca. 4°C) möglich ist. Für eine wichtige Rolle des Schweins als Überträger von pathogenen Yersinien auf den Menschen spricht die hohe Nachweisrate von Y. enterocolitica in rohem Schweinefleisch und Schweinefleischprodukten (Fredriksson-Ahomaa et al., 2004). Besonders häufig konnte das Bakterium aus Zunge und Innereien isoliert werden, aber auch aus Hack- und anderen Fleischproben. Fredriksson-Ahomaa et al. wiesen yadA-positive Yersinien in Proben von Tonsillen, Leber, Herz und Nieren von Schlachtschweinen nach (Fredriksson-Ahomaa et al., 2000b; Fredriksson-Ahomaa et al., 2000a). In einer Fallkontrollstudie konnten ail-positive Stämme in 10 % der untersuchten rohen Schweinefleischproben (Lende, Filet, Kotelett, Schinken, Hackfleisch) nachgewiesen werden (Thisted Lambertz S. und Danielsson-Tham, 2005). Fredriksson-Ahomaa et al. (2001a) konnten zeigen, dass es durch den Umgang mit dem Geschlinge während des Schlachtprozesses zu einer Kontamination von Zunge, Lunge, Herz, Leber und ggf. auch Nieren kommt, da Zunge und Tonsillen mit den anderen Organen zusammen an Haken aufgehängt oder auf Förderbänder gelegt werden.
Tauxe et al. (1987) vermuteten die Ursache für eine z.T. hohe Kontamination von Hackfleisch mit Y. enterocolitica in einer regional üblichen Verwertung von Kopffleisch und Tonsillen. In Fallkontrollstudien stellte sich der Verzehr von rohem Schweinefleisch als größter Risikofaktor für die Erkrankung an Yersiniose heraus (Tauxe et al., 1987; Ostroff et al., 1994).
Außer rohem Schweinefleisch spielt in einigen Ländern auch unbehandeltes Trink- oder Oberflächenwasser eine Rolle als mögliche Infektionsquelle (Ostroff et al., 1994; Sandery et al., 1996; Falcao et al., 2004). Der enge Kontakt zu Haustieren, wie
Hunden und Katzen, kommt vor allem für Kleinkinder als eine weitere Infektionquelle infrage. Fredriksson-Ahomaa et al. (2001c) konnten zeigen, dass sowohl für Hunde als auch für Katzen eine Infektion über die Fütterung mit rohem Schweinefleisch und Schlachtnebenprodukten vom Schwein möglich ist und diese Tierarten die Yersinien über einen längeren Zeitraum mit dem Kot ausscheiden.
A.2.3 Yersiniose bei Menschen und Tieren: Klinische Symptome
Die humane Yersiniose zeigt sich klinisch in einer Gastroenteritis mit Diarrhoe. Sie tritt besondes häufig bei Kleinkindern auf und kann bei diesen auch zu einer hämorrhagischen Diarrhoe führen. In älteren Kindern und Jugendlichen tritt oft eine Ileitis und akute mesenterische Lymphadenitis mit krampfartigen Schmerzen (Pseudoappendizitis) auf, die nicht selten zu einer ineffektiven Appendektomie führt.
In Verbindung mit prädisponierenden Faktoren, wie Immundefizienz oder Eisenüberladung, wurden auch Fälle von Sepsis durch Y. enterocolitica beschrieben.
Eine Yersiniose kann außerdem immunogene Spätfolgen, wie reaktive Arthritis, Erythema nodosum, Myocarditis und Glomerulonephritis, nach sich ziehen (Bottone, 1999). Die Primärerkrankung selbst verläuft allerdings häufig als eine milde, selbstlimitierende Diarrhoe (Tauxe et al., 1987). Serologische Untersuchungen bei gesunden Blutspendern in Finnland und Deutschland zeigten eine hohe Prävalenz von Serotyp O:3 bzw. O:9 spezifischen Antikörpern, was auf ein häufiges Vorkommen von subklinischen Infektionen hinweist (Mäki-Ikola et al., 1997).
Beim Schwein treten klinisch manifeste Erkrankungen nur bei Jungtieren auf, ältere Tiere sind symptomlose Träger (Neubauer et al., 2001). In einem Fallbericht wurde eine durch Y. enterocolitica Serotyp O:3 verursachte, letal verlaufende Infektion in einem Minipig-Ferkel geschildert, die mit hochgradiger Enteritis und Septikämie einherging (Brügmann et al., 2001). Dieser Fall scheint allerdings eine seltene Ausnahme zu bilden. Auch in einigen Infektionsversuchen im Schwein konnte unter besonderen Bedingungen eine klinisch manifeste Erkrankung der Tiere beobachtet werden [vgl. 2.8 Infektionsversuche im Schwein].
Experimentelle Infektionen in Mäusen werden unter A.2.7 beschrieben.
Hunde und Katzen gelten wie das Schwein als asymptomatische Träger von Y. enterocolitica (Fenwick et al., 1994; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001c), allerdings
gab es bisher nur wenige Studien zum Vorkommen humanpathogener Yersinien in Haustieren und einer möglichen Übertragung auf den Menschen.
A.2.4 Virulenzfaktoren enteropathogener Yersinien
Y. enterocolitica kolonisiert nach erfolgter oraler Aufnahme den Dünndarm, überwindet die Darmbarriere über M-Zellen und vermehrt sich anschließend im darunterliegenden lymphatischen Gewebe, den Peyerschen Platten (Pujol und Bliska, 2005). Über den Lymphfluss oder Blutgefäße gelangen die Yersinien anschließend auch in die regionalen Lymphknoten und können so eine akute Lymphadenitis verursachen (Bottone, 1999).
Alle bisher als pathogen eingestuften Y. enterocolitica Stämme besitzen nur ein Virulenzplasmid. Dieses 70 kb große Virulenzplasmid (pYV) codiert für ein Typ-III- Sekretionssystem (T3SS) und verschiedene Effektorproteine, die sogenannten Yops (engl.: Yersinia outer proteins): YopH, YopM, YopE, YpkA/YopO und YopJ/P. YopT konnte bisher ausschließlich in Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Effektorproteine werden mithilfe des T3SS über eine nadelähnliche Struktur in die Wirtszelle sezerniert. Sie ermöglichen es dem Bakterium, der angeborenen Immunantwort des Wirtsorganismus zu entgehen. YopH ist eine Tyrosinphosphatase mit antiphagozytischer Wirkung (Viboud und Bliska, 2005). YopE, ein GTPase- aktivierendes Protein, wirkt zytotoxisch (Rosqvist et al., 1994) und konnte im Mausmodell als wichtiger Virulenzfaktor ermittelt werden (Black und Bliska, 2000).
YopM, ein Gerüstprotein, ist im Mausmodell ebenfalls wichtig für die Virulenz des Erregers (Mulder et al., 1989; Navarro et al., 2005). YopT ist eine Cysteinprotease mit antizytotoxischer Wirkung (Trosky et al., 2008), YpkA/YopO verhindert als multifunktionelles Protein u.a. die Phagozytose des Bakteriums und wird ebenfalls für einen virulenten Phänotyp in der Maus benötigt (Grosdent et al., 2002; Navarro et al., 2005; Wiley et al., 2006; Trasak et al., 2007). YopJ, eine Serin- Threoninacetyltransferase, blockiert die Zytokinproduktion durch Hemmung von Signalwegen in infizierten Zellen und fördert dadurch die Apoptose der Wirtszelle (Palmer et al., 1998). YopB stellt kein eigentliches Effektorprotein dar, sondern wird als Bestandteil der Pore für die Translokation der Yops benötigt (Tardy et al., 1999).
Außer den Genen für das T3SS und die Effektorproteine befinden sich auf dem pYV auch die Gene für yadA (Yersinia Adhäsin A) und virF, einen Transkriptionsfaktor,
der das Virulenz-Regulon aktiviert. YadA vermittelt außer seiner adhäsiven Funktion auch die Fähigkeit der pathogenen (Virulenzplasmid tragenden) Yersinien zur Autoagglutination (Laird und Cavanaugh, 1980; Roggenkamp et al., 1996) und besitzt protektive Eigenschaften gegenüber dem Komplementsystem des Wirtsorganismus (Schindler et al., 2012). Das Virulenzplasmid vermittelt die Fähigkeit der pathogenen Yersinien, zu denen die Biotypen 1B, 2, 3, 4 und 5 gerechnet werden, in lymphatischem Gewebe zu überleben und sich zu vermehren (Tennant et al., 2003). In Studien mit verschiedenen Serotypen konnte gezeigt werden, dass pathogene Y. enterocolitica Stämme das Virulenzplasmid auch unter Kultivierungsbedingungen mit sehr hohem Salzgehalt oder niedrigem pH, wie sie zur Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt werden, nicht verlieren (Bhaduri, 2011).
Das Vorhandensein des Virulenzplasmids allein genügt allerdings nicht für die vollständige Ausprägung eines virulenten Phänotyps (Heesemann et al., 1984).
Chromosomal codierte Virulenzfaktoren sind außerdem Invasin (invA), Ail (engl.:
attachment and invasion locus), Myf (engl.: mucoid yersinia factor) und das hitzestabile Enterotoxin Yst (engl.: Yersinia stable toxin). Ail ist ein membranassoziiertes Protein, das unabhängig von Invasin die Aufnahme der Bakterien in die Wirtszellen vermittelt (Miller und Falkow, 1988). Außerdem begünstigt Ail ebenso wie YadA eine Serumresistenz der Yersinien. Das Myf-Antigen ist ein fimbrienähnliches Oberflächenprotein und putatives Adhäsin (Iriarte et al., 1993). Das hitzestabile Enterotoxin (Yst) der Yersinien weist Ähnlichkeit mit dem bei enterotoxischen Escherichia coli vorkommenden Enterotoxin auf, weshalb davon ausgegangen wird, dass es für das Auftreten von Diarrhoe im Rahmen einer Yersiniose verantwortlich ist (Takao et al., 1985).
Es wurde mehrfach eine Korrelation zwischen den Bioserotypen und dem Vorkommen der verschiedenen Virulenzfaktoren nachgewiesen (Thoerner et al., 2003; Falcao et al., 2004; Gürtler et al., 2005).
A.2.5 Bedeutung des Virulenzfaktors Invasin
Für das Anhaften an und die Invasion in Epithelzellen werden die beiden chromosomal codierten Virulenzgene invasin (invA) und ail (engl.: attachment and invasion locus) benötigt (Fredriksson-Ahomaa et al., 2006a). Auch yadA vermittelt
die Adhäsion an Epithelzellen, allerdings spielt es eine größere Rolle im späteren Stadium der Infektion, z.B. für die Persistenz in Lymphfollikeln (Pepe et al., 1995).
Invasin wird bislang als wichtigster Faktor für die initiale Invasion der Bakterien in die Darmepithelzellen und das darunterliegende Gewebe angesehen (Miller und Falkow, 1988). Es ist ein relativ großes Protein (92 kD) auf der Bakterienoberfläche, das direkt an β1-Integrine der antigenpräsentierenden M-Zellen bindet und so die Internalisierung der Bakterien in die Zellen vermittelt (Grützkau et al., 1990; Clark et al., 1998).
Die invasin-Expression wird temperaturabhängig durch den Transkriptionsfaktor RovA (engl.: regulator of virulence A) reguliert (Ellison et al., 2004; Heroven et al., 2008; Quade et al., 2012). RovA, ein globaler Regulator, bindet direkt an den Promotor des invA-Gens und aktiviert dadurch die Bildung von Invasin (Nagel et al., 2001). RovA zeigt dabei eine antagonistische Wirkung gegenüber H-NS (engl.:
histone-like nucleoid structuring protein) und YmoA (engl.: Yersinia modulator A), die die invA-Expression inhibieren (Heroven et al., 2004; Ellison und Miller, 2006). Bei Temperaturen von 37°C ändert sich die Faltung des RovA-Proteins. Seine DNA- Bindungskapazität verringert sich bei diesen Temperaturen und es wird leichter angreifbar für die Spaltung durch ATP-abhängige Proteasen. Da die Expression von rovA positiv autoreguliert ist, vermindert dies die Bildung von RovA in den Bakterien erheblich (Herbst et al., 2009).
In Y. enterocolitica Serotyp O:3 (YeO:3) führt eine Punktmutation zum Austausch einer Aminosäure im RovA-Protein (Prolin wird durch Serin ersetzt). Das RovA des YeO:3 (RovAO:3 bzw. RovAS98) bleibt dadurch bei 37°C in seiner Proteinfaltung stabil, weist eine verbesserte DNA-Bindung auf und ist weniger empfänglich für den Abbau durch ATP-abhängige Proteasen als das RovA des Serotyps O:8 (RovAP98) (Herbst et al., 2009; Uliczka et al., 2011).
Uliczka et al. (2011) konnten zeigen, dass ein weiterer Unterschied zwischen YeO:3 und YeO:8 im Vorhandensein eines Insertionselements im Promotorbereich des invA-Gens (PinvAIS1667) bei Serotyp O:3 liegt. Dieses Insertionselement beinhaltet einen zusätzlichen Promotor und erhöht dadurch die Expression des Virulenzgens invA. Bei Serotyp O:8 fehlt ein solches Insertionselement. Die beiden beschriebenen Unterschiede führen letztlich zu einer erhöhten Invasinbildung in YeO:3 verglichen mit YeO:8.
A.2.6 Kultureller Nachweis pathogener Yersinien
Eine einheitliche Vorgabe zum kulturellen Nachweis von präsumptiv pathogenen Y. enterocolitica in Lebens- und Futtermitteln findet sich in der Norm DIN EN ISO 10273:2003-12.:
„In der Norm ist ein horizontales Verfahren zum Nachweis von präsumtiv pathogenen Yersinia enterocolitica festgelegt. Der Nachweis wird in drei aufeinander folgenden Schritten durchgeführt: Der Anreicherung in den selektiven flüssigen Medien PSB- Bouillon und ITC-Bouillon folgt die Verbringung der gewonnenen Kulturen auf CIN- Agar und SSDC-Agar zwecks Identifizierung. Nach 24- bzw. bei Bedarf 48-stündiger Inkubation in Abhängigkeit vom Medium wird die Anwesenheit charakteristischer Kolonien von Y. enterocolitica geprüft. Es folgen die biochemische Bestätigung sowie die Prüfungen zur Biotypisierung, die Prüfung zur Feststellung der Pathogenitätskriterien und falls erforderlich serologische Untersuchungen.“
Eine Evaluierung dieser Methode zeigte allerdings eine sehr geringe Sensitivität der kulturellen Methode. Mit dieser gelang der Nachweis pathogener Yersinien in Lebensmitteln erst ab einer Belastung von >104 KBE/g, während der Nachweis mittels Real-Time PCR zum Nachweis des ail-Gens als geeignete Screening- Methode beschrieben wurde (Fredriksson-Ahomaa et al., 2008).
Für den kulturellen Nachweis von Y. enterocolitica aus Proben mit geringem Keimgehalt oder hoher Begleitflora eignet sich die Kälteanreicherung bei 4°C in PBS für bis zu 21 Tage mit wöchentlichem Ausstrich auf Selektivnährböden. Die Anzucht auf Nährböden erfolgt bei 28-30°C für bis zu 48 Std. Auf CIN-Agar (Yersinia-Agar nach Schiemann) bildet Y. enterocolitica charakteristische, feine dunkelviolette Kolonien, die von einem transparenten Hof umgeben sind (Bisping W. und Amtsberg G., 1988). Das Vorhandensein des pYV geht mit bestimmten phänotypischen Merkmalen einher, die in die diagnostische Untersuchung mit einbezogen werden können. Zu diesen Merkmalen gehören die Autoagglutination (Laird und Cavanaugh, 1980; Aulisio et al., 1983), die Calciumabhängigkeit des Wachstums (Gemski et al., 1980), die Kristallviolettbinding (Bhaduri et al., 1987) und die Kongorotbindung (Prpic et al., 1983).
A.2.7 Infektionsversuche im Mausmodell
Schiemann et al. (1988) zeigten in experimentellen Infektionen im Mausmodell, dass YeO:8 virulenter war als YeO:3, letzterer allerdings bis zu fünf Tage p.i. in hohem Maße mit den Faeces ausgeschieden wird. Auch in anderen Studien wurde YeO:8 in Mäusen als sehr virulent beschrieben (Robins-Browne und Prpic, 1985).
Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm 8081v zeigte sich im Mausmodell wesentlich weniger virulent, wenn das invasin-Gen ausgeschaltet wurde. Die LD50 allerdings blieb bei der invA-Mutante und dem Wildtyp sowohl bei oraler als auch bei intraperitonealer Infektion der Mäuse gleich (Pepe und Miller, 1993).
Y. enterocolitica Serotyp O:8-Mutanten, denen das rovA fehlt, zeigten sich im Mausversuch insofern attenuiert als sie in geringerer Anzahl in Organen nachweisbar waren und eine mildere Entzündung in den Peyerschen Platten auslösten als der YeO:8 Wildtyp (Dube et al., 2003). Auch eine 70fach erhöhte LD50 im Vergleich mit dem Wildtypstamm konnte gezeigt werden (Revell und Miller, 2000). Dube et al.
(2003) fanden allerdings heraus, dass sich diese Attenuierung in erster Linie nach oraler Infektion der Mäuse zeigte, während die rovA-Mutante nach intraperitonealer Infektion wesentlich virulenter erschien. Diese Beobachtung werteten sie als Hinweis darauf, dass RovA eine wesentliche Rolle in den ersten Phasen der Infektion spielt.
Insgesamt zeigte sich die rovA-Mutante um ein vielfaches abgeschwächter, als eine invA-Mutante, was darauf hindeutet, dass RovA außer invA noch weitere Virulenzgene reguliert, die ebenfalls notwendig für eine Invasion der Bakterien in die Peyerschen Platten oder tiefer liegende Gewebe sind (Ellison et al., 2004).
Uliczka et al. (2011) testeten Serotyp O:3-Mutanten im Mausmodell und konnten in Infektionen mit jeweils einem Stamm pro Tiergruppe keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante feststellen. In Koinfektionsversuchen allerdings konnten sie eine wesentlich größere Organbelastung mit einer RovAP98-Mutante feststellen, die das weniger stabile RovA des YeO:8 exprimierte, als mit dem YeO:3 Wildtypstamm Y1. Im Kontrast dazu konnten Uliczka et al. (2011) auch zeigen, dass eine PinvAΔIS1667-Mutante, der das Insertionselement im invA-Promotorbereich fehlte, im Vergleich zum YeO:3 Wildtyp in wesentlich geringeren Mengen aus den Peyerschen Platten und den mesenterialen Lymphknoten der infizierten Mäuse reisoliert werden konnte.
A.2.8 Infektionsversuche im Schwein
Fukushima et al. (1984) fanden nach oraler experimenteller Infektion von Mastschweinen verschiedenen Alters große Unterschiede zwischen den Individuen bezüglich der Ausscheidung der Yersinien mit den Faeces. Die Ausscheidung nach einer Infektion mit Bioserotyp 4/O:3 schien dabei unabhängig vom Alter der Tiere, für eine Infektion mit Bioserotyp 2/O:5,27 erschienen jüngere Tiere anfälliger. Die Infektionsdosis betrug 2,6x109 KBE und wurde per Katheter direkt in den Magen appliziert. Nach einer Infektion mit gleichzeitiger Gabe von 100 ml einer 10 %igen NaHCO3-Lösung konnte nachfolgend eine höhere Ausscheidung beobachtet werden.
In den Faeces konnten 102 bis 106 KBE/g über mehrere Wochen p.i. nachgewiesen werden. Außerdem wurde eine horizontale Übertragung beobachtet.
Robins-Browne et al. (1985) untersuchten die Pathogenität von Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 sowie verschiedener Mutanten in gnotobiotischen Ferkeln. Sie beobachteten, dass eine klinische Manifestation in den Tieren mit intestinalen Läsionen in Abhängigkeit von der Infektionsdosis auftrat: Nach oraler Infektion mit 2x109 KBE pro Tier war der Verlauf subklinisch bis mild, während alle gnotobiotischen Ferkel, die 4x1010 KBE erhielten, innerhalb von 24 Stunden verendeten. Pathologisch-anatomisch sowie histologisch konnten in den Organen der Tiere leicht geschwollene mesenteriale Lymphknoten, Nekrosen in der Lamina propria (L. propria), bakterielle Mikrokolonien, Entzündungszellen und Ulzera an den Zottenspitzen sowie Zottenverlust festgestellt werden. Dabei war das Ileum stärker betroffen als Jejunum und Dickdarm. Elektronenmikroskopisch konnten Bakterien im Zytoplasma von Phagozyten beobachtet werden. Bioserotyp 1/O:5 hingegen zeigte keine Invasion in die Darmwand oder extraintestinale Organe. Es konnten keine Auswirkungen des Enterotoxins und kein entsprechendes Toxin im Darm nachgewiesen werden. Mutanten, denen das Virulenzplasmid fehlte, lösten keine klinischen Symptome in den infizierten Tieren aus, waren jedoch aus dem Gewebe isolierbar.
Schiemann (1988) verglich in per Kaiserschnitt entbundenen Ferkeln ohne Kolostrumgabe und natürlich geborenen Ferkeln die Infektion mit Y. enterocolitica Serotyp O:8, O:21, O:3 und O:13, wobei Serotyp O:3 nicht in natürlich geborenen Ferkeln untersucht wurde. Letztere schieden die Bakterien in geringeren Mengen
dass sich die Infektion bei Ferkeln normalerweise auf Rachen und Darmtrakt beschränkte. Eine klinisch manifeste Erkrankung konnte in den natürlich geborenen Ferkeln mit Zugang zu Kolostrum nicht beobachtet werden, obwohl diese mit einer sehr hohen Infektionsdosis von 1013 KBE belastet wurden. Per Kaiserschnitt entbundene Ferkel erhielten 1010 KBE und entwickelten nach erfolgter Infektion mit den Serotypen O:13 und O:21 schwere Symptome oder verendeten. Auch bei Serotyp O:8 zeigte sich eine schwerwiegende Erkrankung in einem von zwei per Sektio entbundenen Ferkeln. In allen infizierten Tieren wurde eine bakterielle Kolonisation der Tonsillen und Ausscheidung mit den Faeces nachgewiesen. Da sich die natürlich geborenen Ferkel wesentlich weniger anfällig zeigten und keines von ihnen trotz der sehr hohen Infektionsdosis verendete oder schwere Symptome zeigte, zog Schiemann den Schluss, dass Y. enterocolitica nicht sehr virulent für Ferkel sei.
Thibodeau et al. (1999) infizierten fünf Wochen alte Hybridschweine mit ca. 108 KBE YeO:3 und fanden anschließend keine klinischen Symptome in den infizierten Tieren und pathologisch-anatomisch nur ggr. Läsionen im Magendarmtrakt.
Thibodeau et al. (2001) infizierten ebenfalls fünf Wochen alte Hybridschweine mit einer „relativ geringen Infektionsdosis“ der Serotypen O:3, O:5,27 und O:9 und konnten nachfolgend keine klinischen Symptome beobachten. Sie reisolierten die Bakterien aus den Tonsillen und Faeces der Tiere, konnten sie allerdings nicht in den Lnn. retropharyngei, den mesenterischen Lymphknoten, dem Ösophagus, Duodenum, Jejunum, Ileum (PPs), Magen, sowie der Leber und Milz nachweisen.
Nielsen et al. (1996) infizierten SPF-Schweine über das Futter mit ca. 108 KBE Y. enterocolitica Bioserovar 4/O:3. Sie konnten ebenfalls keine klinisch manifeste Erkrankung der Tiere feststellen, fanden die Bakterien jedoch vom fünften bis zum 21. Tag p.i. in den Faeces.
Platt-Samoraj et al. (2009a) infizierten tragende Sauen auf oralem Weg in verschiedenen Trächtigkeitsstadien mit ca. 2,7x109 KBE eines Y. enterocolitica Serotyp O:3 Stamms, der zuvor aus Tonsillen eines abortierten Schweinefetus isoliert worden war. Auch die Sauen zeigten keine Klinik bis auf die spät infizierten (Tag 89 dp) Tiere, die eitrigen Vaginalausfluss aufwiesen. Die Sauen zeigten einen unauffälligen Trächtigkeitsverlauf ohne Aborte, allerdings gelang der Nachweis der Yersinien in Rektal-, Oral-, Vaginal- und Halstupfern und zudem in Placentaproben und Organen von totgeborenen Ferkeln. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass
nach einer Infektion im letzten Drittel der Trächtigkeit eine intrauterine Übertragung auf die Ferkel möglich sei.
Experimentelle Infektionen mit Y. enterocolitica in Minipigs wurden bisher nicht beschrieben. Auch ein orales Infektionsmodell in Hybridschweinen, das für Folgestudien eingesetzt wurde, ist bislang nicht publiziert worden.
B Material und Methoden
B.1 Bakterienstämme, Kultivierung und Differenzierung B.1.1 Verwendete Yersiniaenterocolitica-Stämme
Für die experimentellen Infektionen wurden zwei verschiedene Wildtypstämme von Yersinia (Y.) enterocolitica eingesetzt. Der Stamm Y1 gehört zum Bioserotyp 4/O:3 (YeO:3) und stammt von einem humanen Patienten. Stamm 8081v gehört zum Bioserotyp 1B/O:8 (YeO:8) und ist ebenfalls ein Patientenisolat aus der Humanmedizin. In den Koinfektionsversuchen [vgl. C.3.2] wurde zudem der Stamm YE13 eingesetzt. Dieser verhält sich wie Stamm Y1, besitzt aber eine Kanamycin- resistenzkassette, die es ermöglicht, ihn von der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 zu unterscheiden. Die drei in den Koinfektionsversuchen eingesetzten Mutanten stammen ebenfalls vom YeO:3 Stamm Y1. In der RovA-Stabilitätsmutante YE14 wird das bei 37°C weniger stabile RovA des YeO:8 exprimiert (RovAP98, RovAYeO:8); bei diesem ist die Aminosäure Serin des RovA-Proteins an der Position 98 durch Prolin ersetzt. Bei der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 fehlt das Insertionselement im invA- Promotorbereich. Das IS1667 ist bei YeO:3 vorhanden und führt zu einer verstärkten invA-Expression, fehlt aber bei YeO:8. Der ∆invA-Mutante fehlt das invA-Gen, dadurch wird Invasin A nicht exprimiert. Die Stämme YE13, YE14 und YE21 sind kanamycinresistent (KnR) aufgrund einer chromosomal verankerten Kanamycin- resistenzkassette, während die Stämme 8081v, Y1 und YE15 kanamycinsensibel sind (Tab. 1). Die Stämme YE13, YE14, YE15 und YE21 wurden in der Arbeit von Frank Uliczka, Ph.D. konstruiert (Uliczka et al., 2011). Der Serotyp O:8 Stamm 8081v wurde von Pepe und Miller (1993) beschrieben. Alle eingesetzten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Yersinienstämme wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Petra Dersch (Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie, Helmholtz- Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig) und Dr. Eckhard Strauch (Bundesinstitut für Risikobewertung) im Rahmen der Kooperation innerhalb des BMBF-Forschungsverbunds Foo-Borne Zoonotic Infections of Humans (FBI-Zoo) zur Verfügung gestellt.
Tab. 1: Verwendete Y. enterocolitica Stämme und deren Herkunft.
B.1.2 Herstellung der Bakteriensuspension für die orale Infektion
Die Yersinien wurden zunächst auf Blutagar mit 3 % Schafblut über Nacht angezüchtet. Dann wurde eine Einzelkolonie in 50 ml LB-Medium in einen 4er- Schikanekolben überimpft und über Nacht (für 13 bis 15 h) bei 25°C und 150 rpm in einem Inkubations-Schüttler (CERTOMAT® IS, Sartorius Stedim Biotech, Sartorius) inkubiert. Bei der Anzucht der Kanamycin-resistenten Stämme (YE13, YE14, YE21) wurden dem LB-Medium 25 µg Kanamycin pro ml zugesetzt. Von den Übernachtkulturen (ÜNK) wurden 30 ml Aliquots bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet in sterilem PBS aufgenommen. Der Waschschritt in PBS wurde dreifach durchgeführt. Anschließend wurde die Infektionssuspension mit sterilem PBS auf eine OD600 = 1,0 eingestellt (Eppendorf Bio Photometer, Eppendorf AG). Diese Trübung entspricht einer Konzentration von ca. 109 KBE/ml. Für die orale Infektion wurde die benötigte Menge pro Tier in 1 ml sterilem PBS aufgenommen und jede Infektionsdosis bis zur Verwendung in einem 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß auf Eis gelagert. Die Reinheit der ÜNK und der Verdünnung in PBS wurde mittels fraktionierten Ausstrichen auf Blut- und Gassneragar kontrolliert. Die exakte Infektionsdosis wurde durch Verdünnungsreihen der OD600 = 1,0 Lösung bestimmt. Hierzu wurden vier Verdünnungsstufen (10-4 bis 10-7) im Doppelansatz auf LB-Agar ausgestrichen (je 100µl), über Nacht bei 30°C inkubiert und die KBE/100 µl gezählt.
Die Zusammensetzung bzw. Herstellung aller Medien, Nährböden und Antibiotikazusätze ist im Anhang aufgeführt.
B.1.3 Quantitative Isolierung der Yersinien und Differenzierung durch Resistenzen
Die bei der Sektion entnommenen Organproben von Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum (nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener Infektionsdosen, vgl. C.1.1), mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales), Leber, Milz und Niere wurden quantitativ auf die Belastung mit Y. enterocolitica untersucht.
Tonsillen und Darmabschnitte wurden zuvor mit sterilem PBS gespült und für 30 Min.
in Gentamicinlösung (50 µg/ml in PBS) inkubiert, um Bakterien auf der (luminalen) Oberfläche abzutöten. Nach der Inkubation mit Gentamicin wurden die Tonsillen und Darmabschnitte dreimal mit sterilem PBS gewaschen. Die Organstücke wurden gewogen und ca. 1 g pro Organ wurde in 5 ml sterilem PBS homogenisiert (30000 rpm, 30 Sek., Polytron PT 2100 Homogenisator, Kinematica AG). Von vier Verdünnungsstufen (100, 10-1, 10-2, 10-3) dieses Homogenisats wurden je 50 µl im Doppelansatz auf CIN-Agar mit Carbenicillinzusatz (carb) ausplattiert, bei 30°C für bis zu 48 Std. inkubiert und die Kolonien ausgezählt. Im Rahmen der Koinfektionsversuche wurde je ein Doppelansatz jeder Verdünnungsstufe auf CIN- Agar mit (CIN +carb +Kn) und ohne zusätzlichen Kanamycinzusatz (CIN +carb) ausplattiert. In der statistischen Auswertung wurden nur Zählwerte ≥ 15 Kolonien pro Platte berücksichtigt. Von jeder Agarplatte wurde eine typische Kolonie subkultiviert, um den jeweiligen Y. enterocolitica -Stamm zu überprüfen [vgl. B.1.5].
B.1.4 Qualitative Isolierung der Yersinien mittels Kälteanreicherung
Rektal- und Tonsillentupfer, Kotproben und Organproben aus der Sektion wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht. Im Fall der Organproben geschah dieses zusätzlich zur quantitativen Untersuchung, da die Kälteanreicherung zwar nur eine rein qualitative Aussage zulässt, aber sensitiver ist als die Direktkultur (Bisping W. und Amtsberg G., 1988). Tupfer, 1 g Kot bzw. 200 µl des Organ- Homogenisats [s. B.1.3] wurden zu 9 ml sterilem PBS in Reagenzgläser gegeben und für 21 Tage bei 4°C inkubiert. Jeweils nach sieben, vierzehn und einundzwanzig Tagen wurden fraktionierte Ausstriche auf CIN-Agar untersucht. In Koinfektionsversuchen wurden diese auf CIN-Agar mit und ohne Kanamycinzusatz ausgestrichen. Von typisch aussehenden Kolonien wurden Subkulturen biochemisch untersucht [s. B.1.5].
B.1.5 Biochemische Differenzierung der Isolate
Von den Kolonien, die auf CIN-Agar die für Y. enterocolitica charakteristische Morphologie zeigten (dunkelviolette, kleine Kolonien mit hellem Randsaum, Ø 1 mm, Nährboden um die Kolonien rosa verfärbt), wurden Subkulturen auf Blut- und Gassneragar angelegt. Wenn auch diese morphologisch Y. enterocolitica entsprachen (auf Blutagar feine, weißlich-undurchsichtige Kolonien, Ø 1 mm, laktosenegativ auf Gassneragar) und ein Oxidasetest (Bactident® Oxidase, Merck KGaA) negativ ausfiel, wurde eine weitere biochemische Differenzierung durchgeführt. Folgende Reaktionen wurden hierbei überprüft: H2S-Bildung (Kligler- Agar), Harnstoffabbau (Urease), Citratverwertung, Mannitspaltung, Ornithin- decarboxylase (ODC), oxidativer und fermentativer Kohlenhydratabbau (O/F-Test) und Indolbildung. Weitere biochemische Reaktionen wurden nach Bedarf durchgeführt, um die Infektionsstämme von vor der Infektion von den Minipigs isolierten Stämmen (Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. enterocolitica) zu unterscheiden. Die ggf. zusätzlich getesteten Reaktionen waren Inositspaltung (Säurebildung aus Myo-Inosit), Rhamnoseabbau und Äskulinspaltung. Die biochemischen Reaktionen der eingesetzten Yersinienstämme sind in Tabelle 2 dargestellt. In den wenigen Fällen, in denen Yersinien bei der Einstallung aus Kottupfern isoliert wurden, war es nie möglich, diese im weiteren Versuchsverlauf erneut aus Proben der Tiere zu isolieren.
Tab. 2: Biochemische Reaktionen der eingesetzten Y. enterocolitica Stämme.
Von den aus Organproben gewonnenen Isolaten wurde zusätzlich pro Tier ein Isolat mit dem API 20E®-Testsystem (bioMérieux Deutschland GmbH) untersucht.
B.2 Versuchstiere, experimentelle Infektionen und Versuchsdesign
Insgesamt wurden fünf Tierversuche mit 114 Minipigs durchgeführt. Die Ferkel waren zwischen fünf und sieben Wochen alt (durchschnittliches Alter: 44 Tage). Es wurden sowohl weibliche als auch kastrierte männliche Tiere für die Versuche eingesetzt (65 ♂, 49 ♀). Die Aufteilung in Gruppen erfolgte randomisiert nach Geschlecht und Alter.
Die Tierversuche erfolgten in Kooperation mit Frau Prof. Dr. Petra Dersch und Julia Schaake, M. Sc. aus der Abteilung Molekulare Infektionsbiologie des Helmholtz- Zentrums für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig.
B.2.1 Herkunft, Unterbringung und Versorgung der Versuchstiere
Die Mini-Lewe-Ferkel stammten vom Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Absetzferkel und Sauen wurden vor dem ersten Tierversuch stichprobenartig auf das Vorhandensein von Yersinien untersucht, alle Stichproben waren in der bakteriologischen Untersuchung negativ.
Die Antikörpertiter der eingestallten Ferkel in der serologischen Untersuchung lagen unterhalb des „Cut-off“-Wertes und waren somit als negativ einzustufen.
Versuche, in denen ausschließlich Wildtypstämme untersucht wurden, fanden in den Stallungen des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt. Koinfektionsstudien mit gentechnisch veränderten Stämmen wurden in der Isolierstation des Instituts für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Minipigs wurden in Gruppen von mindestens drei bis maximal zwölf Ferkeln in Ställen von etwa 8 m2 (Institut für Mikrobiologie) bzw. 11 m2 (Isolierstation des Instituts für Virologie) eingestallt. In ersterem wurde ein Teil des Stalls mit Stroh eingestreut, in letzterem wurden im Liegebereich Gummimatten ausgelegt.
Rotlichtlampen ermöglichten es den Tieren, aktiv den für sie angenehmsten Temperaturbereich zum Ruhen aufzusuchen. Diese wurden entfernt, wenn die Ferkel nicht mehr darunter lagen. Die Tiere wurden innerhalb der ersten fünf Tage dreimal, an den folgenden Tagen zweimal täglich gefüttert, sie erhielten je nach Alter und Körpergewicht 200 bis 250 g/Tag eines kommerziellen Futters. Die Ration stellte sich
zu je 50 % aus Ferkelstartern (primo wean, deuka, Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG) und einem Spezialfutter für Minipigs (ssniff®MPigH, ssniff Spezialdiäten GmbH) zusammen. Zusätzlich wurden zur Beschäftigung Heucobs (pre alpin, Agrobs GmbH) und mit geringen Mengen pelletierten Futters gefüllte Spielbälle angeboten.
Zweimal täglich wurden die Stalltemperatur und Luftfeuchte sowie das Allgemeinbefinden der Tiere (Haltung, Verhalten, Futteraufnahme, Kotabsatz, Körpertemperatur) kontrolliert und dokumentiert.
Die Haltung, Unterbringung und jede Behandlung der Tiere erfolgte gemäß den Vorgaben des Tierschutzgesetzes (Genehmigung durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Aktenzeichen 33.12- 42502-04-10/0173 und 33.9-42502-04-11/0462) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Europäischen Übereinkommens zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere und den Empfehlungen der GV-SOLAS.
B.2.2 Versuchsaufbau
Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Tonsillen- und Rektaltupferproben genommen, und die Tiere wurden in die zuvor festgelegten Gruppen unterteilt. Nach siebentägiger Eingewöhnungszeit erfolgte die orale Infektion der Minipigs mit 109 KBE Y. enterocolitica pro Schwein. Nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener Infektionsdosen (vgl. C.1.1) wurden Infektionsdosen von 108, 109 und 1010 KBE/Tier eingesetzt. Nach der oralen Infektion wurden Rektaltupfer zweimal wöchentlich bakteriologisch und Blutproben einmal wöchentlich hämatologisch und serologisch untersucht. Am siebten bzw. 21. Tag p.i. wurden die Schweine euthanasiert, seziert und sowohl Organ- als auch Kotproben für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Auch die pathologisch-anatomische Untersuchung und die Entnahme von Organproben für die histopathologische Beurteilung wurden während der Sektion durchgeführt. Die letzte Blutentnahme fand ebenfalls am Tag der Sektion der Tiere statt (Abb. 1).
Abb. 1: Zeitlicher Ablauf des Versuchs. (Angegeben in Tagen vor (-) und nach der Infektion)
B.2.3 Orale Infektion der Minipigs
Die Infektionsdosen [vgl. B.1.2] wurden in 1 ml sterilem PBS suspendiert und in Eppendorf-Reaktionsgefäßen auf Eis zu den Stallabteilen transportiert. Im Stallbereich wurde jede Dosis einzeln resuspendiert, mit einer sterilen 2 ml- Einmalspritze aufgezogen und den Tieren direkt in die Maulhöhle eingegeben. Eine Person fixierte dabei das Tier, eine weitere öffnete und fixierte das Maul und eine dritte Person applizierte die Bakteriensuspension, so dass die Infektion immer von drei Personen durchgeführt wurde. Die Infektionen erfolgten immer morgens unmittelbar vor der morgendlichen Fütterung. Die Kontrolltiere erhielten je 1 ml steriles PBS („Pseudoinfektion“), das ihnen auf die gleiche Art eingegeben wurde.
B.2.4 Probenentnahme
Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Rektal- und Tonsillentupfer genommen. Hierzu wurden die Tiere fixiert. Für das Abtupfern der Tonsillen wurde das Maul mit einem arretierbaren Maulgatter geöffnet und mit einem sterilen Tupfer (UNI-TER AMIES CH, Meuss S.r.l.) fest über die Tonsillen gestrichen. Für Rektaltupfer wurde der sterile Tupfer vorsichtig in den Anus eingeführt. Die Tupfer wurden anschließend im mitgelieferten Amies-Medium mit Kohlezusatz ins Labor transportiert. Rektaltupfer wurden nach der Infektion zweimal wöchentlich genommen.
Für hämatologische und serologische Untersuchungen wurden den Minipigs einmal wöchentlich EDTA- und Serumproben (EDTA-, Serum-Monovetten®, Sarstedt AG &
Co.) unter Verwendung steriler Einmalkanülen (18G 11/2'') entnommen. Dieses
geschah durch Punktion der Vena cava cranialis, für die die Tiere in Rückenlage fixiert wurden. Es wurden maximal 5 ml Blut/kg Körpergewicht pro Woche entnommen (entsprechend den Vorgaben der Tierärztlichen Vereinigung für Tierschutz (TVT) e.V.). Die letzte Blutentnahme fand unmittelbar vor der Euthanasie und Sektion der Tiere statt. Um unnötigen Stress für die Tiere zu vermeiden, wurden sie bereits vor der Blutentnahme mit Ketamin (80 mg/kg KGW i.m.; Ursotamin®, Serum-Werke-Bernburg AG) und Azaperon (16 mg/kg KGW i.m.; Stresnil®, Janssen- Cilag GmbH) narkotisiert. Während des ersten Tierversuchs wurde initial eine Dosis von 3 mg/kg KGW Azaperon und 25 mg/kg KGW Ketamin verabreicht. Diese führte jedoch häufig nicht zu einer ausreichenden Narkosetiefe und zur Notwendigkeit von Nachdosierungen. Aus diesem Grund wurde ab dem zweiten Tierversuch bereits initial die oben erwähnte, hohe Dosierung mit sehr gutem Erfolg verwendet. Die Blutentnahme erfolgte unter der Narkose durch eine Herzpunktion mit direkt anschließender Euthanasie durch die intracardiale Applikation von Pentobarbital (120 mg/kg KGW, Release®, WDT eG).
Nach Eintritt des Todes wurden die Minipigs auf einen Sektionstisch verbracht und Brust und Bauchhöhle eröffnet. Während der Sektion wurden von jedem Tier mit sterilem Sektionsbesteck folgende Proben in eben dieser Reihenfolge entnommen:
Leber, Milz, Nieren, mesenteriale Lymphknoten (Lnn. jejunales), Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum (nur für den Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3), Kot aus dem Rectum und Tonsillen. Alle Organe wurden während der Entnahme aus dem Tierkörper makroskopisch untersucht.
Durch die Reihenfolge der Probenentnahme von eher gering hin zu voraussichtlich stark kontaminierten Organen sollte das Risiko einer Kontamination bei der Entnahme minimiert werden. Die Proben wurden in fest verschlossenen, sauberen Plastikgefäßen direkt nach der Entnahme ins Labor transportiert.
B.2.5 Pathologisch-anatomische Untersuchung
Vor der Sektion wurden die Körperoberfläche und die Körperöffnungen begutachtet.
Nach der Eröffnung der Brust- und Bauchhöhle wurden die Pleura, Lungen und Herz untersucht. Dabei wurde auf Verklebungen insbesondere der Spitzenlappen geachtet und der Herzbeutel eröffnet. Danach wurden das Peritoneum, Leber, Milz und Nieren
Es wurde darauf geachtet, ob die Nierenkapsel leicht abziehbar war, um Hinweise auf entzündliche oder nekrotische Prozesse zu erhalten. Alle Organe wurden während der Untersuchung angeschnitten, um die Schnittfläche beurteilen zu können. Die mesenterialen Lymphknoten sowie die einzelnen Darmabschnitte wurden zur Begutachtung aus der Bauchhöhle heraus gelagert und palpiert, jedoch nicht zusätzlich zur Entnahme der nötigen Proben longitudinal eröffnet.
B.2.6 Histopathologische Untersuchung
Für die histologische Untersuchung wurden Organproben von Leber, Milz, Ileum und mesenterialen Lymphknoten sofort nach der Entnahme für mindestens 24 Std. in 10 %igem, nicht-gepuffertem Formalin fixiert und für die histopathologische Untersuchung in das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover verbracht. Dort fand die weitere Herstellung der histologischen Schnitte (Paraffineinbettung, Schnittherstellung mittels Mikrotom, Hämatoxylin-Eosin (HE) - Färbung) und die Beurteilung dieser in Kooperation mit Dr. Frauke Seehusen statt.
B.2.7 Serologische Untersuchung
Die serologischen Untersuchungen wurden in Kooperation mit Dr. Alexandra von Altrock in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit einem ELISA-Testsystem (PIGTYPE® YOPSCREEN ELISA Testkit, Labor Diagnostik Leipzig GmbH/ Quiagen Leipzig GmbH) durchgeführt. Dieses basiert auf rekombinanten Yops (engl.: Yersinia outer proteins) und dient zum Nachweis von Antikörpern gegen pathogene Yersinien bei Schweinen. Der ELISA wurde entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt und ausgewertet.
B.3 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms SAS® (SAS Institute Inc., Cary) in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. Lothar Kreienbrock und Herrn Dr.
Martin Beyerbach aus dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Die relative virulence ratio (RVR) und der competitive index (CI) zur Auswertung der Koinfektionsversuche wurden wie folgt berechnet:
RVR: % im Organ % im Inoculum CI: RVR Mutante
RVR wt
Die Auswertung der RVR und des CI erfolgte mit GraphPad Prism® in Kooperation mit Julia Schaake, M.Sc. aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Petra Dersch vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig.
C Ergebnisse
C.1 Etablierung eines Infektionsmodells für Yersinia enterocolitica im Minipig
Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica ) ist ein bedeutender Durchfallerreger beim Menschen. Schweine gelten als Reservoirwirt, da sie den Erreger mit einer hohen Prävalenz beherbergen, jedoch keine klinischen Symptome zeigen (Fukushima et al., 1983; Gürtler et al., 2005). In Europa ist Serotyp O:3 sowohl in humanen Patienten als auch in Mastschweinebeständen der häufigste Serotyp (Thibodeau et al., 1999;
Bottone, 1999; Rosner et al., 2010). Obwohl schon experimentelle Infektionen beim Schwein durchgeführt wurden (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985;
Schiemann, 1988; Thibodeau et al., 1999), sind die Mechanismen, die zu einer Kolonisierung des Schweins führen, noch weitgehend unbekannt.
Molekularbiologische Untersuchungen erfolgten in erster Linie mit Serotyp O:8 (YeO:8) und im gut standardisierten Mausmodell. Daher sollte in der vorliegenden Arbeit für weitergehende Untersuchungen zur Kolonisation bzw. Infektion von Y. enterocolitica im natürlichen Wirt, dem Schwein, zunächst ein Modell entwickelt werden, das möglichst nah an der natürlichen epidemiologischen Situation in Schweinemastbetrieben bleibt. Es wurde der orale Infektionsweg gewählt, da Y. enterocolitica häufig in Tonsillen von Schlachtschweinen nachgewiesen werden konnte (Fredriksson-Ahomaa et al., 2001a; Gürtler et al., 2005) und möglicherweise dort persistiert. Als Versuchstiere wurden aufgrund ihrer Vorteile in Bezug auf Unterbringung und Handhabung sowie ihrer zunehmenden Verwendung als Labortiere Minipigs eingesetzt. Für die Etablierung wurde der in Europa am häufigsten vorkommende Serotyp O:3 (YeO:3) eingesetzt.
C.1.1 Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3
In Anlehnung an bereits publizierte Daten wurden in drei Tiergruppen von jeweils vier Minipigs Infektionsdosen von 108, 109 und 1010 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Ferkel getestet [vgl. B.1.2]. In Publikationen zu oralen Infektionsversuchen im Schwein (Fukushima et al., 1984; Robins-Browne et al., 1985; Schiemann, 1988;
Thibodeau et al., 1999) führten diese Dosen zu einer subklinischen Infektion, die auch im Minipigmodell angestrebt wurde.
Die Tiere wurden sieben Tage nach Einstallung oral mit YeO:3 Stamm Y1 infiziert und danach zweimal täglich im Hinblick auf klinische Symptome untersucht. Zudem wurden einmal wöchentlich Blutproben hämatologisch [vgl. B.2.2 bis B.2.4] und zweimal wöchentlich Rektaltupfer bakteriologisch untersucht [vgl. B.1.4 und B.2.4].
Sieben Tage nach der Infektion wurden alle Tiere euthanasiert und nachfolgend seziert. Bei der Sektion wurde eine makroskopische Untersuchung des Tierkörpers und der Organe durchgeführt [vgl. B.2.5]. Für eine quantitative und qualitative bakteriologische Untersuchung auf Yersinien wurden Proben von folgenden Organen entnommen: Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum, mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales), Leber, Milz und Niere. Nur qualitativ mittels Kälteanreicherung untersucht wurden bei der Sektion direkt aus dem Enddarm entnommene Kotproben [vgl. B.2.4]. Die Daten von drei Tieren wurden von der Auswertung ausgeschlossen, daher beziehen sich alle folgenden Ergebnisse auf eine Gruppengröße von je drei Tieren. Die Gründe hierfür werden im folgenden Abschnitt näher erläutert.
C.1.1.1 Klinische und pathologisch-anatomische Beurteilung der Tiere
Nach der Einstallung mussten zwei Ferkel wegen akuten Kreislaufversagens mit Dexamethason behandelt werden, eines von ihnen verendete innerhalb von 24 Stunden. Diese Tiere und ein drittes, das vor der Infektion positiv auf Y. enterocolitica untersucht wurde, wurden von der Auswertung ausgeschlossen. Keines der Minipigs zeigte nach der Infektion klinische Symptome. Allerdings zeigten einige Ferkel im Blutbild eine Anämie, Lympho- oder Leukozytopenie und alle Ferkel eine Hämokonzentration, sowohl vor als auch nach der Infektion.
Pathologisch-anatomisch konnten nur unspezifische Befunde in überwiegend milder Ausprägung beobachtet werden. Detaillierte Beschreibungen zu klinischen und pathologisch-anatomischen Befunden befinden sich im Anhang [vgl. H.1 und 2].
C.1.1.2 Quantitative Organbelastung
Quantitativ konnte Y. enterocolitica in verschiedenen Organen mit bis zu 2,45x106 KBE/g Organ nachgewiesen werden. Besonders stark belastet waren Tonsillen, Caecum, Colon und z.T. auch Ileum. In Tonsillen, Ileum und Caecum konnten von allen neun infizierten Minipigs Yersinien quantitativ bestimmt werden. Aus Jejunum, Colon und Rectum konnten nur in Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier) nicht aus allen Proben Yersinien in der Direktkultur nachgewiesen werden. Bei Proben von Jejunum und Rectum blieben in dieser Gruppe zwei, vom Colon eine der drei Proben negativ. In den mesenterialen Lymphknoten, der Leber und Niere konnten die Bakterien nur bei einem Tier aus Gruppe C (Infektionsdosis: 1010 KBE/ Tier) quantitativ nachgewiesen werden (Abb. 2).
Abb. 2: Quantitative Organbelastung in den drei Dosisgruppen. Jeder Punkt repräsentiert den Logarithmus der KBE/g Organ eines Tieres. In jeder Dosisgruppe wurden drei Tiere oral infiziert und am siebten Tag p.i. seziert. Die Infektionsdosen betrugen 108 (Gruppe A), 109 (Gruppe B) bzw.
1010 (Gruppe C) KBE/Tier.
In den Tonsillen stieg die mittlere Organbelastung (Mittelwert der drei untersuchten Tiere je Gruppe) mit der Infektionsdosis an. Im Ileum, Caecum, Colon und Rectum war die mittlere Organbelastung in Gruppe A (Infektionsdosis: 108 KBE/ Tier) zwar geringer als in Gruppe C (Infektionsdosis: 1010 KBE/ Tier), jedoch war diese auch in Gruppe B (Infektionsdosis: 109 KBE/ Tier) geringer als in Gruppe A. Alle Zahlen sind im Anhang aufgelistet [vgl. H.4].
