Insgesamt wurden fünf Tierversuche mit 114 Minipigs durchgeführt. Die Ferkel waren zwischen fünf und sieben Wochen alt (durchschnittliches Alter: 44 Tage). Es wurden sowohl weibliche als auch kastrierte männliche Tiere für die Versuche eingesetzt (65 ♂, 49 ♀). Die Aufteilung in Gruppen erfolgte randomisiert nach Geschlecht und Alter.
Die Tierversuche erfolgten in Kooperation mit Frau Prof. Dr. Petra Dersch und Julia Schaake, M. Sc. aus der Abteilung Molekulare Infektionsbiologie des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig.
B.2.1 Herkunft, Unterbringung und Versorgung der Versuchstiere
Die Mini-Lewe-Ferkel stammten vom Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Absetzferkel und Sauen wurden vor dem ersten Tierversuch stichprobenartig auf das Vorhandensein von Yersinien untersucht, alle Stichproben waren in der bakteriologischen Untersuchung negativ.
Die Antikörpertiter der eingestallten Ferkel in der serologischen Untersuchung lagen unterhalb des „Cut-off“-Wertes und waren somit als negativ einzustufen.
Versuche, in denen ausschließlich Wildtypstämme untersucht wurden, fanden in den Stallungen des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt. Koinfektionsstudien mit gentechnisch veränderten Stämmen wurden in der Isolierstation des Instituts für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Minipigs wurden in Gruppen von mindestens drei bis maximal zwölf Ferkeln in Ställen von etwa 8 m2 (Institut für Mikrobiologie) bzw. 11 m2 (Isolierstation des Instituts für Virologie) eingestallt. In ersterem wurde ein Teil des Stalls mit Stroh eingestreut, in letzterem wurden im Liegebereich Gummimatten ausgelegt.
Rotlichtlampen ermöglichten es den Tieren, aktiv den für sie angenehmsten Temperaturbereich zum Ruhen aufzusuchen. Diese wurden entfernt, wenn die Ferkel nicht mehr darunter lagen. Die Tiere wurden innerhalb der ersten fünf Tage dreimal, an den folgenden Tagen zweimal täglich gefüttert, sie erhielten je nach Alter und Körpergewicht 200 bis 250 g/Tag eines kommerziellen Futters. Die Ration stellte sich
zu je 50 % aus Ferkelstartern (primo wean, deuka, Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG) und einem Spezialfutter für Minipigs (ssniff®MPigH, ssniff Spezialdiäten GmbH) zusammen. Zusätzlich wurden zur Beschäftigung Heucobs (pre alpin, Agrobs GmbH) und mit geringen Mengen pelletierten Futters gefüllte Spielbälle angeboten.
Zweimal täglich wurden die Stalltemperatur und Luftfeuchte sowie das Allgemeinbefinden der Tiere (Haltung, Verhalten, Futteraufnahme, Kotabsatz, Körpertemperatur) kontrolliert und dokumentiert.
Die Haltung, Unterbringung und jede Behandlung der Tiere erfolgte gemäß den Vorgaben des Tierschutzgesetzes (Genehmigung durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Aktenzeichen 33.12-42502-04-10/0173 und 33.9-42502-04-11/0462) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Europäischen Übereinkommens zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere und den Empfehlungen der GV-SOLAS.
B.2.2 Versuchsaufbau
Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Tonsillen- und Rektaltupferproben genommen, und die Tiere wurden in die zuvor festgelegten Gruppen unterteilt. Nach siebentägiger Eingewöhnungszeit erfolgte die orale Infektion der Minipigs mit 109 KBE Y. enterocolitica pro Schwein. Nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener Infektionsdosen (vgl. C.1.1) wurden Infektionsdosen von 108, 109 und 1010 KBE/Tier eingesetzt. Nach der oralen Infektion wurden Rektaltupfer zweimal wöchentlich bakteriologisch und Blutproben einmal wöchentlich hämatologisch und serologisch untersucht. Am siebten bzw. 21. Tag p.i. wurden die Schweine euthanasiert, seziert und sowohl Organ- als auch Kotproben für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Auch die pathologisch-anatomische Untersuchung und die Entnahme von Organproben für die histopathologische Beurteilung wurden während der Sektion durchgeführt. Die letzte Blutentnahme fand ebenfalls am Tag der Sektion der Tiere statt (Abb. 1).
Abb. 1: Zeitlicher Ablauf des Versuchs. (Angegeben in Tagen vor (-) und nach der Infektion)
B.2.3 Orale Infektion der Minipigs
Die Infektionsdosen [vgl. B.1.2] wurden in 1 ml sterilem PBS suspendiert und in Eppendorf-Reaktionsgefäßen auf Eis zu den Stallabteilen transportiert. Im Stallbereich wurde jede Dosis einzeln resuspendiert, mit einer sterilen 2 ml-Einmalspritze aufgezogen und den Tieren direkt in die Maulhöhle eingegeben. Eine Person fixierte dabei das Tier, eine weitere öffnete und fixierte das Maul und eine dritte Person applizierte die Bakteriensuspension, so dass die Infektion immer von drei Personen durchgeführt wurde. Die Infektionen erfolgten immer morgens unmittelbar vor der morgendlichen Fütterung. Die Kontrolltiere erhielten je 1 ml steriles PBS („Pseudoinfektion“), das ihnen auf die gleiche Art eingegeben wurde.
B.2.4 Probenentnahme
Am Tag der Einstallung wurden von allen Tieren Rektal- und Tonsillentupfer genommen. Hierzu wurden die Tiere fixiert. Für das Abtupfern der Tonsillen wurde das Maul mit einem arretierbaren Maulgatter geöffnet und mit einem sterilen Tupfer (UNI-TER AMIES CH, Meuss S.r.l.) fest über die Tonsillen gestrichen. Für Rektaltupfer wurde der sterile Tupfer vorsichtig in den Anus eingeführt. Die Tupfer wurden anschließend im mitgelieferten Amies-Medium mit Kohlezusatz ins Labor transportiert. Rektaltupfer wurden nach der Infektion zweimal wöchentlich genommen.
Für hämatologische und serologische Untersuchungen wurden den Minipigs einmal wöchentlich EDTA- und Serumproben (EDTA-, Serum-Monovetten®, Sarstedt AG &
Co.) unter Verwendung steriler Einmalkanülen (18G 11/2'') entnommen. Dieses
geschah durch Punktion der Vena cava cranialis, für die die Tiere in Rückenlage fixiert wurden. Es wurden maximal 5 ml Blut/kg Körpergewicht pro Woche entnommen (entsprechend den Vorgaben der Tierärztlichen Vereinigung für Tierschutz (TVT) e.V.). Die letzte Blutentnahme fand unmittelbar vor der Euthanasie und Sektion der Tiere statt. Um unnötigen Stress für die Tiere zu vermeiden, wurden sie bereits vor der Blutentnahme mit Ketamin (80 mg/kg KGW i.m.; Ursotamin®, Serum-Werke-Bernburg AG) und Azaperon (16 mg/kg KGW i.m.; Stresnil®, Janssen-Cilag GmbH) narkotisiert. Während des ersten Tierversuchs wurde initial eine Dosis von 3 mg/kg KGW Azaperon und 25 mg/kg KGW Ketamin verabreicht. Diese führte jedoch häufig nicht zu einer ausreichenden Narkosetiefe und zur Notwendigkeit von Nachdosierungen. Aus diesem Grund wurde ab dem zweiten Tierversuch bereits initial die oben erwähnte, hohe Dosierung mit sehr gutem Erfolg verwendet. Die Blutentnahme erfolgte unter der Narkose durch eine Herzpunktion mit direkt anschließender Euthanasie durch die intracardiale Applikation von Pentobarbital (120 mg/kg KGW, Release®, WDT eG).
Nach Eintritt des Todes wurden die Minipigs auf einen Sektionstisch verbracht und Brust und Bauchhöhle eröffnet. Während der Sektion wurden von jedem Tier mit sterilem Sektionsbesteck folgende Proben in eben dieser Reihenfolge entnommen:
Leber, Milz, Nieren, mesenteriale Lymphknoten (Lnn. jejunales), Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum (nur für den Vergleich verschiedener Infektionsdosen von Y. enterocolitica Serotyp O:3), Kot aus dem Rectum und Tonsillen. Alle Organe wurden während der Entnahme aus dem Tierkörper makroskopisch untersucht.
Durch die Reihenfolge der Probenentnahme von eher gering hin zu voraussichtlich stark kontaminierten Organen sollte das Risiko einer Kontamination bei der Entnahme minimiert werden. Die Proben wurden in fest verschlossenen, sauberen Plastikgefäßen direkt nach der Entnahme ins Labor transportiert.
B.2.5 Pathologisch-anatomische Untersuchung
Vor der Sektion wurden die Körperoberfläche und die Körperöffnungen begutachtet.
Nach der Eröffnung der Brust- und Bauchhöhle wurden die Pleura, Lungen und Herz untersucht. Dabei wurde auf Verklebungen insbesondere der Spitzenlappen geachtet und der Herzbeutel eröffnet. Danach wurden das Peritoneum, Leber, Milz und Nieren
Es wurde darauf geachtet, ob die Nierenkapsel leicht abziehbar war, um Hinweise auf entzündliche oder nekrotische Prozesse zu erhalten. Alle Organe wurden während der Untersuchung angeschnitten, um die Schnittfläche beurteilen zu können. Die mesenterialen Lymphknoten sowie die einzelnen Darmabschnitte wurden zur Begutachtung aus der Bauchhöhle heraus gelagert und palpiert, jedoch nicht zusätzlich zur Entnahme der nötigen Proben longitudinal eröffnet.
B.2.6 Histopathologische Untersuchung
Für die histologische Untersuchung wurden Organproben von Leber, Milz, Ileum und mesenterialen Lymphknoten sofort nach der Entnahme für mindestens 24 Std. in 10 %igem, nicht-gepuffertem Formalin fixiert und für die histopathologische Untersuchung in das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover verbracht. Dort fand die weitere Herstellung der histologischen Schnitte (Paraffineinbettung, Schnittherstellung mittels Mikrotom, HämatoxylinEosin (HE) -Färbung) und die Beurteilung dieser in Kooperation mit Dr. Frauke Seehusen statt.
B.2.7 Serologische Untersuchung
Die serologischen Untersuchungen wurden in Kooperation mit Dr. Alexandra von Altrock in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit einem ELISA-Testsystem (PIGTYPE® YOPSCREEN ELISA Testkit, Labor Diagnostik Leipzig GmbH/ Quiagen Leipzig GmbH) durchgeführt. Dieses basiert auf rekombinanten Yops (engl.: Yersinia outer proteins) und dient zum Nachweis von Antikörpern gegen pathogene Yersinien bei Schweinen. Der ELISA wurde entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt und ausgewertet.