Für die experimentellen Infektionen wurden zwei verschiedene Wildtypstämme von Yersinia (Y.) enterocolitica eingesetzt. Der Stamm Y1 gehört zum Bioserotyp 4/O:3 (YeO:3) und stammt von einem humanen Patienten. Stamm 8081v gehört zum Bioserotyp 1B/O:8 (YeO:8) und ist ebenfalls ein Patientenisolat aus der Humanmedizin. In den Koinfektionsversuchen [vgl. C.3.2] wurde zudem der Stamm YE13 eingesetzt. Dieser verhält sich wie Stamm Y1, besitzt aber eine Kanamycin-resistenzkassette, die es ermöglicht, ihn von der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 zu unterscheiden. Die drei in den Koinfektionsversuchen eingesetzten Mutanten stammen ebenfalls vom YeO:3 Stamm Y1. In der RovA-Stabilitätsmutante YE14 wird das bei 37°C weniger stabile RovA des YeO:8 exprimiert (RovAP98, RovAYeO:8); bei diesem ist die Aminosäure Serin des RovA-Proteins an der Position 98 durch Prolin ersetzt. Bei der PinvA∆IS1667-Mutante YE15 fehlt das Insertionselement im invA-Promotorbereich. Das IS1667 ist bei YeO:3 vorhanden und führt zu einer verstärkten invA-Expression, fehlt aber bei YeO:8. Der ∆invA-Mutante fehlt das invA-Gen, dadurch wird Invasin A nicht exprimiert. Die Stämme YE13, YE14 und YE21 sind kanamycinresistent (KnR) aufgrund einer chromosomal verankerten Kanamycin-resistenzkassette, während die Stämme 8081v, Y1 und YE15 kanamycinsensibel sind (Tab. 1). Die Stämme YE13, YE14, YE15 und YE21 wurden in der Arbeit von Frank Uliczka, Ph.D. konstruiert (Uliczka et al., 2011). Der Serotyp O:8 Stamm 8081v wurde von Pepe und Miller (1993) beschrieben. Alle eingesetzten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Yersinienstämme wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Petra Dersch (Arbeitsgruppe Molekulare Infektionsbiologie, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig) und Dr. Eckhard Strauch (Bundesinstitut für Risikobewertung) im Rahmen der Kooperation innerhalb des BMBF-Forschungsverbunds Foo-Borne Zoonotic Infections of Humans (FBI-Zoo) zur Verfügung gestellt.
Tab. 1: Verwendete Y. enterocolitica Stämme und deren Herkunft.
B.1.2 Herstellung der Bakteriensuspension für die orale Infektion
Die Yersinien wurden zunächst auf Blutagar mit 3 % Schafblut über Nacht angezüchtet. Dann wurde eine Einzelkolonie in 50 ml LB-Medium in einen 4er-Schikanekolben überimpft und über Nacht (für 13 bis 15 h) bei 25°C und 150 rpm in einem Inkubations-Schüttler (CERTOMAT® IS, Sartorius Stedim Biotech, Sartorius) inkubiert. Bei der Anzucht der Kanamycin-resistenten Stämme (YE13, YE14, YE21) wurden dem LB-Medium 25 µg Kanamycin pro ml zugesetzt. Von den Übernachtkulturen (ÜNK) wurden 30 ml Aliquots bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet in sterilem PBS aufgenommen. Der Waschschritt in PBS wurde dreifach durchgeführt. Anschließend wurde die Infektionssuspension mit sterilem PBS auf eine OD600 = 1,0 eingestellt (Eppendorf Bio Photometer, Eppendorf AG). Diese Trübung entspricht einer Konzentration von ca. 109 KBE/ml. Für die orale Infektion wurde die benötigte Menge pro Tier in 1 ml sterilem PBS aufgenommen und jede Infektionsdosis bis zur Verwendung in einem 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß auf Eis gelagert. Die Reinheit der ÜNK und der Verdünnung in PBS wurde mittels fraktionierten Ausstrichen auf Blut- und Gassneragar kontrolliert. Die exakte Infektionsdosis wurde durch Verdünnungsreihen der OD600 = 1,0 Lösung bestimmt. Hierzu wurden vier Verdünnungsstufen (10-4 bis 10-7) im Doppelansatz auf LB-Agar ausgestrichen (je 100µl), über Nacht bei 30°C inkubiert und die KBE/100 µl gezählt.
Die Zusammensetzung bzw. Herstellung aller Medien, Nährböden und Antibiotikazusätze ist im Anhang aufgeführt.
B.1.3 Quantitative Isolierung der Yersinien und Differenzierung durch Resistenzen
Die bei der Sektion entnommenen Organproben von Tonsillen, Jejunum, Ileum, Caecum, Colon, Rectum (nur im Tierversuch zum Vergleich verschiedener Infektionsdosen, vgl. C.1.1), mesenterialen Lymphknoten (Lnn. jejunales), Leber, Milz und Niere wurden quantitativ auf die Belastung mit Y. enterocolitica untersucht.
Tonsillen und Darmabschnitte wurden zuvor mit sterilem PBS gespült und für 30 Min.
in Gentamicinlösung (50 µg/ml in PBS) inkubiert, um Bakterien auf der (luminalen) Oberfläche abzutöten. Nach der Inkubation mit Gentamicin wurden die Tonsillen und Darmabschnitte dreimal mit sterilem PBS gewaschen. Die Organstücke wurden gewogen und ca. 1 g pro Organ wurde in 5 ml sterilem PBS homogenisiert (30000 rpm, 30 Sek., Polytron PT 2100 Homogenisator, Kinematica AG). Von vier Verdünnungsstufen (100, 10-1, 10-2, 10-3) dieses Homogenisats wurden je 50 µl im Doppelansatz auf CIN-Agar mit Carbenicillinzusatz (carb) ausplattiert, bei 30°C für bis zu 48 Std. inkubiert und die Kolonien ausgezählt. Im Rahmen der Koinfektionsversuche wurde je ein Doppelansatz jeder Verdünnungsstufe auf CIN-Agar mit (CIN +carb +Kn) und ohne zusätzlichen Kanamycinzusatz (CIN +carb) ausplattiert. In der statistischen Auswertung wurden nur Zählwerte ≥ 15 Kolonien pro Platte berücksichtigt. Von jeder Agarplatte wurde eine typische Kolonie subkultiviert, um den jeweiligen Y. enterocolitica -Stamm zu überprüfen [vgl. B.1.5].
B.1.4 Qualitative Isolierung der Yersinien mittels Kälteanreicherung
Rektal- und Tonsillentupfer, Kotproben und Organproben aus der Sektion wurden mittels Kälteanreicherung auf Y. enterocolitica untersucht. Im Fall der Organproben geschah dieses zusätzlich zur quantitativen Untersuchung, da die Kälteanreicherung zwar nur eine rein qualitative Aussage zulässt, aber sensitiver ist als die Direktkultur (Bisping W. und Amtsberg G., 1988). Tupfer, 1 g Kot bzw. 200 µl des Organ-Homogenisats [s. B.1.3] wurden zu 9 ml sterilem PBS in Reagenzgläser gegeben und für 21 Tage bei 4°C inkubiert. Jeweils nach sieben, vierzehn und einundzwanzig Tagen wurden fraktionierte Ausstriche auf CIN-Agar untersucht. In Koinfektionsversuchen wurden diese auf CIN-Agar mit und ohne Kanamycinzusatz ausgestrichen. Von typisch aussehenden Kolonien wurden Subkulturen biochemisch untersucht [s. B.1.5].
B.1.5 Biochemische Differenzierung der Isolate
Von den Kolonien, die auf CIN-Agar die für Y. enterocolitica charakteristische Morphologie zeigten (dunkelviolette, kleine Kolonien mit hellem Randsaum, Ø 1 mm, Nährboden um die Kolonien rosa verfärbt), wurden Subkulturen auf Blut- und Gassneragar angelegt. Wenn auch diese morphologisch Y. enterocolitica entsprachen (auf Blutagar feine, weißlich-undurchsichtige Kolonien, Ø 1 mm, laktosenegativ auf Gassneragar) und ein Oxidasetest (Bactident® Oxidase, Merck KGaA) negativ ausfiel, wurde eine weitere biochemische Differenzierung durchgeführt. Folgende Reaktionen wurden hierbei überprüft: H2S-Bildung (Kligler-Agar), Harnstoffabbau (Urease), Citratverwertung, Mannitspaltung, Ornithin-decarboxylase (ODC), oxidativer und fermentativer Kohlenhydratabbau (O/F-Test) und Indolbildung. Weitere biochemische Reaktionen wurden nach Bedarf durchgeführt, um die Infektionsstämme von vor der Infektion von den Minipigs isolierten Stämmen (Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. enterocolitica) zu unterscheiden. Die ggf. zusätzlich getesteten Reaktionen waren Inositspaltung (Säurebildung aus Myo-Inosit), Rhamnoseabbau und Äskulinspaltung. Die biochemischen Reaktionen der eingesetzten Yersinienstämme sind in Tabelle 2 dargestellt. In den wenigen Fällen, in denen Yersinien bei der Einstallung aus Kottupfern isoliert wurden, war es nie möglich, diese im weiteren Versuchsverlauf erneut aus Proben der Tiere zu isolieren.
Tab. 2: Biochemische Reaktionen der eingesetzten Y. enterocolitica Stämme.
Von den aus Organproben gewonnenen Isolaten wurde zusätzlich pro Tier ein Isolat mit dem API 20E®-Testsystem (bioMérieux Deutschland GmbH) untersucht.