Zusammensetzung der Schlafgruppen

Während der viermal wöchentlich stattfindenden Schlafplatzkontrollen wurde versucht, mit Hilfe des Transponder-Lesegerätes oder des Empfangsgerätes weitere Schlafgruppenmitglieder zu identifizieren. Bei Schlafplätzen in offener Vegetation war teilweise auch eine optische Identifizierung aufgrund farbiger Halsbänder oder des Erkennens von Ohrschnitten oder Schwanzmarkierungen möglich. Außerdem wurden die Tiere während der Fokusbeobachtungen beim Verlassen der Schlafplätze beobachtet. Hierbei spielte vor allem die optische Erkennung der Tiere aufgrund äußerer Kennzeichen eine wichtige Rolle.

2.3. Datenanalyse 2.3.1. Populationsökologische Methoden 2.3.1.1. Nutzung von Fallen und Fangbarkeit

Fangergebnisse können durch die Anzahl und Verteilung aufgestellter Fallen beeinflusst werden. Für jede Fangaktion wurde daher der Anteil belegter Fallen errechnet, um zu überprüfen, ob die Anzahl gefangener Tiere nicht durch eine zu geringe Fallenanzahl limitiert war.

Für den gesamten Untersuchungszeitraum wurde außerdem die Fanghäufigkeit jedes einzelnen Tieres ermittelt und die Verteilung der individuellen Fanghäufigkeiten in beiden Untersuchungsgebieten mittels des Chi-Quadrat-Tests verglichen.

2.3.1.2. Bestimmung der Populationsgröße MNA-Methode

Zur Abschätzung der Populationsgröße wurde die „Minimum Number of Animals known alive“ für jeden Monat von August 2007 – Oktober 2007 berechnet (MNA-Methode: Petrusewicz & Andrezejewski 1962). Sie setzt sich aus der Summe der zu einem bestimmten Zeitpunkt t gefangenen Individuen und den Tieren, die sowohl in

einer der Fangaktionen davor, als auch in einer der Fangaktionen danach, jedoch nicht in der Fangaktion t selbst gefangen wurden, zusammen.

Jolly-Seber-Methode

Natürliche Populationen unterliegen Schwankungen in der Anzahl zugehöriger Individuen durch Geburten, Todesfälle und Migration. Es handelt sich daher um sogenannte offene Populationen (Krebs 1989). Zur Abschätzung der Populationsgröße solcher offener Populationen, also auch der beiden Populationen von M. ravelobensis in JBA und JBB, ist die Jolly-Seber-Methode geeignet (Krebs 1989, Sutherland 1996).

Es ist dabei zu berücksichtigen, dass die Größe für die erste und letzte durchgeführte Fangaktion nicht berechnet werden kann. Desweiteren müssen mindestens drei aufeinanderfolgende Fangaktionen durchgeführt werden, um diese Methode anwenden zu können. Mit Hilfe der folgenden Formeln wurde die Populationsgröße für die Monate August, September und Oktober 2007 im JBA und JBB berechnet.

Nt = Mt / αt

Mt = [((st + 1) Zt) / (Rt + 1)] + mt

αt = (mt + 1) / (nt + 1)

Nt = geschätzte Populationsgröße zum Zeitpunkt t

Mt = Größe der Population der Wiederfänge zum Zeitpunkt t αt = Anteil der Wiederfänge zum Zeitpunkt t

mt = Anzahl der wiedergefangenen, bereits markierten Tiere in der Fangaktion t

st = Gesamtzahl der freigelassenen Individuen nach der Fangaktion t nt = Gesamtzahl der gefangenen Individuen in der Fangaktion t

Rt = Anzahl der st-Individuen, die in der Fangaktion t freigesetzt und in einer späteren Fangaktion wiedergefangen wurden

Zt = Anzahl der Tiere, die vor der Fangaktion t gefangen wurden, nicht in der Fangaktion t, aber in einer späteren

Fangaktion wieder gefangen wurden

Zur Schätzung der Konfidenzintervalle wurde die Formel nach Krebs (1989) angewandt.

Um die Jolly-Seber-Methode sinnvoll anwenden zu können, müssen folgende Bedingungen erfüllt sein:

1. Jedes Individuum hat die gleiche Wahrscheinlichkeit gefangen zu werden –

unabhängig davon, ob es sich um einen bereits markierten Wiederfang oder einen neu zu registrierenden Neufang handelt.

2. Jedes Individuum hat die gleiche Überlebenswahrscheinlichkeit von einer Fangaktion bis zur nächsten.

3. Die Individuen verlieren ihre Markierungen nicht und Markierungen werden nicht übersehen.

4. Die Dauer der Fangphasen ist vernachlässigbar in Relation zu den Intervallen zwischen den Phasen.

Das Kriterium 2 kann für diese Studie als gegeben betrachtet werden. Es lagen keine Hinweise auf eine veränderte Mortalität der Tiere vor, die in den Fallen gefangen wurden.

Das Kriterium 3 ist erfüllt, da die gefangenen Individuen mit einem subkutan injizierten Mikrochip gekennzeichnet wurden, der eine lebenslange Wiedererkennung der Tiere ermöglicht. Desweiteren erhielt jedes Tier eine individuelle Ohrmarkierung, die eine zusätzliche Absicherung darstellte.

Auch das Kriterium 4 kann bestätigt werden, da während der Studie von August bis November einmal wöchentlich eine Fangnacht pro Untersuchungsgebiet durchgeführt wurde.

Das Kriterium 1 muss für diese Studie gesondert überprüft werden, da nicht per se ausgeschlossen werden kann, dass die Verteilung der Fallen oder das Fangerlebnis einen Einfluss auf die Wiederfangwahrscheinlichkeit hatte. Hierzu wurde der Goodness-of-fit-Test nach Krebs (1989) verwendet.

Goodness-of-fit-Test

Mit Hilfe des Goodness-of-fit-Tests kann die Diskrepanz zwischen der beobachteten Fangbarkeit und einer erwarteten Fangbarkeit unter gleichmäßiger Fallennutzung festgestellt werden.

Der Goodness-of-fit-Test (Krebs 1989) berechnet sich mit folgenden Formeln:

a1 = f1 + f2 a2 = f3 + f4 a3 = f1 + f3 a4 = f2 + f4

n = f1 + f2 + f3 + f4

g1 = ∑ f * loge f g2 = ∑ a * loge a G = 2* (g1 - g2 + n * loge n)

f1 = Anzahl der Tiere, die vor der Fangaktion t gefangen wurden und in einer späteren Fangaktion wieder gefangen wurden

f2= Anzahl der Tiere, die vor der Fangaktion t gefangen wurden, in späteren Fangaktionen jedoch nicht wieder gefangen wurden

f3= Tiere, die erstmals in der Fangaktion t gefangen wurden und in späteren Fangaktionen wieder gefangen wurden

f4= Tiere, die erstmals in der Fangaktion t gefangen wurden, in späteren Fangaktionen jedoch nicht wieder gefangen wurden

2.3.1.3. Berechnung der Populationsdichte

Die Populationsdichte errechnet sich durch folgende Formel:

D =

In Anlehnung an eine bereits durchgeführte Studie (Mester 2006) wurde als Fläche N nicht die Grundfläche der beiden Untersuchungsgebiete JBA und JBB benutzt, da sowohl von einer ungleichmäßigen Nutzung der Gesamtfläche als auch von einer über die äußeren Fangreihen hinausgehende Nutzung durch die Populationen von M. ravelobensis in JBA und JBB ausgegangen werden muss (Mester 2006).

Mit Hilfe des Programmes DENSITY 2_1 (Efford 2004, http://www.landcareresearch.co.nz/services/software/density/) wurde auf der Basis aller Fangergebnisse ein mittlerer Aktionsradius Ŵ der Tiere berechnet. Mit dem Programm Arc View GIS 3.3. (http://www.esri.com/software/arcview/) wurde dieser Radius schließlich um alle genutzten Fallen gelegt und die Größe der so entstandenen Fläche, der effektiven Fangfläche A, berechnet. Diese Fangfläche wurde anhand der Fangdaten von August 2007 bis Januar 2008 einmal für JBA und einmal für JBB errechnet und dann in die oben genannte Formel eingesetzt. Zur Berechnung der Populationsdichte dividiert man schließlich die durch die Jolly-Seber-Methode berechnete Populationsgröße N durch die effektive Fangfläche A.

2.3.2. Reproduktionsbiologie der Weibchen

Anhand der erhobenen Daten wurden Zyklusübersichten erstellt, die dazu dienen, einen Überblick über die Synchronität der Östren, über die Interöstrusdauer sowie Konzeptionswahrscheinlichkeiten und Dauer von Trächtigkeiten zu erhalten.

Als im Östrus befindlich wurden die Weibchen bezeichnet, die während der Fangaktion eine Vagina mit geöffneter Perigenitalmembran aufwiesen. Falls ein Weibchen mit geschwollener Vulva gefangen wurde, während der nächsten Woche

Populationsgröße N Fläche A

jedoch gar nicht in die Falle ging oder mit einer gerade wieder verschlossenen Perigenitalmembran gefangen wurde, wurde ein Östrus für die jeweils nachfolgende bzw. dazwischen liegende Kalenderwoche angenommen. Bei einer gerade wieder verschlossenen Vagina ist immer noch eine Schwellung der Vulva zu erkennen und nur eine dünne Membran verschließt die Vagina. Bei einer geschlossenen Vagina liegt keine mehr Schwellung vor.

In Anlehnung an die Arbeit von Radespiel und Zimmermann (2001) über die Östrussynchronität Grauer Mausmakis wurden Östren zweier Weibchen als synchron bezeichnet, wenn diese weniger als drei Wochen voneinander entfernt lagen. Als asynchrone Östren wurden dementsprechend die Östren zweier Weibchen definiert, die mehr als drei Wochen Abstand zueinander hatten.

Es liegen jedoch nicht von allen Weibchen, die gefangen wurden, durchgehende Informationen über den Zyklusverlauf vor, da die meisten Weibchen nicht in jeder Fangaktion gefangen werden konnten.

2.3.3. Analyse der weiblichen Reproduktionsstrategien 2.3.3.1. Einteilung der reproduktiven Phasen

Anhand der Informationen aus Fangaktionen und Fokusbeobachtungen wurde jedes Senderweibchen, soweit möglich, zeitlich in die Phasen Vorpaarungszeit, Paarungszeit, Tragzeit und Aufzuchtzeit eingeordnet.

Die Vorpaarungszeit ist als der Zeitraum definiert, der vor dem Eintreten des ersten Östrus in der Saison liegt. Als Paarungszeit wurde die Phase bezeichnet, in der die Weibchen mit geschwollener oder offener Vulva gefangen wurden oder diese eine deutlich erhöhte Rate an sozialen Kontakten vor allem mit Männchen in einer Fokusnacht aufwiesen. Als Tragzeit wurde der Abschnitt bezeichnet, ab dem die Weibchen eine deutliche Gewichtszunahme zeigten oder sogar ein Fötus palpiert werden konnte. Als Aufzuchtzeit wurde letztlich die Phase eingegrenzt, in der die Weibchen während der Fokusbeobachtungen mit Nachwuchs gesichtet worden waren.

2.3.3.2. Aktivitätsbudgets

Es wurde für jedes Weibchen ein Aktivitätsbudget pro Phase erstellt, dass sechs Verhaltenskategorien beinhaltete: Lokomotion, Ruhe, Futterkontext, „Autogrooming“, Aufenthalt im Nest und Sozialverhalten. Die Verhaltenskategorie Ruhe wurde immer dann gewählt, wenn ein Senderweibchen bewegungslos an einer Stelle verharrte.

Dabei konnte es sowohl auf einem Ast oder einer Liane sitzen, als auch an einem Baumstamm hängen.

Verhaltensweisen, die zum Zeitpunkt der 5-minütigen Momentaufnahmen auftraten wurden in Relation zur Gesamtanzahl der Momentaufnahmen (%) der jeweiligen Phase 1) Vorpaarungszeit, 2) Paarungszeit, 3) Tragzeit oder 4) Aufzuchtzeit gesetzt, in der sich die Weibchen gerade befanden. Dies geschah für beide Untersuchungsgebiete separat (Tab. 6).

Tab. 6 Einteilung des Datenbestandes in die vier reproduktiven Phasen

Phase Gebiet Beobachtete

Fokustiere

Fokusnächte Kontaktzeit in h

Vorpaarungszeit JBA 2 Weibchen 5 Nächte 08:23:36

JBB 4 Weibchen 13 Nächte 26:23:53

Paarungszeit JBA 6 Weibchen 23 Nächte 28:57:45

JBB 5 Weibchen 13 Nächte 22:28:02

Tragzeit JBB 2 Weibchen 5 Nächte 07:44:30

Aufzuchtzeit JBB 3 Weibchen 18 Nächte 16:54:31

Es wurden die Aktivitäten der verschiedenen Weibchen summiert und zwischen den Phasen bzw. zwischen beiden Gebieten statistisch mittels des Chi-Quadrat-Tests miteinander verglichen. Die Daten wurden nicht auf individueller Ebene statistisch analysiert, da die Stichproben hierfür zu klein waren und es sich zudem um gemischte (abhängige/unabhängige Daten) Stichproben handelte. Die individuellen Aktivitätsbudgets werden jedoch zu Vergleichszwecken im Anhang dargestellt.

2.3.3.3. Nächtliche Aktionsräume und Wanderstrecken

Zur Bestimmung der nächtlichen Aktionsräume sowie der Wanderstrecken eines Senderweibchens wurden mit Hilfe eines GPS-Gerätes immer dann die Koordinaten des Tieres zu erfasst, wenn es sich mehr als 10 m von seinem vorhergehenden Standpunkt entfernt hatte. Die Datenverarbeitung fand anschließend mittels des Programmes Arc View GIS 3.3. statt, in dem nach Eingabe aller GPS-Koordinaten einer Fokusnacht ein 100 % Minimum-Konvex-Polygon (Mohr 1947) erstellt wurde.

Auch die nächtlichen Wanderstrecken wurden mit dem Programm ARC VIEW GIS 3.3. als Summe aller Teilstrecken zwischen den sukzessiven Positionen der Tiere berechnet. Anschließend wurde das Durchwanderungspotential für jeden nächtlichen Aktionsraum berechnet. Dafür wurde die nächtliche Wanderstrecke durch den aus der nächtlichen Aktionsraumgröße mit der Kreisformel (A=π*r²) berechneten Aktionsraumdurchmesser geteilt. Diese Analyse erlaubt einen Einblick in die Raumnutzungsmuster der Weibchen im JBA und JBB. Zur Auswertung der Daten wurden alle Fokusnächte genutzt, in denen die Tiere mindestens vier Stunden beobachtet worden waren (Tab.7). Somit entfielen vor allem Nächte während der Regenzeit, da die Beobachtungen oft aufgrund starken Regens abgebrochen werden mussten.

Tab. 7 Datengrundlage zur Auswertung der Raumnutzung

Es wurde für jedes Individuum ein Mittelwert pro Phase für den Aktionsraum, die Wanderstecke und das Durchwanderungspotential errechnet. Anhand des

Mann-Phase Gebiet Beobachtete

Whitney-U-Tests wurden sowohl die Gebiete pro Phase als auch die Phasen untereinander verglichen. Schließlich wurde die kumulative Aktionsraumgröße der Weibchen berechnet, die sich durch das Übereinanderlegen der Aktionsräume mehrerer Nächte ergibt. In die Berechnung gingen mindestens drei und maximal sechs Nächte pro Weibchen ein. Die Gesamtaktionsraumgrößen wurden dann mit einem Mann-Whitney-U-Test auf Gebietsunterschiede verglichen.

2.3.3.4. Östrussynchronität

Durch die optische Kontrolle der Vulva-Morphologie aller gefangenen Weibchen konnte ermittelt werden, zu welchem Zeitpunkt diese östrisch waren. So wurde es möglich, einen zeitlichen Abstand zwischen den Östren der einzelnen Weibchen zu erfassen und somit Einblicke in die Synchronität der Östren zu erhalten.

Für jedes Weibchen wurde anhand der Fangdaten ein mittlerer Fangort errechnet.

Somit konnten individuelle Distanzen zwischen den einzelnen Weibchen in beiden Gebieten kalkuliert werden. Es wurde schließlich ein Mantel-Test durchgeführt, der einen möglichen Zusammenhang zwischen räumlichem Abstand der Weibchen zueinander und zeitlichem Eintritt in den Östrus untersuchen sollte.

2.3.3.5. Sozialverhalten

Jede soziale Interaktion wurde entweder als Nähe eines Tieres (Proximity), als positive oder als agonistische Interaktion bewertet (siehe Tab.4). Dabei konnten während eines Kontaktes zwischen zwei Tieren auch verschiedene Interaktionen auftreten, die sowohl als positiv, als auch als agonistisch kategorisiert werden konnten. Es fand ein statistischer Vergleich mittels des Chi-Quadrat-Tests zwischen den einzelnen Qualitäten von Sozialkontakten und den vier Phasen statt. Im Vordergrund stand hierbei der Vergleich zwischen Sozialkontakten innerhalb und außerhalb der Paarungszeit.

Es wurde außerdem die soziale Begegnungsrate pro Phase und Gebiet berechnet.

Hierfür wurden die Kontakte zu Interaktionspartnern pro Stunde gezählt. Es wurde,

wann immer möglich, zwischen Kontakten zu Männchen, zu Weibchen und zu männlichen und weiblichen Schlafgruppenmitgliedern unterschieden.

Neben der Qualität der Interaktionen wurde ebenfalls die Gesamtdauer sowie die durchschnittliche Dauer der Kontakte zu männlichen und weiblichen Partnern sowie zu männlichen und weiblichen Schlafgruppenmitgliedern erfasst.

2.3.3.6. Zusammensetzung der Schlafgruppen

Die Daten zur Zusammensetzung der Schlafgruppen wurden im Hinblick auf eine eventuelle Veränderung der Schlafgruppenzusammensetzung zwischen Paarungszeit und Aufzuchtzeit untersucht.

2.3.4. Analyse der Kondition und Verfügbarkeit potentieller männlicher Partner 2.3.4.1. Saisonale Änderung des Hodenvolumens

Das Hodenvolumen der Männchen wurde aus den Längen- und Breitenmaßen des rechten und linken Hodens unter Verwendung der Formel von Bercovitch (1989) bestimmt.

Hodenvolumen =

Aus den gewonnenen Daten sollten Rückschlüsse auf eine saisonale Dynamik und eventuelle Unterschiede zwischen den beiden Untersuchungsgebieten gezogen werden.

Es wurde eine Two-way-ANOVA durchgeführt, um auf Unterschiede zwischen den Monaten und zwischen den beiden Untersuchungsgebieten zu testen. Ausserdem wurden mittels des Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests monatsweise Vergleiche durchgeführt.

2.3.4.2. Saisonale Änderung des Körpergewichts

Mittels einer Two-way-ANOVA wurde das Körpergewicht der Männchen auf monatliche Unterschiede sowie auf Gebietsunterschiede getestet. Jeweils zwei

3,14*Gesamtbreite Hoden *(mittlere Länge Hoden)²

6

aufeinanderfolgende Monate wurden mit dem Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test verglichen.

2.3.4.3. Anzahl männlicher Individuen in der Nähe der Weibchen

Für jedes gefangene Tier wurde der jeweilige mittlere Fangort berechnet. Ausgehend von den Weibchen wurden dann die Anzahl der Männchen errechnet, die sich in einem Umkreis von 100 m, zwischen 100 und 150 m und über 150 m befanden. Auf diese Weise wurde die Verfügbarkeit an möglichen Paarungspartnern getestet. Es wurden hierbei nur Tiere berücksichtigt, die im Jahr 2007 mindestens bis zum Monat September gefangen wurden. Somit sollten Tiere ausgeschlossen werden, die eventuell während der Paarungszeit nicht mehr in der Population lebten.

Mit einer One-way-ANOVA wurde auf Unterschiede in der Verfügbarkeit von Paarungspartnern in den zwei Gebieten getestet.

2.3.5. Analyse des Aufzuchtverhaltens

2.3.5.1. Entwicklung der Mutter-Kind-Kontakte und ontogenetische Betrachtungen

Aus den Fokusbeobachtungen ließen sich die Dauern der Kontakte zwischen Müttern und Jungtieren ermitteln, die in Relation zur Gesamtbeobachtungszeit der jeweiligen Nächte gesetzt wurde. Somit konnte ein Einblick in die Entwicklung der Mutter-Jungtier-Kontakte basierend auf gemeinsam verbrachter Zeit gewonnen werden.

Es wurden sowohl bei den Müttern als auch bei den Jungtieren während der Fokusbeobachtungen gewisse Verhaltensweisen aufgenommen (z.Bsp.: oraler Transport von Jungtieren durch die Mutter, Spielen der Jungtiere). Diese wurden aufgrund der Kenntnis des Geburtszeitpunktes einem bestimmten Alter der Jungtiere zugeordnet. So konnte eine Entwicklungsübersicht über das Jungtierverhalten erstellt werden. Diese erlaubte schließlich auch Rückschlüsse auf das Alter von Jungtieren, deren Geburtstermin nicht bekannt war. Dies war der Fall, wenn ein Weibchen weder östrisch noch nachweisbar trächtig gefangen worden war, jedoch schließlich mit Nachwuchs gesichtet werden konnte.

2.3.5.2. Schlafplatzwahl in und außerhalb der Aufzuchtzeit

Die Nutzung der drei verschiedenen Schlafplatztypen (Blätternest, Höhle, offene Vegetation) wurde zwischen den vier reproduktiven Phasen der Senderweibchen verglichen. Es wurden jeweils die absoluten Häufigkeiten für jeden Schlafplatztyp pro Phase ermittelt, um diese untereinander mit dem Chi-Quadrat-Test zu vergleichen.

Im Zeitraum Dezember 2007 bis Januar 2008 wurde außerdem die Schlafplatzwahl von Weibchen mit und ohne Nachwuchs miteinander verglichen.

Weiterhin wurde die mittlere Nutzungsdauer jedes Schlafplatztyps für jede der vier Phasen ermittelt und verglichen. Auch hier wurden im Zeitfenster Dezember 2007 bis Januar 2008 Weibchen mit und ohne Nachwuchs untereinander verglichen.

Außerdem wurde analysiert, wie viele Tage insgesamt zwischen der ersten und der letzten Nutzung eines Schlafplatzes lagen, um mögliche Unterschiede zwischen den Schlafplatztypen zu finden.

Des Weiteren wurde auch die Rückkehrrate zum Schlafplatz des Vortages für jede Phase bestimmt. Die Rückkehrrate ergab sich aus der Anzahl der tatsächlichen Rückkehrtage in Relation zur Anzahl der potentiell möglichen Rückkehrtage zu einem Schlafplatz. Dies konnte natürlich nur durchgeführt werden, wenn der Schlafplatz des Vortages bekannt war. Zur Auswertung der Rückkehrrate mussten mindestens zwei aufeinanderfolgende Tage vorliegen.

Mittels eines Mann-Whitney-U-Tests wurde auch hier auf Unterschiede zwischen Weibchen mit und ohne Nachwuchs getestet.

2.3.6. Genetische Analysen 2.3.6.1. DNA Extraktion Phenol-Chloroform-Extraktion

Zur Isolierung der Nukleinsäuren aus der Gewebeprobe wurde eine

Phenol-Chloroform-Extraktion nach dem Standardprotokoll von Maniatis et al. (1982) durchgeführt.

Extraktion von DNA aus Haaren

Zur DNA-Extraktion aus Haaren wurde das Extraktionskit Nucleo Spin Tissue (Macherey-Nagel, Düren) verwendet und die Angaben des Herstellers befolgt.

2.3.6.2. Erstellung der Multilokus-Genotypen

Nukleäre Mikrosatelliten eignen sich aufgrund ihrer hohen Variabilität hervorragend zur Bestimmung der genetischen Verwandtschaft oder Elternschaft. In der vorliegenden Arbeit wurden sechs polymorphe Mikrosatelliten verwendet (Tab. 8).

Tab. 8 Eigenschaften der in dieser Arbeit verwendeten Mikrosatelliten

Lokus n Tiere

Mittelwert Minimum Maximum Allele Hobs Hexp Marker Referenz

M43B 11 155 153 161 4 0,86 0,75 HEX Hapke et Reagenziengemisch versetzt. In dem Reagenziengemisch befanden sich abhängig vom Lokus 1-1,5 mM MgCl2, 225 µM dNTPs (jeder Base), 1 x PCR-Puffer (Endkonzentration: 20 mM Tris-HCL, pH 8.4, 50 mM KCL) oder 1 x PARR-Puffer (Cambio, UK - Cambridge), 0,1-0,3 µM des jeweiligen Primers und 0,25 U der Taq-DNA Polymerase.

Für die Durchführung der PCR standen die Thermocycler Gene Amp PCR

System 9700 (PE Applied Bio-Systems, USA - Foster City) und Peltier Thermal Cycler PTC - 200 (MJ Research DNA Engine, USA - Waltham) zur Verfügung. Dabei wurden abhängig vom Lokus unterschiedliche Zyklen benutzt (Abb.12-15).

Abb.12 Zyklusverlauf für den Lokus M3

36x

94°C 94°C 72°C 72°C

4min 30sec 55°C 30sec 7min 4°C

20sec ∞

Abb.13 Zyklusverlauf für den Lokus M8

35x

92°C 92°C 72°C 72°C

2min 40sec 58°C 1min 5min 4°C

1min ∞

Abb.14 Zyklusverlauf für die Loki M30/M40/M43B

94°C 94°C 72°C 72°C

4min 30sec 50°C 30sec 7min 4°C

20sec ∞

Abb.15 Zyklusverlauf für den Lokus M9N

6x 6x 25x

94°C 94°C 94°C 94°C

4min 30sec 72°C 30sec 72°C 30sec 72°C 72°C

55°C 30sec 53°C 30sec 50°C 30sec 7min 4°C

20sec 20sec 20sec ∞

Des Weiteren wurde bei der PCR eine Negativkontrolle (deionisiertes H2O) als Indikator für Verunreinigungen, sowie eine leicht zu amplifizierende Positivkontrolle (hoch konzentrierte DNA aus der Muskulatur eines M. murinus) verwendet.

Der Erfolg der Amplifikation wurde gelelektrophoretisch auf einem 1,5%igen Agarosegel überprüft, in dem Ethidiumbromid in einer Konzentration von 1,3 x 10^-4 mg/ml enthalten war. Die Fragmentgröße der Produkte konnte mit Hilfe eines Längenstandards (Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas, St. Leon Rot) grob geschätzt werden.

Die genaue Bestimmung der Allelgröße erfolgte mittels des Kapillarsequenzers MegaBACE 1000 (Amersham Pharmacia, Wien). Jede homozygote Probe wurde mindestens zweimal amplifiziert, um Fehler bei der Typisierung zu vermeiden.

Mit Hilfe des Programmes MegaBACE Genetic Profiler 2.2. (Amersham Biosciences 2003) wurden die Peaks ausgewertet und mit Hilfe eines intern mitlaufenden Größenstandards (ET400) die Allellänge bestimmt (Abb.16).

Abb. 16 Darstellung der Peaks im Programm MegaBACE Genetic Profiler 2.2.

2.3.6.3. Sequenzierung der mitochondrialen d-loop

Zunächst wurde eine PCR der mitochondrialen d-loop durchgeführt.

Das Gesamtvolumen einer Probe enthielt dabei 25 μl, wobei 5 μl DNA und 20 μl des Reagenziengemisches verwendet wurden. Das Reagenziengemisch bestand aus 1 µM für jeden Primer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP (je Base), 1 x PCR-Puffer und

0,02 U Taq-DNA-Polymerase. Des Weiteren wurde auch bei dieser PCR eine Negativkontrolle (deionisiertes H2O) als Indikator für Verunreinigungen, sowie eine leicht amplifizierende Positivkontrolle verwendet.

Für die Durchführung der PCR standen die Thermocycler Gene Amp PCR System 9700 (PE Applied Bio-Systems) und Peltier Thermal Cycler PTC - 200 (MJ Research DNA Engine) zur Verfügung. Dabei wurde folgender Zyklus durchgeführt (Abb.17):

35x

94°C 94°C 72°C 72°C

3min 1min 50°C 1min 5min 4°C

1min ∞

Abb. 17 Zyklusverlauf für die D-LOOP Amplifikation

Der Erfolg der Amplifikation wurde gelelektrophoretisch auf einem 1,5%igen Agarosegel überprüft, in dem Ethidiumbromid in einer Konzentration von 1,3 x 10-4 mg/ml enthalten war, überprüft. Die Fragmentgröße der Produkte konnte mit Hilfe eines Längenstandards (Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas) grob geschätzt werden.

Im Anschluss daran wurden die PCR-Produkte aufgereinigt, was der Entfernung überschüssiger Substanzen aus dem Reaktionsansatz dient. Die DNA wird dabei unter anderem von Salzen, Oligonukleotiden, Primern und überschüssigen dNTP´s befreit, da diese einen störenden Einfluss auf Sequenzierungsreaktionen haben

Im Anschluss daran wurden die PCR-Produkte aufgereinigt, was der Entfernung überschüssiger Substanzen aus dem Reaktionsansatz dient. Die DNA wird dabei unter anderem von Salzen, Oligonukleotiden, Primern und überschüssigen dNTP´s befreit, da diese einen störenden Einfluss auf Sequenzierungsreaktionen haben

Im Dokument Zum Reproduktions- und Aufzuchtverhalten des Goldbraunen Mausmakis (Microcebus ravelobensis, Zimmermann et al. 1998) (Seite 53-0)