Auch wenn die Scherflussexperimente zun¨achst nicht zur Kl¨arung der Unterschiede der Mechanotransduktion beitragen, so konnte doch der Einfluss von lokalen Stimulationen, Scherkr¨aften und Dehnungsreizen auf die Adh¨asionseite gezeigt werden (siehe Kapitel 6.6).
Die m¨ogliche Rolle der Adh¨asionspunkte in der Mechanotransduktion wurde in Kapitel 2.3.6 eingehend beschrieben, weshalb der Umbauprozess der Adh¨asionsstellen unter lokalen Stimulationen mit der Transfektionstechnik (siehe Kapitel 3.4) in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde. Die Ergebnisse werden im folgenden Kapitel beschrieben.
6.8 Vertikale Stimulation und Vinculin-Konzentration
mit der verwendeten Kamera aufgel¨ost werden konnte. Die geringe Lichtempfindlichkeit des eingebauten CCD-Chips erforderte Integrationszeiten von mehr als zwanzig Sekun-den. Da sich jedoch auf dieser Zeitskala die Morphologie der einzelnen Adh¨asionspunkte wesentlich ¨anderte, ist die erhaltene Adh¨asions-Gr¨oße nur ein Mittelwert der tats¨ achli-chen Ausdehnung zu den verschiedenen Zeitpunkten. Um bessere Aufnahmen erhalten zu k¨onnen, ist eine Reduktion der Belichtungszeit von N¨oten. Hierf¨ur w¨are die Verwendung eines neueren EMCCD-Chips, dessen Licht-Sensitivit¨at deutlich besser ist, denkbar (siehe Kapitel 3.5). Eine solche Kamera stand im Rahmen dieser Arbeit nicht zur Verf¨ugung, so dass die oben genannten Experimente wiederholt werden m¨ussen.
10 mm
Abbildung 62: Die Abbildung zeigt die Verteilung des Vinculins in der Zelle. Die dunklen Bereiche entsprechen einer hohen Konzentration an Vinculin und charakterisieren damit die Adh¨asionspunkte der Zelle zum Substrat.
Die fokalen Adh¨asionen waren vor allem in den peripheren Bereichen der Zelle loka-lisiert (siehe Abbildung 62). Dabei war die gr¨oßte Dichte an den die L¨angsachse be-grenzenden Zellr¨andern zu finden. Diese Beobachtung stimmt mit den Ergebnissen der zellul¨aren Zugkraftmessungen ¨uberein. Sie zeigten, dass die Zugkr¨afte im Wesentlichen parallel zur Hauptachse der Zelle auftreten (siehe Zusammenfassung Kapitel 6.5 sowie [70, 146, 168]). Fokale Adh¨asionen und fokale Komplexe werden an Hand ihrer Fl¨ achen-ausdehnung unterschieden. So weisen fokale Komplexe in etwa einen Durchmesser von 1µm auf [189], w¨ahrend die fokalen Adh¨asionen wesentlich gr¨oßer sind. In dieser Arbeit war jedoch auf Grund der oben genannten Probleme diese Unterscheidung nicht m¨oglich.
Auch die ¨Uberg¨ange zwischen den einzelnen Adh¨asionsstadien konnten dementsprechend nicht beobachtet werden.
Es konnte jedoch qualitativ beobachtet werden, dass Zellen, die mit Kr¨aften zwischen 150 und 300nN stimuliert wurden, h¨aufig die Dichte ihrer Adh¨asionspunkte ¨anderten.
Die Abbildung 63 zeigt im linken Bild die Verteilung der fokalen Adh¨asionen der nicht-stimulierten Zelle und im rechten Bild die Verteilung nach der Stimulation. Deutlich ist hier eine Erh¨ohung der Dichte der Adh¨asionspunkte zu erkennen, die f¨unf Minuten nach der mechanischen Stimulation auf das urspr¨ungliche Niveau zur¨uckkehrte. Allerdings konnte die Dynamik aus oben genannten Gr¨unden nicht quantitativ bestimmt werden.
10 mm
Abbildung 63: In der Abbildung ist die Verteilung des Vinculins ¨uber die Zelle invers dar-gestellt. Die dunklen Bereiche entsprechen einer hohen Vinculin-Konzentration. Die linke Seite zeigt die Zelle vor der Stimulation, die rechte Seite nach der Stimulation, die mit einer Kraft von 300nN erfolgte. Deutlich ist hier die erh¨ohte Konzentration an Adh¨asionspunkten zu erkennen.
6.8.2 Die Dynamik der fokalen Adh¨asionen steigt nach mechanischer Belastung Das oben beschriebene Ergebnis korreliert mit den Zugkraft¨anderungen nach mechanischer Stimulation: die Stimulation bewirkt eine sprunghafte Erh¨ohung oder Verringerung der zellul¨aren Zugkr¨afte, in deren Folge sich auch die Kraftverteilung auf die fokalen Adh¨ asio-nen ver¨andert (siehe Kapitel 6.5). Auch andere Arbeitsgruppen zeigten unl¨angst, dass die Dynamik der fokalen Adh¨asionen und deren Morphologie durch externe oder durch im Aktin-Myosin-Netzwerk erzeugte interne Kr¨afte beeinflusst wird. Jedoch verharren die Zel-len hier auf dem neuen, erh¨ohten oder verringerten Zugkraftniveau, w¨ahrend die Dynamik und die Anzahl der fokalen Adh¨asionen innerhalb von f¨unf Minuten nach der Stimulation auf den urspr¨unglichen Wert zur¨uckgeht.
Als Erkl¨arung f¨ur diese Beobachtung w¨are zum Beispiel folgender Mechanismus denk-bar: das durch die Stimulation erzeugte h¨ohere oder geringere Zugkraftniveau stellt einen ver¨anderten
”Ruhezustand“ innerhalb des Zytoskeletts der Zelle dar. Hierf¨ur er-folgt zun¨achst eine instantane ¨Anderung der Spannungsverh¨altnisse des bestehenden Zy-toskeletts, vermittelt durch die Aktivierung der Aktin-Myosin-Komplexe . Um dem neuen Zugkraftniveau der Zelle zu entsprechen, beginnt anschließend die Umorganisation des Zy-toskeletts. In deren Folge ¨andern sich die lokalen Kraftverh¨altnisse in der Zelle, w¨ahrend die auf das Substrat ¨ubertragene Gesamt-Zugkraft konstant bleibt. Diese Beobachtung konnte auch bei den Krafttransmissionsmessungen gemacht werden. Entsprechend der Remodel-lierung des Zytoskeletts und der Variation der Kraftverteilung ¨andert sich die Dynamik der fokalen Adh¨asionen. Nach Abschluss des Umbau-Prozesses geht der Auf- und Abbau der fokalen Adh¨asionen auf das urspr¨ungliche Niveau zur¨uck. Die Zugkr¨afte der Zelle weisen jetzt ein ver¨andertes Grundniveau auf. Auch das Zytoskelett wurde an die ver¨anderten Anforderungen angepasst.
Da die dynamischen ¨Anderungen der Adh¨asionsgr¨oße und -zahl in einem sehr begrenzten
6.8 Vertikale Stimulation und Vinculin-Konzentration
Zeitfenster erfolgen (externe Kr¨afte ¨andern die Morphologie von fokalen Adh¨asionen in-nerhalb weniger Sekunden [5]), m¨ussen letztendlich diese spekulativen Mechanismen durch Messungen mit einer Zeitaufl¨osung, in der die einzelnen Prozesse zeitlich aufgel¨ost darge-stellt werden k¨onnen, verifiziert werden. Eine zeitliche Aufl¨osung von deutlich unter einer Sekunde k¨onnte hierbei helfen, die Entstehung und die Umwandlung fokaler Komplexe in fokale Adh¨asionen zu zeigen.
7 Diskussion
Im Folgenden werden die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse nochmals aufge-griffen, um sie vor dem Hintergrund der mechanischen Eigenschaften von Zellen und deren Modellierung zu diskutieren.
7.1 Die Notwendigkeit der Modellierung der Zellmechanik
Wie die in der vorliegenden Arbeit durchgef¨uhrten Experimente zeigten, sind Zellen in der Lage, unterschiedliche mechanische Reize zu detektieren. Hierbei k¨onnen sie zwischen verschiedenen mechanischen Deformationen unterscheiden und mit einer entsprechenden Ver¨anderung in der Zellantwort auf diese reagieren.
Die Weiterleitung externer Kr¨afte wird von den mechanischen Eigenschaften der Zelle determiniert. Unter Zuhilfenahme mathematischer Modelle wird versucht, das mechanische Verhalten der Zelle zu beschreiben (siehe Kapitel 2.3.6), um so die Vorhersage zellul¨arer Prozesse zu erm¨oglichen. Gerade f¨ur die Interpretation der Mechanotransduktion und die Suche nach dem Mechanosensor k¨onnen solche ad¨aquaten Zellmodelle hilfreich sein. Auf den folgenden Seiten soll zun¨achst ein kurzer ¨Uberblick ¨uber die g¨angigen Modelle gegeben werden; im Anschluss folgt ein Vergleich der in dieser Arbeit erhaltenen experimentellen Ergebnisse mit diesen Modellen und ein Mischmodell wird vorgeschlagen.