3.5.2 Die Lichtquelle
Die in der Fluoreszenzmikroskopie am h¨aufigsten verwendeten Lichtquellen sind Quecksilber- oder Xenon-Kurzbogen-Hochdruckdampflampen. Beide weisen ein breites Emissionsspektrum (330nm bis 800nm) sowie eine hohe Lichtausbeute auf. Sie k¨onnen daher f¨ur jeden erh¨altlichen Farbstoff verwendet werden.
Im Folgenden werden zwei Systeme vorgestellt, die je nach der Art des verwendeten Farbstoffes zur Anwendung kommen.
Die Xenondampflampe F¨ur die Messung von Einzelwellenl¨angenfarbstoffen ist nur ein einfaches System, bestehend aus einer Xenondampflampe mit elliptischem Reflektor (300 Watt) und einem Interferenzfilter von N¨oten. Bei diesem System wird das Licht ¨uber einen Quarz-Lichtleiter in das Mikroskop eingekoppelt und gefiltert, so dass das ben¨otigte Anregungslicht zur Verf¨ugung steht.
Das Quanticell-System Beim Quanticell-System (Visitech, UK) handelt es sich um ein Bildanalyse-System, das mit einem Monochromator arbeitet (siehe Abbildung 13), der von einer Quecksilberdampflampe beleuchtet wird und ¨uber ein motorisiertes Gitter verf¨ugt. Letzteres erm¨oglicht einen schnellen Wechsel des Anregungsspektrums auch oh-ne den Austausch von Filtern. Mittels der zugeh¨origen
”Quanticell 700m“-Software kann die gew¨unschte Wellenl¨ange selektiv innerhalb weniger Millisekunden neu gew¨ahlt werden.
Das System erm¨oglicht damit die Messung der intrazellul¨aren Calciumkonzentration mit-tels Fura-2 unter einer hohen Zeitaufl¨osung. Hierbei wurden zur Verbesserung des Signal-zu Rauschverh¨altnisses mehrere Aufnahmen gemittelt, so dass eine Zeitaufl¨osung von circa einem Bild pro Sekunde erreicht wurde.
3.6 Entwicklung einer Lichtquelle
besitzen. Des Weiteren wiesen die erh¨altlichen Leuchtdioden ein Strahlprofil auf, das nur schwer in herk¨ommliche Fluoreszenzmikroskope eingekoppelt werden konnte.
Neben den Dioden standen alternativ Kurzbogen-Hochdruckdampflampen zur Verf¨ugung. Sie k¨onnen ¨uber einen großen Spektralbereich hinweg Licht emittieren. Da das Leistungsspektrum von Xenon-Lampen im Vergleich zu Quecksilber-Lampen konti-nuierlicher zwischen 340nm und 800nm verteilt ist und des Weiteren von diesen Lampen ein geringeres gesundheitliches Risiko ausgeht, fiel die Wahl auf eine Xenon-Kurzbogen-Hochdruckdampflampe (Leistungsaufnahme zwischen 150W und 500W).
3.6.2 Dynamischer Wechsel des Spektralbereichs
In dem in Kapitel 3.5 beschriebenen Quanticell-System (siehe Kapitel 3.5) wird ein mo-torisiertes Gitter verwendet, um mit diesem f¨ur Quotientenmessungen schnell zwischen verschiedenen Spektralbereichen wechseln zu k¨onnen. Aus mechanischen Gesichtspunkten ist die Nutzung eines motorisierten Gitters allerdings problematisch: durch den innerhalb einer Sekunde mehrmaligen Wechsel der Anregungswellenl¨ange wirken hohe Kr¨afte auf die Komponenten. Da jedoch ein m¨oglichst kosteng¨unstiges und wartungsfreies System realisiert werden sollte, wurde von der Verwendung eines motorisierten Gitters abgesehen.
Auch Filterr¨ader weisen ein ¨ahnliches Problem auf und sind nicht in der Lage, die An-regungswellenl¨ange bis zu 30 mal in der Sekunde zu ver¨andern, um so beispielsweise die zeitlich hochaufgel¨oste Beobachtung der Calciumdynamik mit Fura-2 zu erm¨oglichen. In der Folge wurde ein System entwickelt, wie es bislang kommerziell nicht erh¨altlich ist. Hier-bei handelt es sich um ein Lampengeh¨ause, das auf zwei senkrecht zueinander stehenden optischen Achsen das Licht der Dampflampe auskoppelt. Dadurch entf¨allt die komplizierte Justage von Lichtteilern, die außerhalb des Lampengeh¨auses die Aufteilung der Lichtwege erm¨oglichen w¨urden.
3.6.3 Aufbau der Lichtquelle zur Quotientenmessung
In Abbildung 15 ist der prinzipielle Strahlengang der entwickelten Lichtquelle gezeigt.
Die Xenon-Dampflampe strahlt in der Ebene des Lampenkolbens gleichm¨aßig, so dass in dieser Ebene zwei senkrecht zueinander stehende optische Achsen zur Auskopplung des Anregungslichts m¨oglich sind. Damit das abgestrahlte Licht m¨oglichst effektiv eingesam-melt wird, sollte mit asph¨arischen Linsen gearbeitet werden. Auf Grund des ben¨otigten Spektrums k¨onnen jedoch nur Linsen aus Quarzglas oder BK7 (Transmission >95% bei 340nm) verwendet werden. Beide lassen sich nicht in einem Pressverfahren herstellen und sind standardm¨aßig nur mit einem Durchmesser von einigen Millimetern zu erhalten. Des Weiteren kann die Sammellinse wegen der Gr¨oße des Glaskolbens (Duchmesser etwa 2cm) nicht beliebig nah an der Lichtquelle positioniert werden. Deshalb ist ein gr¨oßerer Durch-messer der Linse notwendig, um m¨oglichst viel Licht einsammeln zu k¨onnen. Auf Grund dieser Probleme wurde aus Kostengr¨unden auf die Verwendung von asph¨arischen Linsen verzichtet. An ihrer Stelle kam eine zuvor berechnete Kombination aus insgesamt drei kon-vexen und einer konkaven Linse zum Einsatz (Linos, Deutschland, siehe Abbildung 15). Mit dieser kosteng¨unstigen L¨osung k¨onnen auch randst¨andige Strahlen zu einem großen Teil eingesammelt und ann¨ahernd kollimiert werden (Verminderung der sph¨arischen
Abberati-on auf Grund der Linsenanordnung). Die Kollimierung ist notwendig, da das Licht durch einen Interferenzfilter mit schmaler Bandbreite f¨allt und so das ben¨otigte Anregungslicht herausgefiltert wird. Allerdings h¨angt dabei die spektrale Selektion vom Einfallswinkel des Lichts ab. Nach dem Interferenzfilter passiert das Licht die ¨Offnung eines magnetischen Verschlusses (engl.
”Shutter“, Nr. 016, Prontor, Deutschland), um anschließend mit Hilfe einer weiteren Sammellinse auf einen Quarzglas-Lichtleiter von 3,4mm Durchmesser fo-kussiert zu werden (Spezialanfertigung, Schott, Deutschland). ¨Uber den Lichtleiter wird das Anregungslicht in das Mikroskop eingekoppelt.
Auf der R¨uckseite der Lampe wurde ein parabolischer Spiegel montiert. Dieser reflektiert das r¨uckw¨artig zur Auskopplungsrichtung abgestrahlte Licht der Lampe und fokussiert es in die Lampe zur¨uck. Dabei wird zwar ein Teil des Lichts durch den Lichtbogen der Xe-nondampflampe absorbiert, die Lichtausbeute konnte jedoch trotzdem auf Grund dieses optischen Aufbaus um circa 60% gesteigert werden. Der Einbau eines manuellen Shutters (M32-615, Edmund Optics, USA) direkt vor dem parabolischen Spiegel sorgt zudem f¨ur die zur Justage der Auskopplungslinsen notwendige Eliminierung des r¨uckw¨artigen Lichts. Des Weiteren sind die Linsen und der parabolische Spiegel auf der optischen Achse (z-Achse) zum Teil gegeneinander verschiebbar (siehe Abbildung 15). Dadurch kann die chromati-sche Abberation des Lichts f¨ur verschiedene Spektralbereiche minimiert und damit eine effiziente Fokussierung des Lichts auf die Glasfaser f¨ur alle Wellenl¨angen gew¨ahrleistet werden. Daneben sind das gesamte Linsensystem und der parabolische Spiegel getrennt voneinander in der x- und y-Achse verschiebbar, so dass eine optimale Justierung auf die Ebene der maximalen Lichtausbeute der Xenon-Dampflampe erfolgen kann.
Beide Lichtwege sind identisch aufgebaut und koppeln jeweils das Anregungslicht in eines der Enden des dreiarmigen Lichtleiters ein (der dritte Arm steht f¨ur einen weiteren Aus-bau des Systems zur Verf¨ugung; in der Abbildung 15 nicht gezeigt). Auf Grund der durch die parabolischen Spiegel verursachten doppelten Refokussierung in den Glaskolben wurde ein leistungsstarker Ventilator in das Lampengeh¨ause integriert (7806 ES, Papst, Deutsch-land). Dieser sorgt durch einen maximalen Volumenstrom von bis zu 380m2/h f¨ur eine niedrige Sockeltemperatur der Dampflampe. Diese darf auf der Anodenseite 200◦C und auf der Kathodenseite 160◦C nicht ¨ubersteigen. Die an den Sockeln angebrachten K¨ uhlrip-pen (nicht gezeigt) verbessern hierbei die W¨armeabfuhr. Mittels zweier NTC1000 k¨onnen die Sockeltemperaturen mit einem elektronischen Thermometer abgelesen werden.
Die Ansteuerung der magnetischen Shutter erfolgt mittels der Bildanalyse-Software
” Me-tafluor 4“. Sie erm¨oglicht die stufenlose Einstellung der ¨Offnungszeiten und sendet ¨uber die parallele Schnittstelle TTL-Signale an eine entsprechend entwickelte Elektronik. Letz-tere wiederum stellt an die Shutter die erforderliche Spannung, so dass diese ge¨offnet und geschlossen werden k¨onnen. Gleichzeitig wird mittels der Software das Signal der CCD-Kamera aufgezeichnet und als Bilddatei auf der Festplatte gespeichert. Im Falle von Fura-2 werden die Shutter abwechselnd ge¨offnet und dabei die Fluoreszenz nach Anregung bei 380nm und Anregung bei 340nm aufgezeichnet. Anschließend wird aus den aufgenommen Bildern zu jedem Zeitpunkt das Verh¨altnis berechnet.
Die Entwicklung des beschriebenen Systems erm¨oglicht auch bei zeitlich hochaufgel¨osten Messungen eine Langzeitmessung ¨uber mehrere Stunden, da die Aufzeichnungsl¨ange nur von der Gr¨oße der Festplatte begrenzt wird.