zur initialen Mechanorezeption auf [221]. Diese Tatsache ist auf den Ablauf der Signal-kaskade zur¨uckzuf¨uhren, da unter anderem IP3 zun¨achst zum Endoplasmatischen Reti-kulum diffundieren muss. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass - vermutlich ¨uber
”gap-junctions“ - eine interzellul¨are Signalweiterleitung zu benachbarten Zellen stattfin-det. Die durch die mechanische Stimulation von Zellen freigesetzten Calciumionen k¨onnen ihrerseits beispielsweise zur Regulation des Zytoskeletts und der Genexpression dienen [24].
Auf Grund der Beteiligung von Calciumionen an der Mechanotransduktion wurde die intrazellul¨are Calciumkonzentration in der vorliegenden Arbeit beobachtet. Sie diente da-zu, unter der mechanischen Stimulation mit dem Kraftmikroskop eine erfolgreich initiierte Mechanotransduktion zu identifizieren. Des Weiteren kann durch die Beobachtung der in-trazellul¨aren Calciumkonzentration analysiert werden, ob die Art des mechanischen Reizes einen Einfluss auf die Calciumdynamik hat und in der Folge zu differenzierten Zellantwor-ten f¨uhrt. Ein solches Ergebnis k¨onnte dann wiederum auf die Aktivit¨at verschiedener Mechanosensoren schließen lassen.
2.4 Motivation dieser Arbeit
Nachdem in den letzten Abschnitten eine ausf¨uhrliche Einf¨uhrung zum biologischen Hin-tergrund dieser Arbeit gegeben wurde, soll nun die Notwendigkeit von zellbiologischen Experimenten unter Anwendung physikalischer Prinzipien dargelegt werden.
Grenzen etablierter Methoden Trotz zahlreicher Arbeiten zu diesem Thema ist die Identifizierung eines Mechanosenors bislang nicht gelungen. Auch seine genaue Funktions-weise bleibt unklar. Zwar bieten Scherfl¨usse und Dehnungsreize die M¨oglichkeit, Zellen mechanisch zu stimulieren, allerdings kann die applizierte Kraft und die daraus resultie-rende Deformation nicht quantitativ bestimmt werden. Mathematische Modelle die zur Berechnung der Wandscherkraft auf Zellen in einem Fl¨ussigkeitsstrom dienen helfen hier nur bedingt (siehe Kapitel 3.8), da beispielsweise die tats¨achliche Form der Osteoblasten und deren viskoelastische Eigenschaften nicht ber¨ucksichtigt werden. Des Weiteren k¨onnen Stimulationsparameter wie die Frequenz, die Amplitude und die Dauer der Stimulation mit herk¨ommlichen Belastungssystemen nicht ad¨aquat variiert werden (siehe Kapitel 3.8 und 3.7).
Quantifizierung der Belastung Insbesondere die Quantifizierung der einwirkenden Kr¨afte und der resultierenden Deformationen ist notwendig, um einen Einblick in die Funktionsweise und die Lokalisierung eines Mechanosensors zu erhalten. Denkbar w¨are zum Beispiel, das der Mechanosensor in Folge der ¨außeren Kraft entfaltet wird und seine verborgenen Bindungsstellen freilegt (siehe Kapitel 2.3.6). Die hierbei auftretende rever-sible Entfaltung von Molek¨ulen w¨urde zu viskoelastischen Effekten und damit zur Ener-giedissipation in der Zelle f¨uhren. Dabei bliebe der Mechanosensor zun¨achst deformiert, bis es beispielsweise unter Energieverbrauch (ATP) zur aktiven Relaxation des Molek¨uls kommt.
Ein physikalisches System zur Analyse der Mechanotransduktion Die bislang verwen-deten molekular- und zellbiologischen Methoden sind nicht in der Lage die bestehenden Fragestellungen zu beantworten. Hochsensible Messsysteme m¨ussen eingesetzt werden, da-mit die Mechanik der Mechanotransduktion im zellul¨aren Bereich untersucht werden kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das physikalische Prinzip der Rasterkraftmikroskopie f¨ur biologische Fragestellungen adaptiert und eingesetzt. Das neu entwickelte Kraftmikroskop bietet die M¨oglichkeit, einzelne Zellen gezielt zu stimulieren und dabei die applizierte Kraft eindeutig zu quantifizieren sowie die elastischen und viskoelastischen Eigenschaf-ten der Zelle zu messen (zum Beispiel die Energiedissipation durch die Deformation der Zelle). Des Weiteren k¨onnen neben der exakten Wahl der Amplitude der Kraft auch die Frequenz der Stimulation und die Zyklenzahl nahezu beliebig variiert werden. Das Kraft-mikroskop erlaubt die Applikation von Kr¨aften zwischen einigen Piko-Newton und einigen Mikro-Newton.
Die Mechanik des Mechanosensors Bei der Stimulation von Knochenfragmenten wur-de gezeigt, dass nur die zyklische Stimulation eine erh¨ohte Knochensynthese ausl¨ost [136], statische Belastungen hingegen nicht. Dabei spielen sowohl die Frequenz als auch die Am-plitude eine wichtige Rolle, da der Knochen in erster Linie h¨aufig auftretenden kleinen Deformationen ausgesetzt ist [194, 65]. So konnten Qin et al. an H¨uhnerknochen ermit-teln, dass eine minimale effektive Belastung von 70µ mit 100.000 Belastungszyklen bei 30Hz notwendig ist, um das Wachstum von Knochen anzuregen [182]. Es stellt sich daher die Frage, ob eine solche makroskopische Beobachtung auch auf mikroskopischer, also zel-lul¨arer Ebene wiederzufinden ist. Der Mechanosensor k¨onnte einem akkumulativen Prozess unterworfen sein, indem er durch schnell (Frequenz) wiederkehrende kleine Deformationen (Amplitude) immer weiter
”gespannt“ wird, bis eine Signalkaskade ausgel¨ost wird.
In dieser Arbeit wurden die biologischen und physikalischen Abl¨aufe im Knochen auf zellul¨arer Ebene untersucht, um die gewonnen Erkenntnisse im makroskopischen System anwenden zu k¨onnen. Die Analyse der Mechanik des Mechanosensors erfolgte mit Hilfe des Kraftmikroskops durch die Variation der Stimulationsparameter. Dabei spielt der Boten-stoff Calcium eine wichtige Rolle. Durch die Beobachtung des intrazellul¨aren Calciumspie-gels mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Methoden kann kontrolliert werden, ob durch die mechanische Stimulation mit dem Kraftmikroskop eine Mechanotransduktion bei den Zel-len initiiert wird. Des Weiteren kann die Abh¨angigkeit des Calciumsignals gegen¨uber den Stimulationsparametern (Frequenz, Amplitude und Zyklenzahl) und im Vergleich zu Deh-nungsreizen und Scherfl¨ussen untersucht werden. Die Ergebnisse der Calciummessungen sind in den Kapiteln 6.2, 6.3 und 6.4 zu finden.
Die Mechanik der Zelle Bei der Analyse der Mechanotransduktion nimmt die Zellme-chanik eine wichtige Rolle ein. Da das Wissen um die Kr¨afteverteilung in der Zelle unter einer externen Belastung notwendig ist, um die Weiterleitung der Deformation zu einem m¨oglichen Ort des Mechanosensors zu kl¨aren, wurde in dieser Arbeit das zellmechanische Verhalten mit Hilfe des Kraftmikroskops untersucht. Hierzu werden die auf die Adh¨ asions-seite der Zelle ¨ubertragenen Kr¨afte analysiert. Die Analyse erfolgt mit der so genannten
”Zugkraft-Mikroskopie“ (siehe Kapitel 5), die die Quantifizierung der auf das Zellsubstrat
¨ubertragenen Kr¨afte erlaubt (siehe Kapitel 6.6). Mit Hilfe dieser Messungen k¨onnen die
2.4 Motivation dieser Arbeit
Vorhersagen der g¨angigen Zellmodelle evaluiert werden (siehe Kapitel 7).
Die Beobachtung der internen Kraftweiterleitung erm¨oglicht zudem die Analyse der Aus-wirkungen verschiedener Stimulationsarten auf den m¨oglicherweise auf der Adh¨asionsseite lokalisierten Mechanosensor. W¨ahrend die Darstellung der Auswirkung von Dehnungsrei-zen auf die Adh¨asionsseite der Zellen aus theoretischen ¨Uberlegungen heraus erfolgt, wer-den Krafttransmissionsmessungen an Osteoblasten durchgef¨uhrt, die unter dem Einfluss von Scherkr¨aften stehen (siehe Kapitel 6.7). Auf diesem Wege wird ein direkter Vergleich der unterschiedlichen Stimulationsarten auf die interne Kraftweiterleitung m¨oglich und auftretende Variationen der Zellantwort k¨onnen hinsichtlich der Zellmechanik analysiert werden.
Aktive Antworten der Zelle in Korrelation mit Calcium und Vinculin Da Calciumsi-gnale teilweise den Umbau des Zytoskeletts regulieren und an der Generierung von Sub-stratkr¨aften beteiligt sind, ist es denkbar, dass durch die Mechanotransduktion die auf das Substrat ¨ubertragenen Kr¨afte aktiv beeinflusst werden. Um dies zu untersuchen, wur-den Osteoblasten mittels des Kraftmikroskops und der Dehnungsmaschine mechanisch sti-muliert und gleichzeitig die wirkenden Adh¨asionskr¨afte beobachtet (siehe Kapitel 6.5.1).
Hiermit k¨onnen m¨oglicherweise weitere Unterschiede bei der Mechanotransduktion unter verschiedenen Stimulationen analysiert werden. Die zus¨atzlich durchgef¨uhrten fluoreszenz-mikroskopischen Beobachtungen des Adh¨asionsproteins Vinculin k¨onnen außerdem helfen, die Rolle der Adh¨asionspunkte in der Mechanotransduktion besser zu verstehen (siehe Ka-pitel 6.8).
Die Analyse verschiedener Aspekte der Mechanotransduktion wie die Calciumkonzentra-tion, die aktive Kraftgenerierung, das Verhalten der Adh¨asionspunkte und deren zeitlich Kopplung kann dazu dienen, einen besseren Einblick in den Ablauf der Mechanotransduk-tion zu erhalten.
3 Fluoreszenzmikroskopie und zellbiologische Methoden
3.1 Einleitung
Im Rahmen dieser Arbeit werden zellbiologische Fragestellungen mit physikalischen Sy-stemen untersucht. Dabei stehen die mechanischen und physikalischen Aspekte der Me-chanotransduktion im Vordergrund. Da hierbei die Anwendung zellbiologischer Methoden unumg¨anglich ist, werden diese im folgenden Kapitel dargestellt.
Zun¨achst wird eine Einf¨uhrung in die Zellkultivierung gegeben, die f¨ur die zellbiologische Arbeit unabdingbar ist.