26000 28000 30000 32000 34000 36000 38000 0
50 100 150 200 250 300 350
26000 28000 30000 32000 34000 36000 38000
0 50 100 150 200 250 300 350
Approach Retract
Force/nN
Piezo Position / nm
Abbildung 25:Kraft-Abstands-Kurve auf einer Zelle, aufgenommen mit dem Kraftmikroskop.
Die am PSD registrierte Auslenkung des Cantilevers wurde direkt in eine Kraft umgerechnet.
Die rote Kurve gibt die Ann¨aherung des Cantilevers auf die Zelloberfl¨ache wieder. Die schwarze Kurve stellt den R¨uckzug des Cantilevers dar. Durch die viskoelastischen Eigenschaften der Zelle liegt die R¨uckzugskurve unterhalb der Ann¨aherungskurve. Aus der Fl¨ache zwischen den beiden Kurven kann die dissipierte Energie berechnet werden.
Abbildung 25).
Neben der maximalen Kraft kann aus den Kraft-Abstands-Kurven auch die graduelle Steifigkeitszunahme der Zelle und die in das Zellsystem eingebrachte Energie berechnet werden. Letztere wird durch die Fl¨ache zwischen Ann¨aherungs- und R¨uckzugs-Kurve re-pr¨asentiert.
Die Kraft-Abstands-Kurven zeigen teilweise h¨oherfrequente Rauschanteile, die von ¨ auße-ren St¨oreinfl¨ussen herr¨uhren. Hierf¨ur sind neben dem Anwender in erster Linie Geb¨ aude-schwingungen - hervorgerufen zum Beispiel durch Klimaanlagen - verantwortlich. Die-se Rauschquellen begrenzen die Kraftaufl¨osung des Systems erheblich. Um das Rau-schen m¨oglichst gut eliminieren zu k¨onnen, wurde ein mit Luft ged¨ampfter Schwebetisch (500er Serie, TMC, USA) verwendet. Jedoch weist der Frequenzgang des Tisches Tiefpass-Eigenschaften auf, so dass Schwingungen unter 30Hz nur schlecht ged¨ampft werden (siehe Abbildung 26). Hier entsteht ein Problem, da die Geb¨audeschwingungen im Bereich zwi-schen 20 und 25 Hz liegen. Selbst eine Optimierung des Schwebetisches konnte dieses Problem nur zum Teil beheben, da die gr¨oßten Amplituden in lateraler Schwingungsrich-tung auftreten. Letztere werden jedoch deutlich schlechter ged¨ampft als vertikale Schwin-gungen. Der Einsatz eines aktiv-ged¨ampften Schwebetisches, beispielsweise auf der Basis piezoelektrischer Verstelleinheiten, k¨onnte das Problem l¨osen, scheiterte jedoch an Kosten-gr¨unden.
4.4.2 Bestimmung vertikaler Federkonstanten
Die vertikale Federkonstante eines Cantilevers kann h¨aufig dem Datenblatt des Herstellers entnommen werden. Die Produktion der Cantilever erfolgt in großer St¨uckzahl auf Wa-fern. Da Ihre Federkonstante mit der Position auf dem Wafer um bis zu 20% variieren kann, ist die Kalibrierung jedes einzelnen Cantilevers notwendig. Im Folgenden werden die
4.4 Kalibrierung und Federkonstante
1 0 1 0 0 1 0 0 0
1 E - 6 1 E - 5 1 E - 4 1 E - 3
Compliance / mm/N
F r e q u e n c y / H z
Abbildung 26: D¨ampfungseigenschaften des Schwebetisches von TMC (Quelle: TMC)
wichtigsten Kalibrierungsmethoden erl¨autert.
Thermisches Rauschen und Substrat-Kopplung Die Federkonstante eines Cantilevers kann durch die Analyse des thermischen Rauschens bestimmt werden. Da sich ein Can-tilever wie ein Federpendel mit angeh¨angter Masse verh¨alt, folgt dieser dem Hook´schen Gesetz. Dieses besagt, dass die R¨uckstellkraft einer Feder proportional zu deren Auslen-kung ist. Auf Grund der thermischen Anregung hat ein solcher harmonischer Oszillator immer eine mittlere Energie, die sich nach dem Gleichverteilungssatz der Thermodynamik zu gleichen Teilen auf potentielle und kinetische Energie aufteilt:
H = p2 2m + 1
2mω02q2 (6)
Mittels der Boltzmann-Konstanten ergibt sich damit f¨ur die Federkonstante der Cantile-ver:
k = kBT
hq2i (7)
Dabei charakterisierthq2idie mittlere quadratische Auslenkung des Oszillators. Quadriert man das Schwingungsspektrum, so ergibt sich das Leistungsdichtediagramm. Nach dem Parsevalschen Theorem entspricht dabei die Fl¨ache unter der Kurve der mittleren quadra-tischen Auslenkunghq2i. Durch Anfitten mit einer Lorentzkurve kann die Fl¨ache bestimmt werden. Eine detailliertere Beschreibung der Berechnung erfolgte durch Hutter [111]. Der Nachteil bei der Verwendung des thermischen Rauschens zur Bestimmung der Federkon-stanten liegt in der verh¨altnism¨aßig großen Ungenauigkeit. Der Standardfehler betr¨agt bis zu 30% [178]. Der Vorteil ist jedoch, dass mit dieser Methode Cantilever mit angekleb-ten Mikrokugeln, wie sie im Rahmen dieser Arbeit zum Einsatz kamen, kalibriert werden k¨onnen. Der verwendete Kleber beeinflusst die Federkonstante des Cantilevers und wird beispielsweise in der Berechnung der Federkonstanten nicht ber¨ucksichtigt (siehe folgenden Abschnitt).
Alternativ zu der oben vorgestellten Methode des thermischen Rauschens kann die von Craig beschriebene Prozedur zu Kalibrierung von Cantilevern angewendet werden [38]. Bei
dieser Methode wird unter dem zu kalibrierenden Cantilever ein Substrat mit harmoni-schen Oszillationen angeregt. Die Schwingungen des Substrates koppeln ¨uber viskoelasti-sche Effekte mit der kolloidalen Sonde des Cantilevers. Dessen dynamiviskoelasti-sche Antwort kann daraufhin zur Bestimmung der Federkonstanten herangezogen werden. Auch wenn hier die am Cantilever angeklebten Partikel zur Bestimmung der Federkonstanten ber¨ucksichtigt werden, ist diese Methode jedoch experimentell zu aufwendig.
Berechnung der Federkonstanten Die einfachste M¨oglichkeit, die Federkonstante eines Cantilevers zu bestimmen, ist die Berechnung mit Hilfe seiner physikalischen Eigenschaften [205]. Jedoch ist auch diese Methode mit großen Fehlern behaftet. Die Berechnung erfolgt nach der Formel:
k = Ew 4
t l
3
(8) Dabei symolisiert k die Federkonstante f¨ur balkenf¨ormige Cantilever, w, t und l seine Brei-te, die H¨ohe und die L¨ange. E charakterisiert das Elastizit¨atmodul des Auslegers. Letzteres l¨asst sich allerdings nur schwer bestimmen. Die H¨ohe stellt einen kritischen Parameter dar, da sie in der dritten Potenz in die Berechnung eingeht. So f¨uhren kleine Variationen bei der Herstellung bereits zu einer erheblichen ¨Anderung der Federkonstanten. Schon das Bedampfen mit Gold f¨uhrt zu einem signifikanten Einfluss auf das Elastizit¨atsmodul des Cantilevers und damit auf die Federkonstante. Außerdem wurden in der vorgestellten Kraftapparatur ¨uberwiegend V-f¨ormige Cantilever verwendet, so dass eine weitere N¨ ahe-rung in die Berechnung einfließen m¨usste.
Verschiebung der Resonanzfrequenz Eine wesentlich genauere Methode zur Bestim-mung der Federkonstanten wurde von Cleveland vorgestellt [29]. Durch das Anh¨angen kleiner Partikel an die Spitze des Cantilevers wird dessen Masse ver¨andert (engl.
”added mass method“). Die ¨Anderung der Masse bewirkt eine Verschiebung der Resonanzfrequenz des Cantilevers. Wird der Cantilever als ideales Federpendel betrachtet, so kann die Re-sonanzfrequenz durch folgende Formel errechnet werden:
ν = 1 2π
r k
M +m∗ (9)
In dieser Formel wird die effektive Masse des Cantilevers durchm∗ und die an der Spitze angebrachte zus¨atzliche Masse durch M charakterisiert. Die ¨Anderung der Masse erfolgt durch die Adh¨asion kleiner Partikel, deren Gr¨oßen im Elektronenmikroskop bestimmt wer-den. ¨Uber die Dichte der Partikel wiederum kann ein R¨uckschluss auf deren Masse gezogen werden. Die Bestimmung der Resonanzfrequenz erfolgt durch einen Spektrum-Analysator.
Tr¨agt man die effektive Masse gegen 1/ν2 auf, so kann an mindestens zwei Messpunkten eine lineare Regression durchgef¨uhrt und die Federkonstante bestimmt werden.Der Vorteil dieser Methode liegt mit einer Standardabweichung von etwa 5% in der relativ hohen Ge-nauigkeit. Da jedoch der experimentelle Aufwand sehr hoch ist, ist es sinnvoll, mit diesem Verfahren nur einen Referenz-Cantilever zu kalibrieren und diesen zur Bestimmung der Federkonstanten anderer Cantilever zu benutzen.
4.4 Kalibrierung und Federkonstante
Kalibrierung mit Referenzcantilevern Der mit Clevelands Methode erstellte Referenz-Cantilever dient der Kalibrierung anderer Referenz-Cantilever. Hierzu wird die Spitze des zu kali-brierenden Cantilevers gegen den Referenz-Cantilever gedr¨uckt (siehe Abbildung 27) und eine Kraft-Abstands-Kurve aufgenommen. Anschließend wird die Sensitivit¨at des zu
kali-Abbildung 27:Schnelle Bestimmung der Federkonstanten mit Hilfe eines Referenzcantilevers.
Dabei wird der zu kalibrierende Cantilever gegen einen kalibrierten Referenzcantilever gedr¨uckt.
Aus den Verschiebewegenδtot undδtestsowie dem Inklinationswinkel ϕkann nach der Gleichung 10 die Federkonstante des Cantilevers berechnet werden.
brierenden Cantilevers bestimmt, indem eine Kraft-Abstands-Kurve auf einer harten Ober-fl¨ache aufgenommen wird. Aus den Steigungen der zwei Kraft-Abstands-Kurven kann mit Hilfe der Federkonstanten des Referenzcantilevers die Federkonstante des zu kalibrierenden Auslegers bestimmt werden:
k=krefCGlas−CCl
CClcosϕ (10)
Dabei charakterisieren CCl und CGlas die Steigungen der Kraft-Abstands-Kurven, die aus der Sensitivit¨atsmessung (Cantilever gegen Glas) und der Referenz-Cantilever-Messung (Cantilever gegen Referenzcantilever) gewonnen wurden [79, 225]. ϕ kennzeichnet den Inklinationswinkel des Referenzcantilevers (siehe Abbildung 27). Die Standardabweichung liegt bei unter 10% und der Einfluss der angeklebten Partikel wird ber¨ucksichtigt.
Die Methode bietet eine gute M¨oglichkeit, schnell und verh¨altnism¨aßig genau die Fe-derkonstanten einer gr¨oßeren Anzahl von Cantilevern zu ermitteln und wurde deshalb in dieser Arbeit verwendet.
4.4.3 Bestimmung lateraler Federkonstanten
Im Vergleich zu vertikalen Federkonstanten ist die Messung lateraler (torsionaler) Feder-konstanten ungleich schwieriger.
”wedge“-Kalibrierung Eine Methode zur Ermittlung der torsionalen Federkonstanten stellt die so genannte
”wedge-calibration“ dar [60]. Unter Verwendung kommerziell herge-stellter Substrate, die zwei Steigungen definierter Gr¨oße aufweisen, wird die Kontaktant-wort des Cantilevers gemessen. Die Kalibrierungsgitter [207] konnten bis vor kurzem wegen des kleinen Abstands der f¨ur die Kalibrierung notwendigen Strukturen nur f¨ur Cantilever
mit feinen Spitzen verwendet werden. Neuerdings k¨onnen jedoch Substrate erworben wer-den, die eine Kalibrierung kollodialer Cantilever erlauben [231].
Berechnung lateraler Federkonstanten Die apparativen Voraussetzungen zur Bestim-mung der lateralen sind im Vergleich zu der vertikaler Federkonstanten deutlich anspruchs-voller. Da jedoch in erster Linie qualitative laterale Stimulationen durchgef¨uhrt wurden, gen¨ugt hier eine ungef¨ahre Bestimmung der lateralen Federkonstanten. Sie kann aus den Materialeigenschaften des Cantilevers gewonnen werden:
kΦ= D0c
6 (1 +ν) (L−∆L)×
1−
tanh
L−∆L c
p6 (1−ν) p6 (1−ν)
c L−∆L
(11)
Dabei ist D0=Et3 (E: Elastizit¨atsmodul), t die Dicke des Cantilevers,νdas Poissonverh¨ alt-nis und ∆L die Strecke zwischen dem Befestigungspunkt der Mikrokugel (Sonde des Canti-levers) und dem ¨außeren Ende des Cantilevers. Die Formel wurde aus der Scheibentheorie abgeleitet [190, 197] und diente in dieser Arbeit der einfachen Absch¨atzung lateraler Fe-derkonstanten rechteckiger Cantilever.