3.4.1 Das
”Green-Fluorescent-Protein“
Die Beobachtung von biologischen Prozessen in lebenden Zellen erfolgt heute weitestge-hend mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Hierbei k¨onnen bestimmte Proteine durch die Ankopplung eines fluoreszierenden Molek¨uls (
”Fluoreszenz-Tag“) in der Zelle sicht-bar gemacht werden. Das am h¨aufigsten verwendete Fluoreszenzmolek¨ul ist das
” Green-Fluorescent-Protein“ (GFP), ein Photoprotein der Quallenart Aequorea. Das Absorpti-onsmaximum von GFP liegt bei circa 488nm, w¨ahrend das Emissionsmaximum bei 508nm liegt [226].
Um das Vinculin als GFP-Fusionsprotein zu erhalten, muss in die Zelle die DNA-Sequenz des GFP-Vinculin-Fusionsproteins eingebracht werden. Dieser Prozess wird als Transfek-tion bezeichnet. Der Tr¨ager der DNA ist ein so genanntes Plasmid. Hierbei handelt es sich um eine ringf¨ormige DNA, die die DNA des Proteins und des GFPs tr¨agt. Beide DNAs sind so aneinander gekoppelt (
”tagged“), dass in der Folge ein Fusionsprotein gebildet wird. Nun kann das Verhalten des Vinculins in der lebenden Zelle unter Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.
3.4.2 Transiente Transfektion mit dem GFP-Vinculin-Vektor
Da in dieser Arbeit prim¨are Osteoblasten untersucht werden, kommt nur eine transiente (zeitlich begrenzte) Transfektion mit dem GFP-Vinculin-Plasmid in Frage. Eine stabile (dauerhafte) Transfektion, in der die Fremd-DNA in das Genom der Zelle eingebaut wird, ist nicht m¨oglich, da zur Erzeugung solcher Zellen h¨aufiges Passagieren notwendig w¨are.
Hierbei w¨urden sich jedoch die prim¨aren Zellen zum Beispiel zu Osteozyten differenzie-ren.
Da bei der wesentlich einfacheren transienten Transfektion die eingebrachte Fremd-DNA neben der zelleigenen DNA (extrachromosomal) zeitlich begrenzt vorliegt, k¨onnen die Zel-len lediglich ein bis drei Tage verwendet werden. Im Laufe der Zeit geht die transfizierte DNA durch zellinterne Prozesse (Abbau, Zellteilung, Ausschleusung) verloren.
Das zur Transfektion ben¨otigte GFP-Vinculin-Plasmid (siehe Abbildung 12) wurde freundlicherweise von Professor Benjamin Geiger aus dem Weizman Institut, Israel zur Verf¨ugung gestellt. Das von diesem Plasmid aus gebildete GFP-Vinculin wurde in die Adh¨asionspunkte der Zelle eingebaut.
Zur Transfektion des Plasmids in die prim¨aren Osteoblasten wurde das FuGENE 6 Transfection Reagent der Firma Roche (Indianapolis, USA) verwendet. Eine genauere Beschreibung ist auf Grund des molekularbiologischen Charakters dieser Methode nicht sinnvoll. F¨ur weitere Informationen kann die g¨angige Literatur zu Rate gezogen werden.
3.5 Fluoreszenzmikroskopie
Zur Beobachtung der beschriebenen Fluoreszenzfarbstoffe verwendet man in der Regel ein invertiertes Mikroskop, dessen prinzipieller Strahlengang in Abbildung 13 gezeigt ist.
Ampicillin
Vinculin-DNA CMV-Promoter
GFP-DNA
Abbildung 12: Schematische Darstellung des GFP-Vinculin-Vektors zur transienten Trans-fektion von Osteoblasten. Hervorgehoben sind der CMV-Promoter, der die Bildung des Vinculin-GFP kontrolliert, das Resistenz-Gen Ampicillin, das Vinculin-Gen sowie die Vinculin-GFP-Sequenz.
In dieser Arbeit wurde ein NIKON TE-2000U-Mikroskop benutzt, das die M¨oglichkeit bietet, das Emissionslicht auf verschiedene Ausg¨ange umzuleiten. Bei der verwendeten Lichtquelle handelt es sich um eine Xenon- oder Quecksilber-Kurzbogendampflampe. Das zur Anregung des Farbstoffes ben¨otigte Spektrum wurde ¨uber Interferenzfilter oder einen Monochromator in das Mikroskop eingekoppelt und das Anregungslicht anschließend ¨uber einen dichroitischen Spiegel durch das Objektiv auf die Probe geleitet. Die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz wurde ihrerseits vom Mikroskopobjektiv eingefangen und gelang-te in die Degelang-tektionseinheit.
Monochromator Excitation light
Fluorescence light
Emission filter
Mirror Dicroic mirror
Objective Probe
Intensified CCD camera
x
Light Source
Abbildung 13: Die Abbildung zeigt den schematischen Aufbau eines invertierten Mikroskops zu Fluoreszenzmessungen. Der Monochromator selektiert auf Grund der Gitterstellung das An-regungslicht bez¨uglich der Wellenl¨ange. Es wird ¨uber einen dichroitischen Spiegel durch das Mikroskopobjektiv auf die Probe geleitet. Die Fluoreszenz wird eingesammelt und gelangt durch den dichroitischen Spiegel auf einen Interferenzfilter, der St¨orsignale eliminiert. Die Detektion findet mit einer CCD-Kamera statt.
3.5.1 Die Detektionseinheit
Die h¨ochste Quanteneffizienz zur Detektion optischer Strahlung weisen Photomultiplier auf. Durch ihre kompakte Bauweise k¨onnen sie in den meisten Applikationen problemlos
3.5 Fluoreszenzmikroskopie
verwendet werden. Mit ihrer Hilfe wurde ein kompaktes, kosteng¨unstiges und energiespa-rendes Fluoreszenzsystem aufgebaut, das im Rahmen von Parabel- und Raketenfl¨ugen zum Einsatz kam, um die Calciumkonzentration von Osteoblasten unter Schwerelosigkeit zu untersuchen [215].
Die Anwendung von Photomultipliern erm¨oglicht jedoch nicht die r¨aumliche Abbildung einzelner Zellen. Auf Grund der schwachen Fluoreszenz der calciumsensitiven Farbstof-fe kam eine doppelt-intensivierte CCD-Kamera zur Anwendung (Extended ISIS, Photo-nic Science, UK), deren Quanteneffizienz bei etwa 30% liegt und die eine Aufl¨osung von 512x512 Bildpunkten liefert. Seit kurzem sind zus¨atzlich so genannte Electron-Multiplying-CCD-Chips (EMElectron-Multiplying-CCD-Chips) auf dem Markt verf¨ugbar (beispielsweise der
”Impactron“
von Texas Instruments). EMCCD-Chips basieren im Bau und in der Funktion auf dem Prinzip herk¨ommlicher CCD-Chips, verf¨ugen jedoch ¨uber eine zwischen dem Verschiebe-Register und dem Ausgangverst¨arker zus¨atzlich eingef¨ugte Verst¨arkungs-Struktur. Letz-tere dient der Vervielfachung der Elektronen, vermittelt durch Stoßionisation (siehe Ab-bildung 14), so dass deutlich h¨ohere Quanteneffizienzen erreicht werden k¨onnen (bis zu 60%). Die Stoßionisation wird durch das Anlegen einer Spannung von 40V bis 50V erreicht und ist damit wesentlich h¨oher als zum einfachen Ladungstransport notwendig w¨are. Auf diesem Weg k¨onnen neben dem Ausleserauschen auch der dynamische Bereich und die Quanteneffizienz erheblich verbessert werden.
Abbildung 14: Funktionsweise eines EMCCD-Chips: Durch Anlegen einer hohen Spannung am Register 2 (R2) des CCD-Chips kommt es zur Elektronen-Vervielfachung durch Stoßionisation (aus: Preliminary Specifications, Texas Instruments)
Bei der Verwendung von Farbstoffen die eine deutlich h¨ohere Emissionsintensit¨at auf-weisen kann auf den Einsatz einer intensivierten Kamera verzichtet werden. So wurde zur Abbildung von Mikrokugeln innerhalb von Polyacrylamidgelen (siehe Kapitel 5) eine Xi-lix Microimager 1400-10S-Kamera mit einem nicht intensivierten CCD-Chip verwendet.
Diese Kamera besitzt einen CCD-Sensor mit 1300x1000 Bildpunkten. Sie wurde ebenfalls zur in-vivo-Darstellung GFP-fusionierter zellul¨arer Proteine (siehe Kapitel 3.4) und f¨ur Phasenkontrastaufnahmen von Zellen verwendet.
3.5.2 Die Lichtquelle
Die in der Fluoreszenzmikroskopie am h¨aufigsten verwendeten Lichtquellen sind Quecksilber- oder Xenon-Kurzbogen-Hochdruckdampflampen. Beide weisen ein breites Emissionsspektrum (330nm bis 800nm) sowie eine hohe Lichtausbeute auf. Sie k¨onnen daher f¨ur jeden erh¨altlichen Farbstoff verwendet werden.
Im Folgenden werden zwei Systeme vorgestellt, die je nach der Art des verwendeten Farbstoffes zur Anwendung kommen.
Die Xenondampflampe F¨ur die Messung von Einzelwellenl¨angenfarbstoffen ist nur ein einfaches System, bestehend aus einer Xenondampflampe mit elliptischem Reflektor (300 Watt) und einem Interferenzfilter von N¨oten. Bei diesem System wird das Licht ¨uber einen Quarz-Lichtleiter in das Mikroskop eingekoppelt und gefiltert, so dass das ben¨otigte Anregungslicht zur Verf¨ugung steht.
Das Quanticell-System Beim Quanticell-System (Visitech, UK) handelt es sich um ein Bildanalyse-System, das mit einem Monochromator arbeitet (siehe Abbildung 13), der von einer Quecksilberdampflampe beleuchtet wird und ¨uber ein motorisiertes Gitter verf¨ugt. Letzteres erm¨oglicht einen schnellen Wechsel des Anregungsspektrums auch oh-ne den Austausch von Filtern. Mittels der zugeh¨origen
”Quanticell 700m“-Software kann die gew¨unschte Wellenl¨ange selektiv innerhalb weniger Millisekunden neu gew¨ahlt werden.
Das System erm¨oglicht damit die Messung der intrazellul¨aren Calciumkonzentration mit-tels Fura-2 unter einer hohen Zeitaufl¨osung. Hierbei wurden zur Verbesserung des Signal-zu Rauschverh¨altnisses mehrere Aufnahmen gemittelt, so dass eine Zeitaufl¨osung von circa einem Bild pro Sekunde erreicht wurde.