4.2.1 Verlauf der M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpertiter
Die Ergebnisse der Titerverlaufskontrolle sind in Tabelle 9 und Abbildung 4 dargestellt.
Zu Versuchsbeginn lagen die P/PK Werte aller Ferkel bei null. Es wurden also bei keinem der Tiere M.-hyopneumoniae-spezifische Antikörper im Serum nachgewiesen.
Die Voraussetzung für die Teilnahme am Versuch war somit bei allen Ferkeln erfüllt.
Zum Zeitpunkt von BP 1, also 20 Tage nach der ersten und 7 Tage nach der zweiten Immunisierung, lagen die P/PK Werte zwischen 0,64 und 1,38 und somit deutlich im positiven Bereich. In BP 2 waren die P/PK Werte ebenfalls deutlich angestiegen. Bis zum Zeitpunkt von BP 3, also bei der Serumgewinnung, wurde bei allen Tieren ein weiterer, jedoch nur geringer Anstieg der Werte festgestellt. Tier 97 und Tier 169
erreichten bei Versuchsende mit 1,84 und 1,86 die höchsten Werte, Tier 17 mit 1,58 den niedrigsten Wert. Die anderen Tiere unterschieden sich mit Werten zwischen 1,72 und 1,79 nur wenig voneinander. Es ist kein Unterschied zwischen den unterschiedlichen Impfstoffen zu erkennen. In den Seren der Kontrolltiere konnten keine M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörper detektiert werden (Daten nicht dargestellt).
BP = Blutprobe; Proben mit P/PK < 0,30 werden als negativ, 0,30 ≤ P/PK ≤ 0,40 als fraglich und P/PK > 0,40 als positiv gewertet; BP 2 von Tier 17 konnte nicht gemessen werden.
0 1 2 3
Abbildung 4: Verlauf des Gehaltes an M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern im Serum.
Proben mit P/PK < 0,30 (untere gepunktete Linie) werden als negativ, 0,30 ≤ P/PK ≤ 0,40 als fraglich und P/PK > 0,40 (obere gepunktete Linie) als positiv gewertet. Die Werte stellen den Mittelwert zweier Messungen dar. Die beiden Farbtöne einer Grundfarbe entsprechen jeweils demselben Impfstoff.
Blutprobe zwei von Tier 17 konnte nicht gemessen werden.
4.2.2 Proteinbestimmung
Der Proteingehalt in den Seren wurde zuerst semiquantitativ bestimmt. Wie in Abbildung 5 zu erkennen ist, ist das Bandenmuster der verschiedenen Seren identisch. Rein optisch können kaum Unterschiede in der Farbintensität der Banden zwischen den Seren festgestellt werden. Das deutet darauf hin, dass der Proteingehalt der Seren sich nicht maßgeblich unterscheidet.
Abbildung 5: Coomassie-Brillantblau-Proteinfärbung der Hyperimmunseren nach SDS-PAGE.
Serumverdünnung: 1:50; Als Standard wurde low molecular weight (LMW) Marker verwendet.
Die tatsächliche Proteinkonzentration in den Seren wurde anschließend mit dem MicroBC-Assay bestimmt. Die Messung ergab, dass die Proteinkonzentrationen der Seren deutlich unterschiedlich waren (s. Tabelle 10). Die niedrigste Proteinkonzentration weist mit 38,6 mg/ml das Serum von Tier 128 auf.
Demgegenüber enthält das Serum von Tier 169 mit 65,0 mg/ml fast doppelt so viel Protein. Die Seren der Tiere 17 und 97 enthalten mit 42,5 mg/ml bzw. 42,1 mg/ml fast gleich viel Protein. Ebenfalls vergleichbare Werte werden in den Seren von Tier 18 und 98 erreicht. Die Werte von Tier 129 mit 58,5 mg/ml und Tier 168 mit 56,3 mg/ml stellen zusammen mit dem Wert von Tier 169 die drei höchsten Messergebnisse dar. Der Referenzwert für 56 - 84 Tage alte Tiere liegt bei 42 - 68 mg/ml und für 100 - 180 Tage alte Tiere bei 52 - 80 mg/ml (NERBAS 2008). Die Proteinkonzentrationen der Versuchstiere liegen an der unteren Grenze oder sogar unterhalb des Referenzbereiches. Aus diesem Grund wurden die Proben zusätzlich mit einem Cobas
Mira Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) automatisiert gemessen. Das Gerät wendet dabei die Biuret-Methode an. Die Werte liegen hier zwischen 44,7 - 56,1 mg/ml und damit ebenfalls im unteren Bereich oder unterhalb des Referenzwertes. Die Schwankungen zwischen den Tieren sind allerdings geringer. Die Werte stimmen besser mit dem Ergebnis der semiquantitativen Proteinbestimmung (s.
Abbildung 5) überein. Bei Sortierung der Proben nach aufsteigender Proteinkonzentrationen decken sich die Assays annähernd.
Neben der Proteinkonzentration wurde auch die Albuminkonzentration bestimmt.
Diese liegt bei allen Versuchstieren mit Werten von 23,4 mg/ml bis 35,2 mg/ml im Referenzbereich von 20 - 40 mg/ml (NERBAS 2008).
Tabelle 10: Protein-, Albumin-, IgG- und IgA-Konzentration der Hyperimmunseren.
Tieridentifikation 17 18 97 98 128 129 168 169 Protein [mg/ml]
BCA 42,5 46,0 42,1 45,3 38,6 58,5 56,3 65,0 Protein [mg/ml]
Biuret 48,2 51,1 44,7 50,7 45,9 56,4 48,1 56,5 Albumin [mg/ml] 30,7 35,2 23,4 33,9 31,7 30,6 28,4 30,2 IgG [mg/ml] 2,42 1,64 2,37 2,58 1,64 4,74 3,06 4,28 IgA [mg/ml] 0,60 0,22 0,60 0,25 0,12 0,49 0,25 0,51
4.2.3 Nachweis und Quantifizierung von IgG- und IgA-Antikörpern
Mittels Western Immunoblot konnten IgG- und IgA-Antikörper in den Hyperimmunseren nachgewiesen werden, wie in Abbildung 6 dargestellt ist. Die Isotyp-spezifischen Sekundärantikörper binden an Proteine, die auf Membran A 50 kDa und 23 kDa groß und auf Membran B 55 kDa groß sind. Das entspricht der Größe der leichten und schweren Kette von IgG bzw. der schweren Kette von IgA. Die leichte Kette von IgA mit einer Größe von ebenfalls 23 kDa wird von diesem Sekundärantikörper nicht detektiert. Er ist nur spezifisch für die schwere Kette.
Neben der semiquantitativen Bestimmung von IgG und IgA im Western Immunoblot wurde ebenfalls eine Quantifizierung der beiden Antikörperisotypen durchgeführt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 10 dargestellt. Die Konzentration an IgG reicht von
1,64 mg/ml bei den Tieren 18 und 128 bis zu 4,74 mg/ml bei Tier 129. Die Werte für IgA liegen zwischen 0,12 - 0,60 mg/ml.
Abbildung 6: Nachweis von IgG und IgA in den Hyperimmunseren nach SDS-PAGE.
Serumverdünnung: 1:50; Die Proteine wurden auf eine Nitrocellulose-membran geblottet, geblockt und dann mit Ziegen-Anti-Schwein-IgG (A) oder Ziegen-Anti-Schwein-IgA (B), AP konjugiert (1:2.000) inkubiert. Als Größenstandard wurde PageRuler™ (PR) verwendet.
4.2.4 Nachweis M.-hyopneumoniae-spezifischer IgG- und IgA-Antikörper
Um nun das spezifische Bindungsmuster der beiden Antikörperisotypen mit den Antigenen aus dem Ganzzelllysat zu charakterisieren, wurde ein Western Immunoblot durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 dargestellt. Auf den IgG-Spuren beider Seren stellt sich eine Vielzahl an Banden dar. Das spricht für das Vorhandensein einer großen Menge an spezifischen IgGs. Dagegen ist in den IgA-Spuren nur eine schwache Bande zu erkennen, die etwa auf der Höhe der 55 kDa Bande des Größenstandards liegt. Die Menge an M.-hyopneumoniae-spezifischen IgA-Antikörpern in den Seren ist also gering, sodass im Western Immunoblot keine
spezifischen Signale detektiert werden konnten. Aus diesem Grund wurden im Weiteren nur die IgG-vermittelten spezifischen Reaktionen in den Seren untersucht.
Abbildung 7: Vergleich der IgG- und IgA-vermittelten M.-hyopneumoniae-spezifischen Reaktionen. M. hyopneumoniae 232 Ganzzelllysat wurde einer SDS-PAGE unterzogen und die Proteine auf eine Membran geblottet. Als Primärantikörper wurde Hyperimmunserum (1:250) verwendet. Als Sekundärantikörper wurde Ziegen-Anti-Schwein-IgG oder -IgA (1:2.000), AP konjugiert, eingesetzt. Als Größenstandard wurde PageRuler™ (PR) verwendet.
Im nächsten Schritt wurden das Vorhandensein M.-hyopneumoniae-spezifischer IgG-Antikörper in den Seren aller Tiere vor Versuchsbeginn (BP 0) und in den finalen Hyperimmunseren (BP 3) verglichen. Das Bindungsmuster von spezifischen IgG-Antikörpern mit Ganzzelllysat von M. hyopneumoniae ist in Abbildung 8 dargestellt. Auf der Kontrollspur (K) sind zwei Banden zu erkennen, eine bei ca. 50 kDa und eine weitere bei ca. 23 kDa. Da hier kein Primärantikörper verwendet wurde, stellen diese Banden unspezifische Bindungen des Sekundärantikörpers dar. Alle Banden in anderen Spuren, die auf derselben Höhe liegen, müssen ebenfalls als unspezifische Signale gewertet werden. Auf den Spuren, die mit Serum von BP 0 inkubiert wurden (blaue Zahlen), sind außer den unspezifischen Bindungen des Sekundärantikörpers keine weiteren Banden zu erkennen. Es liegen keine M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörper vor. Im Vergleich dazu stellen sich in den Spuren, die mit Serum von BP 3, also dem finalen Hyperimmunserum, inkubiert wurden, viele verschiedene Banden dar (grüne Zahlen). Die Immunisierung hat folglich zur Bildung spezifischer IgG-Antikörper geführt, die an Antigene von unterschiedlicher
Größe aus dem Ganzzelllysat binden. Das Bandenmuster zweier Tiere, die mit demselben Impfstoff immunisiert wurden, ist bei allen Impfstoffen ähnlich. Zwischen den verschiedenen Impfstoffen lassen sich aber auch Unterschiede in den Bandenmustern erkennen.
Abbildung 8: M.-hyopneumoniae-spezifische IgG-Antikörper im Serum bei BP 0 und BP 3. BP
= Blutprobe; 200 µg M. hyopneumoniae 232 Ganzzelllysat wurde einer SDS-PAGE unterzogen und die Proteine auf eine Membran geblottet. Als Primärantikörper wurde Serum (1:250) von BP 0 (hellblaue Zahlen) oder BP 3 (grüne Zahlen) verwendet. Die Zahlen über den Spuren stehen für die Identifikationsnummer eines Tieres. Als Sekundärantikörper wurde Ziegen-Anti-Schwein-IgG (1:2.000), AP konjugiert verwendet. In der Kontrolle (K) wurde der Inkubationsschritt mit Serum übersprungen und ausschließlich mit Sekundärantikörper inkubiert. Die darauf dargestellten Banden (Sternchen) stellen unspezifische Bindungen dar. Im Bild wurden zwei Membranen (Spuren 17 - 98 und Spuren 128 – K) aneinandergefügt. Als Größenstandard wurde PageRuler™ (PR) verwendet.