Untersuchung der BALF

4.3.1 Proteinbestimmung

Die Ergebnisse der semiquantitativen Proteinbestimmung in den BALF-Proben zeigt Abbildung 9. Obwohl von allen Proben dasselbe Volumen aufgetragen wurde, stellen sich die Spuren mit unterschiedlicher Farbintensität dar. Der Proteingehalt der Proben ist folglich unterschiedlich. Die augenscheinlich geringste Menge an Protein ist in der BALF von Tier 97, die höchste hingegen in der BALF von Tier 17 enthalten. Das Bandenmuster ist in allen Proben identisch.

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Abbildung 9: Coomassie-Brillantblau-Proteinfärbung der BALF-Proben. BALF-Proben wurden 1:2 verdünnt und einer SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine wurden unspezifisch mit Coomassie-Brillantblau angefärbt. Von Tier 129 konnte aus technischen Gründen keine BALF gewonnen werden.

Als Standard wurde low molecular weight (LMW) Marker verwendet.

Nachdem durch die Brillantblaufärbung ein erster Überblick über die Proteinkonzentrationen gewonnen werden konnte, wurde im Anschluss der tatsächliche Proteingehalt bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt. Bei der Gewinnung von BALF kommt es aus technischen Gründen unweigerlich zu einer unterschiedlich starken Verdünnung der Proben. Da durch diese Verdünnung ein direkter Vergleich der Protein- und Immunglobulingehalte untereinander nicht aussagekräftig ist, wurden die Ergebnisse normiert. Dazu wurde der Quotient aus [Harnstoff^Plasma] und [Harnstoff^BALF] gebildet und so der Verdünnungsfaktor ermittelt, mit dem die Messwerte dann multipliziert wurden (POCINO et al. 2015, STJARNE ASPELUND et al. 2018). Die normierten Werte sind ebenfalls in Tabelle 11 dargestellt.

Bei Vergleich der Konzentrationen untereinander wird im Folgenden auf die normierten Werte Bezug genommen.

Tabelle 11: Harnstoff-, Protein-, IgG- und IgA-Konzentrationen der BALF-Proben.

Tieridentifikation 17 18 97 98 128 168 169 Harnstoff Serum

[mmol/l] 4,01 4,76 4,87 3,54 5,45 4,85 3,82 Harnstoff BALF

[mmol/l] 1,54 1,32 0,81 0,47 1,56 1,07 0,98 Harnstoff^Serum/

Harnstoff^BALF 2,6 3,6 6,0 7,5 3,5 4,5 3,9 Protein [mg/ml] 0,84 0,79 0,31 0,50 0,36 0,74 0,84 Protein normiert

[mg/ml] 2,19 2,84 1,88 3,70 1,25 3,31 3,26 IgA [mg/ml] 0,10 0,12 0,03 0,05 0,02 0,11 0,11 IgA normiert

[mg/ml] 0,26 0,43 0,18 0,38 0,07 0,40 0,43 IgG [mg/ml] 0,12 0,02 0,01 0,01 0,02 0,04 0,06 IgG normiert

[mg/ml] 0,31 0,07 0,06 0,08 0,07 0,18 0,23

Die Proben wurden normiert, indem das Verhältnis [HarnstoffPlasma] / [HarnstoffBALF] bestimmt und mit den Messwerten multipliziert wurde. Die normierten Werte sind fett dargestellt. Von Tier 129 konnte aus technischen Gründen keine Probe gewonnen werden.

Nach der Normierung wird deutlich, dass die auf dem Coomassie gefärbten Gel dargestellten Proteinkonzentrationen sehr stark von den unterschiedlichen Verdünnungen verfälscht sind und wenig Aussagekraft über die tatsächliche Proteinkonzentration der BALF haben. So erreicht zum Beispiel die Probe 98 mit 3,7 mg/ml und nicht Probe 17 die höchste Konzentration. Probe 18 erreicht mit 2,84 mg/ml eine höhere Konzentration als Probe 17 mit 2,19 mg/ml. Die Proben 168 und 169 haben mit 3,31 mg/ml bzw. 3,26 mg/ml etwa dieselbe Proteinkonzentration.

Den niedrigsten Wert mit 1,25 mg/ml weist Probe 128, den nächst höheren mit 1,88 mg/ml die Probe 97 auf.

4.3.2 Nachweis und Quantifizierung von IgG- und IgA-Antikörpern

Die Ergebnisse des Nachweises von IgG- und IgA-Antikörpern in den BALF-Proben sind in Abbildung 10 dargestellt. Auf beiden Membranen sind deutliche spezifische Banden zu erkennen. Auf der mit IgG-spezifischem Sekundärantikörper inkubierten Membran A sind zwei Banden zu erkennen, wovon eine bei etwa 55 kDa und die

andere bei etwa 25 kDa liegt. Dies entspricht der Größe der schweren Kette von IgG mit 50 kDa und der leichten Kette mit 23 kDa. Bei den mit dem IgA-spezifischen Sekundärantikörper inkubierten Proben auf Membran B liegt die Bande auf Höhe des 55 kDa Markers. Die schwere Kette von IgA hat ebenfalls eine Größe von 55 kDa. Auf den Membranen konnte somit IgG und IgA nachgewiesen werden. Die Intensität der Banden unterscheidet sich leicht.

Abbildung 10: Nachweis von IgG und IgA in BALF-Proben. BALF-Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und inkubiert mit AP konjugiertem Ziegen-Anti-Schwein-IgG (1:2.000) (A) oder Ziegen-Anti-Schwein-IgA (1:2.000) (B). A: spezifische Banden bei 50 kDa und 23 kDa; B: spezifische Bande bei 55 kDa; als Größenstandard wurde PageRuler™ (PR) verwendet.

Die Ergebnisse der Messung des Gesamtgehaltes an IgG und IgA in den BALF-Proben wurden wieder normiert und sind in Tabelle 11 gelistet. Die Konzentrationen an IgA in der BALF reichen von 0,07 mg/ml in Probe 128 bis zu 0,43 mg/ml in den Proben 18 und 169. Mit Werten von 0,38 mg/ml und 0,40 mg/ml liegen die Proben 98 und 168 ebenfalls im oberen Bereich. Deutlich weniger IgA ist dabei in den Proben 17 mit 0,26 mg/ml und 97 mit 0,18 mg/ml enthalten. Probe 128 weist neben der geringsten Konzentration an IgA auch die geringste

Proteinkonzentration auf. Anders verhält es sich mit den höchsten IgA-Konzentrationen in den Proben 18 und 169, die nicht zugleich die höchsten Proteinkonzentrationen aufweisen. Probe 97 mit der höchsten Proteinkonzentration erreicht nur den dritthöchsten IgA-Wert. Die IgG-Konzentrationen reichen von 0,07 mg/ml in den Proben 18 und 128 bis zu 0,31 mg/ml in Probe 17. Bei manchen Tieren ist der Wert für IgG genauso hoch wie der von IgA, wie beispielsweise in Probe 128. Teilweise liegt er aber auch über dem Wert von IgA, wie zum Beispiel bei Tier 17.

Hohe Konzentrationen an IgA bedingen nicht automatisch hohe Konzentrationen an IgG, wie man anhand der Proben 18, 168 und 169 erkennen kann. Die Proben 168 und 169 weisen sowohl verhältnismäßig hohe Protein- als auch hohe IgA- und IgG-Konzentrationen auf.

4.3.3 Nachweis M.-hyopneumoniae-spezifischer IgG- und IgA-Antikörper In Abbildung 11 sind die Ergebnisse des Nachweises von M.-hyopneumoniae-spezifischen IgG- und IgA-Antikörpern in den BALF-Proben dargestellt. Auf beiden Membranen stellen sich diverse, mehr oder weniger intensive Banden dar. Vom Sekundärantikörper konnten also Immunglobuline detektiert werden, die zuvor spezifisch an M.-hyopneumoniae-Antigene gebunden haben. Bei Betrachtung der beiden Kontrollspuren (K) fällt auf, dass beide Sekundärantikörper auch unspezifische Bindungen eingehen und unspezifische Signale liefern (vgl. Abbildung 7 und Abbildung 8). Auf Membran B, die mit IgA-spezifischem Sekundärantikörper inkubiert wurde, ist eine unspezifische Bande bei etwa 55 kDa und eine weitere, aber weniger deutliche, bei etwa 45 kDa zu erkennen. Auf der mit IgG-spezifischem Sekundärantikörper inkubierten Membran A stellen sich dagegen zwei deutliche unspezifische Banden bei etwa 55 kDa und 25 kDa, und eine weniger deutliche bei ca.

85 kDa dar. Alle Banden in anderen Spuren, die auf derselben Größe liegen, müssen ebenfalls als unspezifische Reaktionen betrachtet werden.

Im Gegensatz dazu handelt es sich bei den übrigen Banden um spezifische Signale, die tatsächlich durch Interaktion der Antikörper aus der BALF mit den Antigenen des Ganzzelllysates zustande gekommen sind. Vergleicht man die Intensität und die Anzahl dieser Banden in beiden Membranen, so zeigt sich, dass die spezifischen Signale auf Membran B deutlich höher sind. Es liegen also mehr

M.-hyopneumoniae-spezifische IgA-Antikörper als IgG-Antikörper in den BALF-Proben vor. Betrachtet man das spezifische Bandenmuster auf Membran B, fällt auf, dass sich bei allen Tieren etwa bei 40 kDa bzw. 45 kDa zwei dicht beieinanderliegende Banden befinden. Die Intensität dieser Banden unterscheidet sich deutlich zwischen den Tieren. Bei Tier 98 ist direkt oberhalb der beiden genannten eine weitere deutliche Bande sichtbar. Bei 35 kDa zeigt sich bei den Tieren 18, 97 und 169 eine weitere klare Bande. Im Bereich zwischen 100 kDa und 130 kDa liegen bei allen Tieren weitere feine Banden. Auf Membran A sind mehrere feine spezifische Banden zu erkennen. Es lässt sich jedoch kein so uniformes Muster erkennen wie bei Membran B. Eine Bande, die sich konsequent bei allen Tieren darstellt, fehlt.

Abbildung 11: Nachweis M.-hyopneumoniae-spezifischer Antikörper in BALF-Proben.

Ganzzelllysat wurde einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen, erst mit Antikörpern aus der BALF (1:10/15/25) und anschließend mit IgG- (A) oder IgA- (B) spezifischem Sekundärantikörper (1:2.000) inkubiert. In den Kontrollspuren (K) wurde kein Primärantikörper aufgetragen, die Banden stellen unspezifische Bindungen des Sekundärantikörpers dar (Sternchen).

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4.3.4 Quantifizierung spezifischer IgA-Antikörper mittels IDEXX ELISA

Mittels Western Immunoblot konnten zwar M.-hyopneumoniae-spezifische IgA in der BALF nachgewiesen werden, eine nähere Aussage über deren Menge und ein direkter Vergleich unter den Tieren ist damit allerdings nicht möglich. Aus diesem Grund wurde eine Quantifizierung mittels IDEXX M. hyo ELISA durchgeführt. Exemplarisch wurden erst eine Probe eines hyperimmunisierten und zwei Proben eines M.-hyopneumoniae-freien Tieres gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Absorptionswerte des IDEXX M. hyo ELISA mit BALF bei Verwendung eines IgA-spezifischen Sekundärantikörpers.

BALF negativ 1 BALF negativ 2 BALF Hyperimmun

α-Schwein IgA 1:5.000 0,976 1,298 1,066

Die Absorption wurde bei 650 nm gemessen. Die Werte stellen den Mittelwert zweier Replikate dar.

Die Absorptionswerte der beiden negativen BALF-Proben und der positiven BALF-Probe unterscheiden sich nicht. Bei einem negativen Tier ist die Absorption sogar höher als bei Tier 17 aus dem Versuch. Obwohl in der BALF der negativen Tiere keine spezifischen Antikörper enthalten sind, wird ein starkes Signal verursacht. Es kommt zu einer ausgeprägten unspezifischen Bindung mit nicht weiter bestimmten Komponenten in der BALF. Eine Bewertung dieser Ergebnisse ist daher nicht möglich.

Es wurden keine weiteren Proben untersucht.

Um zu überprüfen, ob mit dem IgA-spezifischen Sekundärantikörper auch bei Serumproben ein ähnliches Problem besteht, wurden weitere Versuche durchgeführt, deren Ergebnisse in Tabelle 13 aufgeführt sind. Die Absorptionswerte der Negativkontrolle liegen in allen Verdünnungsstufen über 0,150 und somit sind die Validitätskriterien nicht erfüllt. Die Absorptionswerte der Leerwerte ohne Primärantikörper sind fast identisch dazu. Das Signal wird also vom Sekundärantikörper verursacht, der mit den Antigenen auf der Platte eine deutliche unspezifische Bindung eingeht. Die Absorptionswerte der Messung der Positivkontrolle liegen über denen der Negativkontrolle. Subtrahiert man jedoch die beiden Werte voneinander, wird auch hier das Validitätskriterium PK𝑥𝑥 – NK𝑥𝑥 ≥ 0,150 nicht erfüllt. Für den Test mit IgA-spezifischem Sekundärantikörper stehen also keine Kontrollen zur Verfügung, die den Validitätskriterien entsprechen. Durch die deutliche

unspezifische Reaktion des Sekundärantikörpers mit den Coatingantigenen ist die Messung von M.-hyopneumoniae-spezifischen IgA-Antikörpern im Serum und deren verlässliche Interpretation auf diese Weise nicht möglich. Nur in der niedrigsten Verdünnung hat das Hyperimmunserum einen deutlich höheren Absorptionswert als die Negativkontrolle. Das Validitätskriterium PK𝑥𝑥 – NK𝑥𝑥 ≥ 0,150 wäre somit erfüllt. Die Differenz verkleinert sich aber mit steigender Verdünnung.

Tabelle 13: Absorptionswerte des IDEXX M. hyo ELISA mit Serum bei Verwendung eines IgA-spezifischen Sekundärantikörpers in verschiedenen Verdünnungen.

α-Schwein

Die Absorption wurde bei 650 nm gemessen. Die Werte stellen den Mittelwert zweier Replikate dar. Die Negativkontrolle (NK) und Positivkontrolle (PK) aus dem Kit wurden verwendet. Die Validitätskriterien sind erfüllt, wenn PK𝑥𝑥 – NK𝑥𝑥 ≥ 0,150 und NK𝑥𝑥 ≤ 0,150.