3.3.1 Herkunft und Haltung der Tiere
Da die Hyperimmunseren ausschließlich Antikörper enthalten sollen, die auf Impfung mit einem ausgewählten Antigen zurückzuführen sind, war es entscheidend, dass die Versuchstiere zu Versuchsbeginn weder aktiv noch passiv erworbene M.-hyopneumoniae-spezifische Antikörper im Serum aufwiesen. Die Tiere wurden aus einem Basiszuchtbetrieb zugekauft, der basierend auf Routinediagnostik als klinisch und serologisch M.-hyopneumoniae-unverdächtig eingestuft wird. Des Weiteren führt der Betrieb keine Impfung gegen M. hyopneumoniae durch. Acht männliche Absetzferkel im Alter von acht Wochen und einem Körpergewicht von im Mittel 15 kg wurden mit einem Transporter mit gefilterter Zuluft vom Herkunftsbetrieb zu den Versuchsställen transportiert. Nach der Ankunft wurden die Ferkel randomisiert auf zwei Ställe aufgeteilt und es fand eine 14-tägige Eingewöhnungsphase der Tiere statt.
Die Haltung der Tiere erfolgte auf planbefestigtem Boden mit Stroheinstreu. Das Stroh wurde vor dem Verbringen in den Versuchsstall autoklaviert. Die Fütterung erfolgte restriktiv mit handelsüblichen und altersgerechten Fertigfuttermitteln (Deuka primo pro, Deuka Deutsche Tiernahrung, Emstek, Deutschland). Die Tiere wurden täglich einer verkürzten klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Dabei wurden die Atemfrequenz und der Atemtyp erfasst und die Körperinnentemperatur rektal
gemessen. Zudem wurden Haltung, Verhalten, Hautoberfläche und Futteraufnahme der Tiere beurteilt. Besondere Ereignisse wurden ebenfalls notiert. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz 2013 durchgeführt (Tierversuchsgenehmigungsnummer: 33.8-42502-05-17A195).
Aus demselben Herkunftsbestand wurden zu einem späteren Zeitpunkt zwei weitere männliche Tiere mit einem Körpergewicht von 65 kg zugekauft. Sie dienten als Kontrolltiere. Nach der Ankunft dieser Kontrolltiere fand unverzüglich deren Sektion statt. Es wurden dieselben Proben entnommen, wie bei den übrigen Tieren.
3.3.2 Auswahl der Impfstoffe
Ziel des Versuches war es, Seren mit einem möglichst hohen Antikörpertiter und mit einer möglichst großen Diversität an M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern zu erhalten. Die Auswahl der Impfstoffe erfolgte daher basierend auf unterschiedlichen Bakterienstämmen bzw. unterschiedlichen M.-hyopneumoniae-Isolaten, die in den verschiedenen Impfstoffen als Antigen enthalten sind (s. Tabelle 5). Es wurden vier Impfstoffe mit verschiedenen Antigenen für den Versuch ausgewählt. Darunter waren ein One-Shot-Präparat, bei dem es sich zudem um einen Kombinationsimpfstoff handelt, und drei Two-Shot-Monovakzinen. Die Zuteilung der Tiere in eine der vier Impfstoffgruppen erfolgte randomisiert. Je Impfstoff wurden jeweils zwei Tiere immunisiert.
Tabelle 5: Auflistung der angewendeten Impfstoffe. Informationen laut Herstellerangaben.
Handelsname Stamm Mindestalter Anwendung bei
[Tage]
Zweite Injektion
nach … Wochen
Tier-identifikation
Suvaxyn® M. Hyo P-5722-3 ≥7 2 17, 18
Stellamune® Mycoplasma NL 1042 ≥3 2-4 97, 98
Porcilis® M. Hyo Stamm 11 ≥7 3 128, 129
Porcilis® PCV M. Hyo Stamm J ≥21 - 168, 169
3.3.3 Immunisierungsschema
Die Immunisierung der Tiere erfolgte in Anlehnung an ein bereits für die Herstellung von Hyperimmunseren etabliertes Protokoll aus dem Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus dem Jahre 2003. Der Ablauf der Hyperimmunisierung ist in Abbildung 1 dargestellt. Um die Seronegativität der Tiere zu bestätigen, wurde am Tag der Einstallung (Tag -11) eine Blutprobe entnommen und diese mittels IDEXX M. hyo ELISA auf das Vorhandensein von M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern untersucht. Nach einer mehrtägigen Eingewöhnungsphase erfolgte die erste Immunisierung mit der vom jeweiligen Hersteller angegebenen Impfdosis (ID) an Tag 0. Die erste Boosterinjektion erfolgte an Tag 13 mit doppelter ID. An Tag 20 wurde erst eine Blutprobe zur Kontrolle des Antikörperanstiegs entnommen und anschließend die Injektion mit einfacher ID durchgeführt. Die nächste Injektion erfolgte an Tag 27 ebenfalls mit einfacher ID. An Tag 31 wurde erneut eine Blutprobe entnommen und an Tag 34 erfolgte die abschließende Boosterinjektion mit doppelter ID.
Abbildung 1: Ablauf der Hyperimmunisierung. Immunisierungen an Tag 0, 20 und 27 erfolgten mit einfacher Impfdosis (ID), Immunisierungen an Tag 13 und 34 mit doppelter ID. Blutproben (BP) wurden an Tag -11, 20, 31 und bei der Serumgewinnung entnommen.
3.3.4 Blutprobengewinnung
Die Eingangsblutprobe am Tag der Einstallung der Schweine in den Versuchsstall wurde durch Punktion der Vena (V.) cava cranialis gewonnen. Es wurden 1,20 mm x 40 mm Sterican® Einmal-Injektions-Kanülen (G18, B. Braun Vet Care GmbH, Melsungen, Deutschland) verwendet. Blutproben zu späteren Zeitpunkten wurden durch Punktion der V. jugularis externa gewonnen. Hierfür wurden 1,10 mm x 50 mm Sterican® Einmal-Injektions-Kanülen (G19, B. Braun Vet Care GmbH, Melsungen, Deutschland) verwendet. Je Beprobungstag wurden jeweils 5 ml
Blut (Monovette® Serum, Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Deutschland) entnommen.
Die Proben wurden nach einer Gerinnungszeit von ca. einer Stunde für 15 min bei 2.000 g bei RT zentrifugiert (Centrifuge 5804 R, Eppendorf – Netheler – Hinz GmbH, Hamburg, Deutschland). Das Serum wurde anschließend abgenommen und in sterile Reagiergefäße überführt. Die Proben wurden dann mittels IDEXX ELISA nach Herstellerangaben untersucht und anschließend bei -20 °C gelagert.
3.3.5 Sektion Serumgewinnung
Zur Serumgewinnung wurden die Tiere erst mit 2 mg/kg Körpergewicht i. m. Azaperon (Stresnil® 40 mg/ml, Elanco Tiergesundheit, Bad Homburg) und 15 - 20 mg/kg Körpergewicht i. m. Ketamin (Ketamidor® 100 mg/ml, WDT, Garbsen) in Neuroleptanalgesie verbracht und anschließend mit 80 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital (Euthadorm® 400 mg, CP-Pharma, Burdorf, Deutschland) intravenös euthanasiert. Direkt im Anschluss an die Pentobarbitalinjektion wurde die V. jugularis eröffnet und das Blut der Tiere aufgefangen. Nach einer Gerinnungszeit von mindestens drei Stunden wurde das gewonnene Blut für 20 min bei 3.800 U/min und 20 °C zentrifugiert (Heraeus Multifuge 4 KR, Thermo Electron Corporation, Osterrode, Deutschland). Der Überstand wurde dann in ein neues Gefäß überführt und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Bis zur weiteren Untersuchung wurden die so gewonnenen Seren bei -20 °C gelagert.
Bronchial Tupfer
Die Tupferprobenentnahme erfolgte post mortem an der aus dem Tierkörper entnommenen Lunge. Dazu wurde ein steriler, umhüllter Stutentupfer (ohne Transportmedium, WDT, Garbsen, Deutschland) bis über die Carina tracheae hinweg in die luftleitenden Wege der Lunge vorgeführt und dort ein Schleimhautabstrich durchgeführt.
Der Tupfer wurde in ein steriles Reagiergefäß mit ML Medium überführt und anschließend im diagnostischen Labor am Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover einer mikrobiellen Untersuchung unterzogen.
Bronchoalveoläre Lavage
Die bronchoalveoläre Lavage wurde post mortem im Anschluss an die Tupferprobenentnahme durchgeführt. Hierzu wurden 200 ml warme, sterile, isotonische Kochsalzlösung (Isotonische Natriumchlorid-Lösung ad us. vet., B. Braun Vet Care GmbH, Melsungen) über den Larynx in die Lunge instilliert. Nach kurzem, vorsichtigem Massieren der Lungenlappen wurde die Spülflüssigkeit dann in einem sterilen Falcontube (50 ml, 114 x 28 mm, Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Deutschland) aufgefangen.
Ein Aliquot der BALF-Proben wurde anschließend im diagnostischen Labor am Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover einer mikrobiologischen Untersuchung unterzogen. Die verbleibende BALF wurde 15 min bei 8.000 U/min zentrifugiert (Heraeus Megafuge 16R, Thermo Fisher Scientific, Thermo Electron LED GmbH, Osterrode am Harz, Deutschland) und der Überstand in ein neues steriles Reaktionsgefäß überführt. Die Proben wurden dann bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert.
Lungengewebeproben
Für den Nachweis erregerspezifischer DNA-Sequenzen mittels qPCR wurde eine Gewebeprobe aus der Mitte eines Spitzenlappens der Lunge entnommen. Das Lungengewebe wurde wie unter Punkt 3.2.3 einer DNA-Isolierung unterzogen.
3.3.6 Bestimmung des Gesamtgehaltes an IgG- und IgA-Antikörpern
Der Gesamtgehalt an IgG und IgA im Serum und in der BALF wurde in der AG Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover bestimmt. Es wurde ein Sandwich-ELISA unter Verwendung von Isotyp-spezifischen Antikörpern gegen porzines IgG und IgA durchgeführt.
3.3.7 Bestimmung des Gehaltes an spezifischen IgA mittels IDEXX ELISA Zur Bestimmung des Gehaltes an spezifischen IgA-Antikörpern in der BALF wurde der IDEXX ELISA (IDEXX M. hyo Ab Test, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine) verwendet. Die BALF-Proben wurden unverdünnt gemessen. Abweichend vom
Herstellerprotokoll wurde Ziegen-Anti-Schwein-IgA, HRP konjugiert, (Biomol GmbH, Hamburg, Deutschland) als Isotyp-spezifischer Sekundärantikörper angewendet. Das Konjugat wurde dafür 1:5.000 in PBST verdünnt. Die restlichen Schritte wurden nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Da ausschließlich Kontrollen für Serum vom Hersteller mitgeliefert werden, zwei unterschiedliche Probenarten aber nicht miteinander verglichen werden können, wurde als Vergleichswert BALF von zwei ungeimpften und M.-hyopneumoniae-freien Tieren untersucht.
Um den Gehalt an spezifischen IgA-Antikörpern im Serum zu bestimmen, wurde der IgA-spezifische Sekundärantikörper in den Verdünnungen 1:4.000, 1:8.000 und 1:16.000 eingesetzt. Die restlichen Schritte wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Absorption (A) wurde bei 650 nm gemessen (SpectraMax® i3x, Molecular Devices, Biberach an der Riß, Deutschland). Für die Auswertung wurde zuerst A(650) der Negativkontrolle (NK) von A(650) der Probe (P) und von A(650) der Positivkontrolle (PK) abgezogen. Das Ergebnis wurde dann, wie vom Hersteller beschrieben, als Verhältnis von P zu PK (P/PK Wert) angegeben. P/PK Werte kleiner als 0,30 werden dabei als negativ und Werte größer als 0,40 positiv gewertet. Proben die zwischen diesen Werten liegen, gelten als fraglich.
3.3.8 Messung der Harnstoffkonzentration
Die Harnstoffkonzentration in den finalen Hyperimmunseren (BP 3) und den BALF-Proben wurde mit Hilfe des Cobas Mira Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) im klinischen Labor der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover gemessen.
3.4 Proteinchemische Methoden
3.4.1 Messung der Proteinkonzentration
Die Bestimmung der Proteinkonzentration im Serum und in der BALF wurde mit dem MicroBC Assay (Protein Quantitation Kit, Interchim, Montluçon, Frankreich) nach Herstellerprotokoll durchgeführt.
3.4.2 SDS-PAGE
Bei der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) werden Proteine im elektrischen Feld der Größe nach aufgetrennt. Für alle Untersuchungen wurden 10,8% Acrylamidgele verwendet. Die Proteine wurden in zweifach reduzierendem SDS-Spaltpuffer verdünnt und für 5 min bei 100 °C denaturiert. In diesem Schritt werden die Proteine in ihre Primärstruktur überführt und können so der Größe entsprechend aufgetrennt werden. Je nachdem, welche Methode im Anschluss an die SDS-PAGE durchgeführt werden sollte, wurden unterschiedliche Mengen an Protein bzw. unterschiedliche Volumina einer Probenverdünnung auf einen Slot des Gels aufgetragen (s. Tabelle 6). Die Elektrophorese erfolgte in BioRad Mini-PROTEAN® II (BioRad Inc., München, Deutschland) Gelkammern bei einer Spannung von 300 V und einer Stromstärke von 15 mA pro Gel in den ersten 10 min, gefolgt von 25 mA pro Gel für 60 min. Hierfür wurde als Spannungsquelle ein BioRad PowerPac™
Basic (BioRad Inc., München, Deutschland) verwendet. Die Gesamtdauer der Elektrophorese betrug 70 min.
Tabelle 6: Proteinart und Proteinmenge, die abhängig von der jeweiligen Verwendung eines Gels in der SDS-PAGE pro Slot eingesetzt wurde.
Verwendung des Gels Menge und Art des eingesetzten Proteins pro Slot Proteinfärbung Je 10 µl Serum in einer 1:50 Verdünnung in
SDS-Spaltpuffer oder
je 25 µl BALF in einer 1:2 Verdünnung in SDS-Spaltpuffer
Western Immunoblot zum Nachweis von IgG oder IgA Antikörpern
Je 10 µl Serum in einer 1:50 Verdünnung in SDS-Spaltpuffer oder
je 4,5 µg BALF-Protein, verdünnt in SDS-Spaltpuffer Western Immunoblot zum
Nachweis
M.-hyopneumoniae-spezifischer Antikörper
Je 20 µg M.-hyopneumoniae-Ganzzellysat, verdünnt in SDS-Spaltpuffer
3.4.3 Proteinfärbung von SDS-Gelen
Um die Größenverteilung und die Menge der Proteine nach der SDS-PAGE beurteilen zu können, müssen diese erst angefärbt werden. Dies erfolgte mit dem Farbstoff Coomassie™ Brillantblau (Brillant Blau R 250, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland), der starke Komplexe mit Proteinen bildet, die den Farbstoff blau
erscheinen lassen. Die Gele wurden dafür für mindestens eine Stunde in Coomassie-Färbelösung inkubiert und anschließend wieder entfärbt, bis das Gel klar und die Banden deutlich sichtbar waren.
3.4.4 Western Immunoblot
Nachweis M.-hyopneumoniae-spezifischer IgG- und IgA-Antikörper
Für den Nachweis spezifischer Antikörper erfolgte im Anschluss an die SDS-PAGE der M.-hyopneumoniae-Proteine aus dem Ganzzelllysat deren sogenanntes Blotten.
Dabei wurden die Proteine vom Gel auf eine Nitrocellulose-Membran (Roti®-NC, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) übertragen. Dieser Schritt erfolgte ebenfalls mit dem BioRad System für 30 min bei einer konstanten Spannung von 50 V und maximaler Stromstärke. Danach wurde die Membran bis zum übernächsten Tag bei 4 °C in Milchpulver-Blockingpuffer (5% handelsübliches Magermilchpulver in TBST) geblockt. Nach dem Blocken wurde die Membran in Streifen geschnitten, um die einzelnen Spuren mit dem entsprechenden Primärantikörper inkubieren zu können.
Für den Nachweis von M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern in den Seren wurden die Seren in einer Verdünnung von 1:250 als Primärantikörper eingesetzt. Um M.-hyopneumoniae-spezifische Antikörper in den BALF-Proben nachzuweisen, wurden als Primärantikörper die BALF-Proben der Tiere 97 und 128 mit dem geringsten Proteingehalt in einer Verdünnung von 1:10 angewandt. Die restlichen Proben wurden im Verhältnis zu diesem Proteingehalt verdünnt, also 1:15 bei der BALF von Tier 98 und 1:25 bei der BALF der Tiere 17, 18, 168 und 169. Auf diese Weise wurde für den primären Inkubationsschritt von allen BALF-Proben dieselbe Menge an Protein eingesetzt. Sowohl für den Nachweis spezifischer Antikörper in den Seren, als auch in den BALF-Proben wurde außerdem eine Kontrolle miteingeschlossen, bei der die Inkubation mit Primärantikörper übersprungen wurde.
Die Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte für eine Stunde bei RT auf dem Schüttelapparat (3011, GFL GmbH, Burgwedel, Deutschland) bei 30 U/min. Danach wurden die Membranstreifen dreimal für 5 min in PBST gewaschen, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen. Dann erfolgte die Inkubation mit dem Isotyp-spezifischen, enzymgekoppelten Sekundärantikörper. Für den Nachweis von IgA wurde Ziegen-Anti-Schwein-IgA, AP konjugiert (Biomol GmbH, Hamburg, Deutschland) und für den Nachweis von IgG Ziegen-Anti-Schwein-IgG, AP konjugiert
(DIANOVA GmbH, Hamburg, Deutschland) verwendet. Die Sekundärantikörper wurden 1:2.000 in Blockingpuffer verdünnt und die Streifen darin wieder für eine Stunde bei RT auf dem Schüttler bei 30 U/min inkubiert. Anschließend erfolgten erneut zwei Waschschritte für 5 min in PBST und ein weiterer für 5 min in Substratpuffer für alkalische Phosphatase, pH 9,5. Danach wurden die Membranen entwickelt. Hierfür wurden 10 ml Substratpuffer mit je 100 µl der Substrate BCIP (Carl Roth GmbH & Co.
KG, Karlsruhe, Deutschland) und NBT (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) versehen und dann auf die Membran getropft. Nach 6 min Entwicklungszeit wurde die enzymatische Reaktion unter fließendem Leitungswasser gestoppt.
Nachweis von IgG- und IgA-Antikörpern
Um IgG und IgA nachzuweisen, wurden die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Serum- oder BALF-Proteine wie oben beschrieben auf eine Membran geblottet und anschließend geblockt. Der Inkubationsschritt mit dem Primärantikörper wurde übersprungen und die Membranen entweder mit 1:2.000 verdünntem, AP konjugiertem Ziegen-Anti-Schwein-IgG oder Ziegen-Anti-Schwein-IgA Isotyp-spezifischen Sekundärantikörpern unter denselben Bedingungen wie zuvor beschrieben inkubiert und entwickelt.
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