Um spezifische DNA-Sequenzen von M. hyopneumoniae, M. hyorhinis und M. flocculare in unterschiedlichen Probenmaterialien nachweisen zu können, wurden vier qPCR-Assays etabliert. Hierzu zählen unter anderem zwei M.-hyopneumoniae-speziesspezifische qPCR-Assays basierend auf den single-copy-Genen I-141 (DUBOSSON et al. 2004) und Mhp165 (STRAIT et al. 2008). Bei Ersterem handelt es sich um ein DNA-Fragment, das einen vermuteten ABC-Transporter kodiert, bei Letzterem wurde die Funktion noch nicht abschließend geklärt. Die Sequenzen beider Gene wurden bereits als spezifisch und innerhalb der Spezies M. hyopneumoniae gut konserviert beschrieben (ABIVEN et al. 1992, STRAIT et al. 2008). Der qPCR Assay zur Detektion von M.-hyorhinis-spezifischen DNA-Sequenzen beruht für M. hyorhinis auf Gen p37, das ein Membranlipoprotein kodiert und für den Nachweis M. flocculare-spezifischer DNA-Sequenzen auf Gen fruA, welches die Komponente eines Fructosetransporters kodiert. Bei beiden Genen handelt es sich ebenfalls um single-copy-Gene, die als speziesspezifisch und gut innerhalb der Spezies konserviert beschrieben wurden (FOUROUR et al. 2018).
3.2.1 Ligation spezifischer DNA-Sequenzen in Plasmide von E. coli
Im ersten Schritt wurden die betreffenden Genabschnitte aus chromosomaler DNA, die bereits in extrahierter Form vorlag, mittels konventioneller singleplex PCR amplifiziert. Die dafür verwendeten Primer sind in Tabelle 3 dargestellt. Es wurde ein
HotStarTag® Plus DNA Polymerase Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) verwendet. Bei einem finalen Volumen von 25 µl wurden 5 µl chromosomale DNA, 2,5 µl je Primer (5 pmol/µl), 0,5 µl dNTPs (je 10 mM pro Nucleosid), 2,5 µl 10xPCR-Puffer, 0,1 µl HotStarTag® Polymerase und 11,9 µl RNase freies Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) eingesetzt. Die PCR wurde unter den in Tabelle 2 aufgeführten Bedingungen mit einem BiometraTOne 96G Cycler (Analytik Jena AG, Göttingen, Deutschland) durchgeführt. Die entstandenen PCR-Produkte wurden mit dem pGEM®-T Vector System (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) in den Vektor pGEM®-T kloniert und die Ligationsprodukte anschließend in E. coli DH5α transformiert. Nach kultureller Anzucht und Ernte wurden diese E. coli dann unter Verwendung des NucleoBond® Nucleic Acid and Protein Purification Kits (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland) einer Plasmidextraktion unterzogen.
Um zu überprüfen, ob die PCR-Produkte fehlerfrei und vollständig in die Plasmide ligiert wurden, wurden die extrahierten Plasmide einer Sequenzierung (Microsynth Seqlab, Göttingen, Deutschland) unterzogen. Die Auswertung der Sequenzierung erfolgte mit CloneManager 9 Software (Scientific & Educational Software, Denver, USA). Dazu wurden mit Hilfe der Software erst eine Ligation mit Vektor pGEM®-T und dem entsprechenden PCR-Fragment durchgeführt und hierdurch virtuelle Plasmide konstruiert. Die Basenabfolge dieser Plasmide, die das PCR-Fragment korrekt enthalten, wurde dann abgeglichen mit dem sequenzierten Bereich der tatsächlich konstruierten Plasmide. Bei fehlerfreier Sequenz waren diese für die Etablierung der Standardkurve geeignet.
Tabelle 2: Bedingungen für die Durchführung der singleplex PCR.
Schritt Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklen
Denaturierung 95 15 1
Denaturierung 94 1
30
Primerhybridisierung 54 1
Polymerisation 72 2
72 10 1
8 ∞
Tabelle 3: Gene und korrespondierende Primerpaare für die Amplifikation der speziesspezifischen Sequenzen von M. hyopneumoniae (Mhp), M. hyorhinis (Mhr), M. flocculare (Mfloc).
Gen Funktion Beschrieben
von Primer und Sequenzen der Oligonukleotide Mhp I-141 ABC
Transporter Dubosson et
al. 2004 MHABCTM-L (5'-GATATGGGAAACATTGTTCTTGGTT-3') MHABCTM-R2 (5'-GTTCAGTCAAATTTTTCTTTTCCAAA-3') Mhp165 Unbekannt Strait et al.
2008 Mhp165 F (5'-TGCCCAGGATATTTCCGATCCAGA-3') Mhp165 R (5'-AGACCTGAAGAACGTGCATGGAGA-3') Mhr p37 Membran
Lipoprotein Fourour et al.
2018 F_Mhr_p37 (5'-TTCTATTTTCATCTATATTTTCGC-3') R_Mhr_p37 (5'-TCATTGACCTTGACTAACTG-3') Mfloc fruA
Fructose-transporter Fourour et al.
2018 F_Mfloc_fruA (5'-TTAGCAGTTCCAATTTTATCAG-3') R_Mfloc_fruA (5'-AAACCATAGGTATCTTTAAGTTG-3')
3.2.2 Etablierung einer Standardkurve
Zur Etablierung der Standardkurve wurde die DNA-Konzentration der Plasmidlösungen photometrisch bestimmt (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, USA) und eine Verdünnung mit einer Konzentration von 40 ng/µl hergestellt. Davon ausgehend erfolgte das Anlegen einer Verdünnungsreihe von 10-1 bis 10-10. Die Verdünnungen wurden im Doppelansatz untersucht und es wurden drei Replikate erstellt. Bei einem finalen Volumen von 20 µl wurden dabei 2,5 μl DNA-Templat (hier die Verdünnungen), 0,8 μl je Primer (5 pmol/µl), 10 µl SYBR Green (Qiagen, Hilden, Deutschland) und 5,9 μl RNase freies Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) je Ansatz eingesetzt. Die Amplifikation wurde mit einem Mx3005P qPCR System (Stratagene, Agilent Technologies, LaJolla, USA) unter den
in Tabelle 4 aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Die Daten wurden mit MxPro Software analysiert. Dafür wurde mit der unten aufgeführten Formel (WHELAN et al.
2003) berechnet, wie vielen Genomkopien des Erregers die DNA-Konzentration der jeweiligen Verdünnungen entspricht.
Für jede Verdünnungsstufe wurde so die Anzahl an Genomkopien in 2,5 µl DNA-Template ermittelt und diese im MxPro Plate setup als Standard quantity angegeben. Die Standard units wurden dabei als copies festgelegt. Auf diese Weise kann einem Schwellenwert-Zyklus (Ct)-Wert direkt die Anzahl an detektierten Genomkopien des Erregers zugeordnet werden. Das Detektionslimit eines Assays wurde definiert als die letzte Verdünnungsstufe, in der in allen Experimenten noch ein Ct-Wert ermittelt werden konnte.
Tabelle 4: Bedingungen für die Durchführung der qPCR bei der Etablierung der Standardkurve.
Schritt Temperatur [°C] Zeit [min:sek] Zyklen
Denaturierung 95 20:00 1
Denaturierung 95 01:00
40
Primerhybridisierung 55 01:00
Polymerisation 72 00:40
95 01:00 1
55 00:30 1
95 00:30 1
3.2.3 DNA-Isolierung aus Probenmaterial
Um aus Lungengewebe DNA für die qPCR zu isolieren, wurde das DNeasy Blood &
Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben verwendet. Es wurden etwa 25 mg Gewebe von jeder Probe eingesetzt. Im letzten Schritt wurde die
Genomkopien = 6,022x1023 [mol-1] x DNA-Gehalt [g]
DNA Länge [bp] x 660 [g/mol/bp]
DNA mit 200 µl RNase freiem Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) gelöst und bis zur weiteren Untersuchung bei -20 °C gelagert.
Für die Isolierung von DNA aus Kulturmaterial wurde ein Protokoll von Wise et al. 2013 (mündliche Mitteilung), das speziell für die Wachstumsmessung von Mykoplasmen in Suspensionskulturen konzipiert ist, verwendet. Es wurden 500 µl Kultur entnommen und in ein vorgekühltes Reagiergefäß mit aufgeprägter 100 µl Grenze (1,5 ml Eppendorf Tubes® 3810X, Eppendorf Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) überführt. Dann wurden die Proben langsam mit 400 µl 0,5 M Saccharoselösung unterlegt. Diese Saccharoselösung ist hyperton und dichter als die Kultur. Auf Grund dessen bildet sich ein Kissen mit klarer Grenze zur oberen Phase, die die Kultur enthält. Nun wurden die Proben für 10 min bei 13.000 U/min zentrifugiert (Centrifuge 5424, Eppendorf Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland).
Das Kissen gewährleistet dabei, dass stark mit dem Fluoreszenzfarbstoff interferierende Bestandteile in der oberen Phase zurückgehalten und nur die viel kleineren Mykoplasmen durch das Saccharosekissen zentrifugiert werden. Das dabei entstehende Bakterienpellet kann intakt weiterverwenden werden. Im nächsten Schritt wurde mit Hilfe einer Vakuumpumpe (Laboport®, KNF Neuberger, Trenton, USA) die Flüssigkeit bis zur 100 µl Grenze und auch alle am Rand verbliebenen Resttropfen abgesaugt. Die übrigen 100 µl stellen nur noch das restliche Saccharosekissen und das Pellet dar. Die Pellets wurden dann entweder direkt weiterverarbeitet oder bis zum Gebrauch bei -20 °C gelagert.
Den auf Raumtemperatur (RT) gebrachten Proben wurde im nächsten Schritt 50 µl 0,3% Natriumdodecylsulfat (SDS) zugegeben und das Pellet vollständig resuspendiert. Dabei ergibt sich eine finale SDS-Konzentration von 0,1%, welche erforderlich ist, um vorhandene Zellmembranen vollständig zu lösen. Dadurch wird die DNA freigesetzt und für den Fluoreszenzfarbstoff bzw. die Polymerase zugänglich gemacht. Anschließend wurden 1,35 ml TE Puffer hinzugefügt und durch mehrmaliges Invertieren vermischt, ohne dabei Luftblasen entstehen zu lassen. Dieser Schritt reduziert die SDS-Konzentration auf 0,01% reduziert, sodass das SDS und die Saccharose nicht mehr mit dem Fluoreszenzfarbstoff interferieren.
Um Antigen-DNA aus den verwendeten Impfstoffen zu isolieren, wurde ebenfalls das von Wise et al. 2013 beschriebene Protokoll angewandt. Dabei wurden jeweils 1 ml Impfstoff verwendet.
3.2.4 Untersuchung von Probenmaterial mittels qPCR
Im Anschluss an die DNA-Isolierung wurden die Proben im Doppelansatz, wie unter Punkt 3.2.2 beschrieben, mittels qPCR auf das Vorhandensein erregerspezifischer DNA-Sequenzen untersucht. Bei jeder Amplifikation wurden neben den unbekannten Proben auch die Standardverdünnungen mit bekannter Anzahl an Genomkopien und ein Ansatz ohne DNA-Template als Negativkontrolle untersucht. Die Daten der qPCR wurden mit MxPro Software unter Berücksichtigung der Standard- und Dissoziationskurven analysiert und beurteilt. Proben, bei denen Ct-Werte gemessen wurden, die durch ein unspezifisches Signal entstanden und für die die Anzahl an Genomkopien mit einem Wert unter null ermittelt wurde, wurden als negativ gewertet.
Die Daten wurden zur weiteren Datenanalyse in Microsoft Office Excel 2016 exportiert (Microsoft Corporation, Redmond, USA).