Neben M. hyopneumoniae werden in der Lunge erkrankter und gesunder Schweine auch M. hyorhinis und M. flocculare nachgewiesen (FRIIS 1975, MAES et al. 1996, LUEHRS et al. 2017). Die Rolle dieser beiden Erreger an der Entstehung und dem Schweregrad von Lungenläsionen und der damit in Verbindung stehenden klinischen Symptome wird in der Literatur kontrovers diskutiert. In einer Studie wurden Lungen von Schweinen aus Betrieben in Deutschland und der Schweiz, bei denen respiratorische Symptome in der Endmast gegenwärtig waren, untersucht (LUEHRS et al. 2017). Dabei konnte in den deutschen Beständen aus 7,3% der Lungen M. hyorhinis, aus 11,5% M. flocculare und aus 40% M. hyopneumoniae isoliert werden. In den schweizer Bestanden lagen die Werte für M. hyorhinis bei 7,0%, für M. flocculare bei 31,5% und für M. hyopneumoniae bei 0%, sodass diese Bestände als Kontrollgruppe gewertet wurden. Der Abgleich dieser Ergebnisse mit den vorliegenden Lungenläsionen lieferte keinen Hinweis darauf, dass M. hyorhinis allein dazu in der Lage ist, Lungenveränderungen hervorzurufen, wie man sie bei einer Infektion mit M. hyopneumoniae beobachtet. Zudem konnte keine Verschlimmerung der makroskopischen Gewebeläsionen festgestellt werden, wenn eine Koinfektion von M. hyopneumoniae und M. hyorhinis nachgewiesen wurde. Zu anderen Ergebnissen kam eine Studie aus Frankreich, in der mittels qPCR in 3,4% der Lungen M. hyorhinis, in 34,7% M. flocculare und in 59,5% M. hyopneumoniae nachgewiesen wurde (FOUROUR et al. 2018). Hier war der Nachweis einer Koinfektion von M. hyorhinis und M. hyopneumoniae signifikant mit dem Vorliegen schwerer Lungenläsionen korreliert, sodass M. hyorhinis eine Beteiligung bei der Entstehung der Lungenläsionen zugesprochen wurde. Bei einem experimentellen Koinfektionsversuch konnte hingegen, in Übereinstimmung mit der Studie von Luehrs et al., keine Verschlimmerung der Lungenläsionen festgestellt werden (FOUROUR et al. 2019).
Der Erreger M. flocculare ist zwar in der Lage, an Zilien zu adhärieren, ruft an diesen
aber keine pathologischen Veränderungen hervor (YOUNG et al. 2000). In einem Infektionsversuch mit M. flocculare oder M. hyorhinis konnten in der durchgeführten pathomorphologischen Untersuchung der Lungen im Rahmen einer Sektion bei keinem der Tiere makroskopische Lungenveränderungen festgestellt werden (GOMES NETO et al. 2014).
3 Material und Methoden 3.1 Mikrobiologische Methoden
3.1.1 Kulturelle Anzucht
Die kulturelle Anzucht von M. hyopneumoniae erfolgte in Friis Medium (FRIIS 1975) oder in ML Medium (Mycoplasma Liquid Medium, Mycoplasma Experience Ltd, Bletchingley, England). Es wurde Schweineserum verwendet, das nach Untersuchung mittels IDEXX M. hyo ELISA (IDEXX M. hyo Ab Test, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine) als frei von M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern beurteilt wurde.
Sowohl im verwendeten Pferde- als auch Schweineserum wurden die Komplementfaktoren für 30 min bei 55 °C im Wasserbad inaktiviert. Das Medium wurde stets im Verhältnis 1:10 beimpft und die Kulturen dann je nach Verwendungszweck für 48 Stunden bis zehn Tage bei 37 °C bebrütet. Von jeder Kultur wurde am Ende der Inkubationszeit zur Kontaminationskontrolle ein Ausstrich auf Blutagar (COLSB, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland) angefertigt und für 24 Stunden bei 37 °C bzw. für 96 Stunden bei 29 °C bebrütet.
3.1.2 Ernte der Bakterien
Die Ernte der Bakterien erfolgte für 30 min bei 4 °C und 10.000 Umdrehungen pro Minute (U/min) (RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge, Sorvall® Instruments).
Der Überstand wurde verworfen und die am Boden befindlichen Bakterienpellets in insgesamt 50 ml PBS resuspendiert. Im nächsten Schritt wurde diese Suspension in ein steriles Falcontube (50 ml, 114 x 28 mm, Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Deutschland) überführt und erneut für 20 min bei 4 °C und 10.000 U/min zentrifugiert (Heraeus Megafuge 16R, Thermo Fisher Scientific, Thermo Electron LED GmbH, Osterrode am Harz, Deutschland). Wie zuvor wurde der Überstand verworfen und das verbliebene Bakterienpellet entweder direkt weiterverarbeitet oder bis zum weiteren Gebrauch bei -20 °C gelagert.
3.1.3 Herstellung von Ganzzelllysaten
Zum Herauslösen und Isolieren der Proteine aus Zelle und Zellmembran wurden 10 ml PBS mit einem Proteaseinhibitor (Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) versetzt und auf Eis vorgekühlt. Der Inhibitor verhindert dabei den enzymatischen Abbau der Proteine, der dazu führen kann, dass die korrespondierenden Antikörper nicht mehr an diese Antigene binden und folglich falsch-negative Resultate produziert werden. Die ebenfalls bei 4 °C gekühlten Bakterienpellets wurden in 500 µl des Inhibitor-Mixes resuspendiert und die Suspension dann in ein steriles 1,5 ml Reagiergefäß (Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Deutschland) überführt. Danach wurden im Ultraschallbad (Branson Sonifier 450, BRANSON Ultrasonics Corporation, Danbury, USA) bei 4 °C in drei konstanten Zyklen von 3 min die Zellmembranen aufgeschlossen. Zwischen jedem Zyklus wurden die Proben für kurze Zeit auf Eis gelagert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 20 min bei 4 °C und 13.000 U/min (Heraeus Megafuge 16R, Thermo Fisher Scientific, Thermo Electron LED GmbH, Osterrode am Harz, Deutschland). Der Überstand mit den gelösten Proteinen wurde in ein steriles 1,5 ml Reagiergefäß überführt. Abschließend erfolgte eine Proteinbestimmung mit dem MicroBC Assay (Protein Quantitation Kit, Interchim, Montluçon, Frankreich) und Aliquots wurden bei -20 °C, das restliche Ganzzelllysat bei -80 °C gelagert.
3.1.4 Wachstumshemmtest
Als Ausgangsmaterial für die Wachstumshemmungstests wurden 20 ml ML Medium mit M.-hyopneumoniae-Stamm 232 beimpft und bebrütet, bis der Indikator sich orange färbte. Die Kultur wurde dann aliquotiert und bei -20 °C eingefroren, sodass für unterschiedliche Replikate immer dasselbe Startmaterial verwendet werden konnte.
Die im Startmaterial enthaltene Anzahl an Genomkopien wurde mittels qPCR bestimmt. Für Wachstumsexperimente mit Serum wurde ML Medium entweder mit 10% inaktiviertem Hyperimmunserum oder Serum von M.-hyopneumoniae-freien und nicht geimpften Tieren ergänzt. Für die Versuche mit BALF wurde dem ML Medium 10% BALF eines hyperimmunisierten bzw. 10% BALF eines M.-hyopneumoniae-freien und nicht geimpften Schweines zugesetzt. Danach wurde das Medium sterilfiltriert.
Im Versuch wurden jeweils 2 ml Medium im Verhältnis 1:1.000 mit der oben beschriebenen Vorkultur beimpft. Als Positivkontrolle diente ML Medium ohne weitere Zusätze, welches unter denselben Bedingungen inokuliert wurde. Unverzüglich nach dem Animpfen und erneut nach 62 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C wurden jeweils 500 µl Kultur in ein vorgekühltes Reagiergefäß überführt und direkt auf Eis gestellt.
Anschließend wurde die DNA-Isolierung wie unter Punkt 3.2.3 beschrieben durchgeführt und die Anzahl an Zelläquivalenten mittels qPCR wie unter Punkt 3.2.2 ermittelt. Es wurden jeweils drei biologische Replikate erstellt. Die Daten der qPCR wurden mit MxPro Software analysiert und exportiert in Microsoft Office Excel 2016 (Microsoft Corporation, Redmond, USA). Die statistische Auswertung erfolgte mit GraphPad Prism Version 8.0.1 (GraphPad, San Diego, CA, USA).
3.2 Molekularbiologische Methoden
Um spezifische DNA-Sequenzen von M. hyopneumoniae, M. hyorhinis und M. flocculare in unterschiedlichen Probenmaterialien nachweisen zu können, wurden vier qPCR-Assays etabliert. Hierzu zählen unter anderem zwei M.-hyopneumoniae-speziesspezifische qPCR-Assays basierend auf den single-copy-Genen I-141 (DUBOSSON et al. 2004) und Mhp165 (STRAIT et al. 2008). Bei Ersterem handelt es sich um ein DNA-Fragment, das einen vermuteten ABC-Transporter kodiert, bei Letzterem wurde die Funktion noch nicht abschließend geklärt. Die Sequenzen beider Gene wurden bereits als spezifisch und innerhalb der Spezies M. hyopneumoniae gut konserviert beschrieben (ABIVEN et al. 1992, STRAIT et al. 2008). Der qPCR Assay zur Detektion von M.-hyorhinis-spezifischen DNA-Sequenzen beruht für M. hyorhinis auf Gen p37, das ein Membranlipoprotein kodiert und für den Nachweis M. flocculare-spezifischer DNA-Sequenzen auf Gen fruA, welches die Komponente eines Fructosetransporters kodiert. Bei beiden Genen handelt es sich ebenfalls um single-copy-Gene, die als speziesspezifisch und gut innerhalb der Spezies konserviert beschrieben wurden (FOUROUR et al. 2018).
3.2.1 Ligation spezifischer DNA-Sequenzen in Plasmide von E. coli
Im ersten Schritt wurden die betreffenden Genabschnitte aus chromosomaler DNA, die bereits in extrahierter Form vorlag, mittels konventioneller singleplex PCR amplifiziert. Die dafür verwendeten Primer sind in Tabelle 3 dargestellt. Es wurde ein
HotStarTag® Plus DNA Polymerase Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) verwendet. Bei einem finalen Volumen von 25 µl wurden 5 µl chromosomale DNA, 2,5 µl je Primer (5 pmol/µl), 0,5 µl dNTPs (je 10 mM pro Nucleosid), 2,5 µl 10xPCR-Puffer, 0,1 µl HotStarTag® Polymerase und 11,9 µl RNase freies Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) eingesetzt. Die PCR wurde unter den in Tabelle 2 aufgeführten Bedingungen mit einem BiometraTOne 96G Cycler (Analytik Jena AG, Göttingen, Deutschland) durchgeführt. Die entstandenen PCR-Produkte wurden mit dem pGEM®-T Vector System (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) in den Vektor pGEM®-T kloniert und die Ligationsprodukte anschließend in E. coli DH5α transformiert. Nach kultureller Anzucht und Ernte wurden diese E. coli dann unter Verwendung des NucleoBond® Nucleic Acid and Protein Purification Kits (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland) einer Plasmidextraktion unterzogen.
Um zu überprüfen, ob die PCR-Produkte fehlerfrei und vollständig in die Plasmide ligiert wurden, wurden die extrahierten Plasmide einer Sequenzierung (Microsynth Seqlab, Göttingen, Deutschland) unterzogen. Die Auswertung der Sequenzierung erfolgte mit CloneManager 9 Software (Scientific & Educational Software, Denver, USA). Dazu wurden mit Hilfe der Software erst eine Ligation mit Vektor pGEM®-T und dem entsprechenden PCR-Fragment durchgeführt und hierdurch virtuelle Plasmide konstruiert. Die Basenabfolge dieser Plasmide, die das PCR-Fragment korrekt enthalten, wurde dann abgeglichen mit dem sequenzierten Bereich der tatsächlich konstruierten Plasmide. Bei fehlerfreier Sequenz waren diese für die Etablierung der Standardkurve geeignet.
Tabelle 2: Bedingungen für die Durchführung der singleplex PCR.
Schritt Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklen
Denaturierung 95 15 1
Denaturierung 94 1
30
Primerhybridisierung 54 1
Polymerisation 72 2
72 10 1
8 ∞
Tabelle 3: Gene und korrespondierende Primerpaare für die Amplifikation der speziesspezifischen Sequenzen von M. hyopneumoniae (Mhp), M. hyorhinis (Mhr), M. flocculare (Mfloc).
Gen Funktion Beschrieben
von Primer und Sequenzen der Oligonukleotide Mhp I-141 ABC
Transporter Dubosson et
al. 2004 MHABCTM-L (5'-GATATGGGAAACATTGTTCTTGGTT-3') MHABCTM-R2 (5'-GTTCAGTCAAATTTTTCTTTTCCAAA-3') Mhp165 Unbekannt Strait et al.
2008 Mhp165 F (5'-TGCCCAGGATATTTCCGATCCAGA-3') Mhp165 R (5'-AGACCTGAAGAACGTGCATGGAGA-3') Mhr p37 Membran
Lipoprotein Fourour et al.
2018 F_Mhr_p37 (5'-TTCTATTTTCATCTATATTTTCGC-3') R_Mhr_p37 (5'-TCATTGACCTTGACTAACTG-3') Mfloc fruA
Fructose-transporter Fourour et al.
2018 F_Mfloc_fruA (5'-TTAGCAGTTCCAATTTTATCAG-3') R_Mfloc_fruA (5'-AAACCATAGGTATCTTTAAGTTG-3')
3.2.2 Etablierung einer Standardkurve
Zur Etablierung der Standardkurve wurde die DNA-Konzentration der Plasmidlösungen photometrisch bestimmt (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, USA) und eine Verdünnung mit einer Konzentration von 40 ng/µl hergestellt. Davon ausgehend erfolgte das Anlegen einer Verdünnungsreihe von 10-1 bis 10-10. Die Verdünnungen wurden im Doppelansatz untersucht und es wurden drei Replikate erstellt. Bei einem finalen Volumen von 20 µl wurden dabei 2,5 μl DNA-Templat (hier die Verdünnungen), 0,8 μl je Primer (5 pmol/µl), 10 µl SYBR Green (Qiagen, Hilden, Deutschland) und 5,9 μl RNase freies Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) je Ansatz eingesetzt. Die Amplifikation wurde mit einem Mx3005P qPCR System (Stratagene, Agilent Technologies, LaJolla, USA) unter den
in Tabelle 4 aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Die Daten wurden mit MxPro Software analysiert. Dafür wurde mit der unten aufgeführten Formel (WHELAN et al.
2003) berechnet, wie vielen Genomkopien des Erregers die DNA-Konzentration der jeweiligen Verdünnungen entspricht.
Für jede Verdünnungsstufe wurde so die Anzahl an Genomkopien in 2,5 µl DNA-Template ermittelt und diese im MxPro Plate setup als Standard quantity angegeben. Die Standard units wurden dabei als copies festgelegt. Auf diese Weise kann einem Schwellenwert-Zyklus (Ct)-Wert direkt die Anzahl an detektierten Genomkopien des Erregers zugeordnet werden. Das Detektionslimit eines Assays wurde definiert als die letzte Verdünnungsstufe, in der in allen Experimenten noch ein Ct-Wert ermittelt werden konnte.
Tabelle 4: Bedingungen für die Durchführung der qPCR bei der Etablierung der Standardkurve.
Schritt Temperatur [°C] Zeit [min:sek] Zyklen
Denaturierung 95 20:00 1
Denaturierung 95 01:00
40
Primerhybridisierung 55 01:00
Polymerisation 72 00:40
95 01:00 1
55 00:30 1
95 00:30 1
3.2.3 DNA-Isolierung aus Probenmaterial
Um aus Lungengewebe DNA für die qPCR zu isolieren, wurde das DNeasy Blood &
Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben verwendet. Es wurden etwa 25 mg Gewebe von jeder Probe eingesetzt. Im letzten Schritt wurde die
Genomkopien = 6,022x1023 [mol-1] x DNA-Gehalt [g]
DNA Länge [bp] x 660 [g/mol/bp]
DNA mit 200 µl RNase freiem Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) gelöst und bis zur weiteren Untersuchung bei -20 °C gelagert.
Für die Isolierung von DNA aus Kulturmaterial wurde ein Protokoll von Wise et al. 2013 (mündliche Mitteilung), das speziell für die Wachstumsmessung von Mykoplasmen in Suspensionskulturen konzipiert ist, verwendet. Es wurden 500 µl Kultur entnommen und in ein vorgekühltes Reagiergefäß mit aufgeprägter 100 µl Grenze (1,5 ml Eppendorf Tubes® 3810X, Eppendorf Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) überführt. Dann wurden die Proben langsam mit 400 µl 0,5 M Saccharoselösung unterlegt. Diese Saccharoselösung ist hyperton und dichter als die Kultur. Auf Grund dessen bildet sich ein Kissen mit klarer Grenze zur oberen Phase, die die Kultur enthält. Nun wurden die Proben für 10 min bei 13.000 U/min zentrifugiert (Centrifuge 5424, Eppendorf Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland).
Das Kissen gewährleistet dabei, dass stark mit dem Fluoreszenzfarbstoff interferierende Bestandteile in der oberen Phase zurückgehalten und nur die viel kleineren Mykoplasmen durch das Saccharosekissen zentrifugiert werden. Das dabei entstehende Bakterienpellet kann intakt weiterverwenden werden. Im nächsten Schritt wurde mit Hilfe einer Vakuumpumpe (Laboport®, KNF Neuberger, Trenton, USA) die Flüssigkeit bis zur 100 µl Grenze und auch alle am Rand verbliebenen Resttropfen abgesaugt. Die übrigen 100 µl stellen nur noch das restliche Saccharosekissen und das Pellet dar. Die Pellets wurden dann entweder direkt weiterverarbeitet oder bis zum Gebrauch bei -20 °C gelagert.
Den auf Raumtemperatur (RT) gebrachten Proben wurde im nächsten Schritt 50 µl 0,3% Natriumdodecylsulfat (SDS) zugegeben und das Pellet vollständig resuspendiert. Dabei ergibt sich eine finale SDS-Konzentration von 0,1%, welche erforderlich ist, um vorhandene Zellmembranen vollständig zu lösen. Dadurch wird die DNA freigesetzt und für den Fluoreszenzfarbstoff bzw. die Polymerase zugänglich gemacht. Anschließend wurden 1,35 ml TE Puffer hinzugefügt und durch mehrmaliges Invertieren vermischt, ohne dabei Luftblasen entstehen zu lassen. Dieser Schritt reduziert die SDS-Konzentration auf 0,01% reduziert, sodass das SDS und die Saccharose nicht mehr mit dem Fluoreszenzfarbstoff interferieren.
Um Antigen-DNA aus den verwendeten Impfstoffen zu isolieren, wurde ebenfalls das von Wise et al. 2013 beschriebene Protokoll angewandt. Dabei wurden jeweils 1 ml Impfstoff verwendet.
3.2.4 Untersuchung von Probenmaterial mittels qPCR
Im Anschluss an die DNA-Isolierung wurden die Proben im Doppelansatz, wie unter Punkt 3.2.2 beschrieben, mittels qPCR auf das Vorhandensein erregerspezifischer DNA-Sequenzen untersucht. Bei jeder Amplifikation wurden neben den unbekannten Proben auch die Standardverdünnungen mit bekannter Anzahl an Genomkopien und ein Ansatz ohne DNA-Template als Negativkontrolle untersucht. Die Daten der qPCR wurden mit MxPro Software unter Berücksichtigung der Standard- und Dissoziationskurven analysiert und beurteilt. Proben, bei denen Ct-Werte gemessen wurden, die durch ein unspezifisches Signal entstanden und für die die Anzahl an Genomkopien mit einem Wert unter null ermittelt wurde, wurden als negativ gewertet.
Die Daten wurden zur weiteren Datenanalyse in Microsoft Office Excel 2016 exportiert (Microsoft Corporation, Redmond, USA).
3.3 Herstellung und Untersuchung von Hyperimmunseren
3.3.1 Herkunft und Haltung der Tiere
Da die Hyperimmunseren ausschließlich Antikörper enthalten sollen, die auf Impfung mit einem ausgewählten Antigen zurückzuführen sind, war es entscheidend, dass die Versuchstiere zu Versuchsbeginn weder aktiv noch passiv erworbene M.-hyopneumoniae-spezifische Antikörper im Serum aufwiesen. Die Tiere wurden aus einem Basiszuchtbetrieb zugekauft, der basierend auf Routinediagnostik als klinisch und serologisch M.-hyopneumoniae-unverdächtig eingestuft wird. Des Weiteren führt der Betrieb keine Impfung gegen M. hyopneumoniae durch. Acht männliche Absetzferkel im Alter von acht Wochen und einem Körpergewicht von im Mittel 15 kg wurden mit einem Transporter mit gefilterter Zuluft vom Herkunftsbetrieb zu den Versuchsställen transportiert. Nach der Ankunft wurden die Ferkel randomisiert auf zwei Ställe aufgeteilt und es fand eine 14-tägige Eingewöhnungsphase der Tiere statt.
Die Haltung der Tiere erfolgte auf planbefestigtem Boden mit Stroheinstreu. Das Stroh wurde vor dem Verbringen in den Versuchsstall autoklaviert. Die Fütterung erfolgte restriktiv mit handelsüblichen und altersgerechten Fertigfuttermitteln (Deuka primo pro, Deuka Deutsche Tiernahrung, Emstek, Deutschland). Die Tiere wurden täglich einer verkürzten klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Dabei wurden die Atemfrequenz und der Atemtyp erfasst und die Körperinnentemperatur rektal
gemessen. Zudem wurden Haltung, Verhalten, Hautoberfläche und Futteraufnahme der Tiere beurteilt. Besondere Ereignisse wurden ebenfalls notiert. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz 2013 durchgeführt (Tierversuchsgenehmigungsnummer: 33.8-42502-05-17A195).
Aus demselben Herkunftsbestand wurden zu einem späteren Zeitpunkt zwei weitere männliche Tiere mit einem Körpergewicht von 65 kg zugekauft. Sie dienten als Kontrolltiere. Nach der Ankunft dieser Kontrolltiere fand unverzüglich deren Sektion statt. Es wurden dieselben Proben entnommen, wie bei den übrigen Tieren.
3.3.2 Auswahl der Impfstoffe
Ziel des Versuches war es, Seren mit einem möglichst hohen Antikörpertiter und mit einer möglichst großen Diversität an M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern zu erhalten. Die Auswahl der Impfstoffe erfolgte daher basierend auf unterschiedlichen Bakterienstämmen bzw. unterschiedlichen M.-hyopneumoniae-Isolaten, die in den verschiedenen Impfstoffen als Antigen enthalten sind (s. Tabelle 5). Es wurden vier Impfstoffe mit verschiedenen Antigenen für den Versuch ausgewählt. Darunter waren ein One-Shot-Präparat, bei dem es sich zudem um einen Kombinationsimpfstoff handelt, und drei Two-Shot-Monovakzinen. Die Zuteilung der Tiere in eine der vier Impfstoffgruppen erfolgte randomisiert. Je Impfstoff wurden jeweils zwei Tiere immunisiert.
Tabelle 5: Auflistung der angewendeten Impfstoffe. Informationen laut Herstellerangaben.
Handelsname Stamm Mindestalter Anwendung bei
[Tage]
Zweite Injektion
nach … Wochen
Tier-identifikation
Suvaxyn® M. Hyo P-5722-3 ≥7 2 17, 18
Stellamune® Mycoplasma NL 1042 ≥3 2-4 97, 98
Porcilis® M. Hyo Stamm 11 ≥7 3 128, 129
Porcilis® PCV M. Hyo Stamm J ≥21 - 168, 169
3.3.3 Immunisierungsschema
Die Immunisierung der Tiere erfolgte in Anlehnung an ein bereits für die Herstellung von Hyperimmunseren etabliertes Protokoll aus dem Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus dem Jahre 2003. Der Ablauf der Hyperimmunisierung ist in Abbildung 1 dargestellt. Um die Seronegativität der Tiere zu bestätigen, wurde am Tag der Einstallung (Tag -11) eine Blutprobe entnommen und diese mittels IDEXX M. hyo ELISA auf das Vorhandensein von M.-hyopneumoniae-spezifischen Antikörpern untersucht. Nach einer mehrtägigen Eingewöhnungsphase erfolgte die erste Immunisierung mit der vom jeweiligen Hersteller angegebenen Impfdosis (ID) an Tag 0. Die erste Boosterinjektion erfolgte an Tag 13 mit doppelter ID. An Tag 20 wurde erst eine Blutprobe zur Kontrolle des Antikörperanstiegs entnommen und anschließend die Injektion mit einfacher ID durchgeführt. Die nächste Injektion erfolgte an Tag 27 ebenfalls mit einfacher ID. An Tag 31 wurde erneut eine Blutprobe entnommen und an Tag 34 erfolgte die abschließende Boosterinjektion mit doppelter ID.
Abbildung 1: Ablauf der Hyperimmunisierung. Immunisierungen an Tag 0, 20 und 27 erfolgten mit einfacher Impfdosis (ID), Immunisierungen an Tag 13 und 34 mit doppelter ID. Blutproben (BP) wurden an Tag -11, 20, 31 und bei der Serumgewinnung entnommen.
3.3.4 Blutprobengewinnung
Die Eingangsblutprobe am Tag der Einstallung der Schweine in den Versuchsstall wurde durch Punktion der Vena (V.) cava cranialis gewonnen. Es wurden 1,20 mm x 40 mm Sterican® Einmal-Injektions-Kanülen (G18, B. Braun Vet Care GmbH, Melsungen, Deutschland) verwendet. Blutproben zu späteren Zeitpunkten wurden durch Punktion der V. jugularis externa gewonnen. Hierfür wurden 1,10 mm x 50 mm Sterican® Einmal-Injektions-Kanülen (G19, B. Braun Vet Care GmbH, Melsungen, Deutschland) verwendet. Je Beprobungstag wurden jeweils 5 ml
Blut (Monovette® Serum, Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Deutschland) entnommen.
Die Proben wurden nach einer Gerinnungszeit von ca. einer Stunde für 15 min bei 2.000 g bei RT zentrifugiert (Centrifuge 5804 R, Eppendorf – Netheler – Hinz GmbH, Hamburg, Deutschland). Das Serum wurde anschließend abgenommen und in sterile Reagiergefäße überführt. Die Proben wurden dann mittels IDEXX ELISA nach Herstellerangaben untersucht und anschließend bei -20 °C gelagert.
3.3.5 Sektion Serumgewinnung
Zur Serumgewinnung wurden die Tiere erst mit 2 mg/kg Körpergewicht i. m. Azaperon (Stresnil® 40 mg/ml, Elanco Tiergesundheit, Bad Homburg) und 15 - 20 mg/kg Körpergewicht i. m. Ketamin (Ketamidor® 100 mg/ml, WDT, Garbsen) in Neuroleptanalgesie verbracht und anschließend mit 80 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital (Euthadorm® 400 mg, CP-Pharma, Burdorf, Deutschland) intravenös euthanasiert. Direkt im Anschluss an die Pentobarbitalinjektion wurde die V. jugularis eröffnet und das Blut der Tiere aufgefangen. Nach einer Gerinnungszeit von mindestens drei Stunden wurde das gewonnene Blut für 20 min bei 3.800 U/min und 20 °C zentrifugiert (Heraeus Multifuge 4 KR, Thermo Electron Corporation, Osterrode, Deutschland). Der Überstand wurde dann in ein neues Gefäß überführt und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Bis zur weiteren Untersuchung wurden die so gewonnenen Seren bei -20 °C gelagert.
Bronchial Tupfer
Die Tupferprobenentnahme erfolgte post mortem an der aus dem Tierkörper entnommenen Lunge. Dazu wurde ein steriler, umhüllter Stutentupfer (ohne Transportmedium, WDT, Garbsen, Deutschland) bis über die Carina tracheae hinweg in die luftleitenden Wege der Lunge vorgeführt und dort ein Schleimhautabstrich durchgeführt.
Der Tupfer wurde in ein steriles Reagiergefäß mit ML Medium überführt und anschließend im diagnostischen Labor am Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover einer mikrobiellen Untersuchung unterzogen.
Bronchoalveoläre Lavage
Die bronchoalveoläre Lavage wurde post mortem im Anschluss an die Tupferprobenentnahme durchgeführt. Hierzu wurden 200 ml warme, sterile, isotonische Kochsalzlösung (Isotonische Natriumchlorid-Lösung ad us. vet., B. Braun Vet Care GmbH, Melsungen) über den Larynx in die Lunge instilliert. Nach kurzem, vorsichtigem Massieren der Lungenlappen wurde die Spülflüssigkeit dann in einem sterilen Falcontube (50 ml, 114 x 28 mm, Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Deutschland) aufgefangen.
Ein Aliquot der BALF-Proben wurde anschließend im diagnostischen Labor am Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover einer mikrobiologischen Untersuchung unterzogen. Die verbleibende BALF wurde 15 min bei 8.000 U/min zentrifugiert (Heraeus Megafuge 16R, Thermo Fisher Scientific, Thermo Electron LED GmbH, Osterrode am Harz, Deutschland) und der Überstand in ein neues steriles Reaktionsgefäß überführt. Die Proben wurden dann bis zur weiteren Analyse
Ein Aliquot der BALF-Proben wurde anschließend im diagnostischen Labor am Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover einer mikrobiologischen Untersuchung unterzogen. Die verbleibende BALF wurde 15 min bei 8.000 U/min zentrifugiert (Heraeus Megafuge 16R, Thermo Fisher Scientific, Thermo Electron LED GmbH, Osterrode am Harz, Deutschland) und der Überstand in ein neues steriles Reaktionsgefäß überführt. Die Proben wurden dann bis zur weiteren Analyse