TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere TRPC1 über eine Region in seinem C-Terminus sowie über den Bereich vom zweiten bis fünften Transmembransegment einschließlich der mutmaßlichen Porenregion (Tsiokas et al., 1999). Möglicherweise ist die Art der Komplexbildung also ein allgemeiner Prozess bei Kanälen, die sich aus mehreren Untereinheiten zusammensetzen.

Obwohl diese Ergebnisse die ersten veröffentlichten Resultate über Interaktionen zwischen TRPC-Proteinen bestätigen, scheinen sie auf den ersten Blick neueren Berichten zu widersprechen. Zunächst war die molekulare Interaktionsfähigkeit von hTRPC1 und hTRPC3 mittels Coimmunpräzipitation aus transient transfizierten 293T-Zellen demonstriert worden (Xu et al., 1997). Zur Charakterisierung der postulierten heterotetrameren Kanäle wurden HEK293-Klone erzeugt, die stabil hTRPC1 oder hTRPC3 exprimierten. Anschließend wurden die hTRPC1-exprimierenden Klone transient mit hTRPC3 transfiziert. Die resultierenden Ionenströme unterschieden sich deutlich von denen der Einzeltransfektanten, u.a. war die Leitfähigkeit wesentlich sensitiver gegenüber Calcium. Daher wurde angenommen, dass hTRPC1 und hTRPC3 heterotetramere Kanäle bilden können (Lintschinger et al., 2000).

Beide Untersuchungen waren in heterologen Expressionssystemen durchgeführt worden, so dass nur gemutmaßt werden kann, ob ein derartiger heterotetramerer Kanal endogen in einem Zelltyp oder Gewebe existiert und welche Rolle er dort spielt. Der erste endogen gefundene TRPC-Komplex beinhaltete TRPC1 und TRPC4 oder TRPC5 in Mikrosomen des Gehirns von Ratten. Um diese Kanäle zu charakterisieren, wurden HEK293-Zellen, die den muskarinischen M1-Rezeptor stabil exprimieren (HEK293-M1), transient mit hTRPC1 und mTRPC4 oder mTRPC5 transfiziert. Die resultierenden Ströme wurden mit denen der Einzeltransfektanten verglichen. Wieder entstand ein Kanal, der sich funktionell deutlich von den homotetrameren Kanälen unterschied. Dabei wurde kein Unterschied zwischen mTRPC4 und mTRPC5 festgestellt, sowohl bei Einzeltransfektanten als auch jeweils zusammen mit hTRPC1, was auf die starke Homologie von TRPC4 und TRPC5 zurückgeführt wurde (siehe Anhang 11.1.4). Die Bildung heterotetramerer Kanäle in den transfizierten Zellen wurden durch Coimmunpräzipitation bestätigt. Die Autoren schlossen allerdings nicht aus, dass weitere TRPC-Proteine in den Komplexen enthalten sind (Strübing et al., 2001). Obwohl eine Kontroverse über die Aktivierungsmechanismen und z.T. auch über die Kanaleigenschaften der verschiedenen TRPC-Proteine herrscht, besteht doch Einverständnis darüber, dass es zwei strukturelle und funktionelle TRPC-Unterfamilien gibt, die rezeptoraktivierte Kationenkanäle darstellen. Die Subfamilien sind die aktivierbaren TRPC3/6/7 und die DAG-insensitiven TRPC4/5 sowie TRPC1, das die meiste Homologie zu TRPC4/5 besitzt, und

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere TRPC2, das am nächsten mit TRPC6 verwandt ist (siehe Anhang 11.1.4). Bei TRPC2 scheint es sich allerdings bei Mensch und Rind um ein Pseudogen zu handeln, wohingegen es bei Maus und Ratte ein offenes Leseraster gibt.

Um zu ermitteln, ob es prinzipielle Regeln für die Heterotetramerisierung von TRPC-Proteinen gibt, unternahmen Hofmann et al. ausführliche Interaktionsstudien mit vier verschiedenen Ansätzen. Letztlich kamen die Autoren zum Schluss, dass alle TRPC-Proteine in der Lage sind, Homotetramere zu bilden, aber heterotypische Wechselwirkungen nur innerhalb der Subfamilien stattfinden, d.h. zwischen TRPC1, TRPC4 und TRPC5 bzw.

TRPC3, TRPC6 und TRPC7. TRPC2 könne nur Homotetramere bilden.

Diese These bestätigt zwar die Interaktion von TRPC1 mit TRPC4 und TRPC5 (Strübing et al., 2001), widerspricht aber zunächst der auch im Rahmen dieser Arbeit belegten Assoziation von TRPC1 an TRPC3 (Xu et al., 1997; Lintschinger et al., 2000; Friedrich, 2001). Hofmann et al. untersuchten als erstes die Lokalisation der untersuchten TRPC-Isoformen und stellten mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie fest, dass nur TRPC3, 4, 5 und 6 in der Plasmamembran lokalisiert sind, TRPC1 und TRPC2 hingegen nur in intrazellulären Membranen einschließlich der Kernmembran. Daraufhin wurde die Hypothese aufgestellt, dass TRPC1 die Bindung an eine andere Isoform benötigt, um an die Plasmamembran transportiert zu werden. TRPC4 und 5 waren dazu in der Lage, TRPC3 und 6 nicht. Die Wirkung von TRPC2 wurde nicht untersucht oder nicht gezeigt. Nach den Ergebnissen dieser Arbeitsgruppe und anderen Veröffentlichungen befindet sich TRPC1 jedoch hauptsächlich in der Plasmamembran (Wang et al., 1999; Friedrich, 2001; Engelke et al., 2002; Singh et al., 2001-b; Engelke, 2003). Hofmann et al. nennen im Rahmen der Artikels zwar die Genbank-Zugangsnummer der von ihnen benutzen Varianten nicht, bezeichnen TRPC1 aber auch als hTRPC1A. Dabei handelt es sich um eine humane Spleißvariante, die wie das im Rahmen dieser Arbeit verwendete mTRPC1β eine Deletion im N-Terminus besitzt. Allerdings fehlen dieser menschlichen Form N-terminal 16 Aminosäuren, die möglicherweise für den Transport in die Plasmamembran essentiell sein könnten. Zusätzlich wurde jedoch eine weitere humane Sequenz veröffentlicht, die N-terminal um 51 Aminosäuren länger ist als die von Hofmann et al. untersuchte Variante (Hofmann et al., 2002). Daher sollte kontrolliert werden, ob die längere humane Form in der Plasmamembran lokalisiert ist. Der gleiche Einwand gilt auch für die Untersuchungen in Bezug auf mTRPC2. Auch TRPC2 war nur in intrazellulären Membranen lokalisiert (Hofmann et al., 2000-a). Dies widerspricht ebenfalls den Beobachtungen dieser Arbeitsgruppe (Friedrich, 2001). Allerdings sind die von Hofmann et al. veröffentlichten Spleißvarianten von mTRPC2 N-terminal 182 - 286 Aminosäuren kürzer

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere als die von Vannier et al. klonierten (siehe Anhang 11.1.2). Dieser Bereich könnte für die Lokalisation von mTRPC2 entscheidend sein. Diese These wird durch eine von Hofmann et al. erzeugte Deletionsmutante von hTRPC6 bestätigt, der die ersten 131 Aminosäuren N-terminal von der ersten Ankyrin-ähnlichen Wiederholung fehlen. Infolgedessen wurde das TRPC6-Protein nicht mehr in die Plasmamembran transportiert (Hofmann et al., 2002).

Zudem waren die kürzeren Spleißvarianten von mTRPC2 im Gegensatz zu den längeren nicht in der Lage, über den N-Terminus eine Interaktion mit Calmodulin einzugehen (Yildirim et al., 2003). Die kürzeren Spleißvarianten von mTRPC2 scheinen also funktionelle Einschränkungen zu besitzen. Daher ist es möglich, dass allgemein die N-terminalen Aminosäuren von TRPC-Proteinen für die Lokalisation in der Plasmamembran verantwortlich sind, indem nur N-terminal intakte Proteine zur Tetramerisierung in der Lage sind und nur vollständige Kanäle zur Plasmamembran transportiert werden, Monomere hingegen im ER verbleiben. Die erwähnte Mutante von hTRPC6 wurde im Gegenzug nur bei Coexpression von hTRPC3 und hTRPC6 in der Plasmamembran gefunden, nicht in Gegenwart von mTRPC4 und mTRPC5. Der Einfluss von hTRPC1(A) und mTRPC2 wurde nicht untersucht.

Daher wurde geschlossen, dass TRPC6 ebenfalls nur Interaktionen innerhalb der Subfamilie eingeht (Hofmann et al., 2002). Das kann durchaus der Fall sein, allerdings existieren auch von TRPC4 verschiedene Spleißvarianten. Die α-Variante besitzt eine Insertion von 84 AS im C-Terminus, die schon für die Interaktion mit dem IP3-Rezeptor notwendig war (Mery et al., 2000). Welche Variante von Hofmann et al. eingesetzt wurde, ist dem Artikel nicht zu entnehmen.

Im zweiten Experiment aus dieser Veröffentlichung wurde eine disfunktionelle Mutante von hTRPC6 (hTRPC6-DN) generiert, in der drei hochkonservierte Aminosäuren in der mutmaßlichen Porenregion ausgetauscht wurden. Infolgedessen produzierte die Mutante keinen Stromfluss nach Rezeptorstimulation oder Speicherentleerung mehr. Basierend auf der Annahme der Tetramerisierung wurde diese dominant-negative Mutante transient zusammen mit andern TRPC-Formen in HEK293-M1-Zellen exprimiert und die Auswirkungen aus den Kationeneinstrom verfolgt. Die Coexpression von hTRPC6-DN inhibierte effizient den Einstrom durch TRPC3 und TRPC6, hatte aber keinen Einfluss auf von TRPC4 und TRPC5 verursachte Ströme. Dieser Fund unterstützte die These der Interaktion innerhalb der Subfamilie (Hofmann et al., 2002). Mit TRPC1 und TRPC2 wurden keine Versuche durchgeführt, so dass die These, TRPC1 interagiere nur mit TRPC4 und TRPC5 und TRPC2 nur mit sich selbst, lückenhaft belegt ist.

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere Als dritter Ansatz wurde der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen Fluoreszenz-markierten TRPC-Formen in HEK293-Zellen gemessen. Die Autoren schließen aus ihren Messungen, dass alle TRPC-Formen homotypische Interaktionen eingehen, wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz. Darüber hinaus komme es nur zu einem im Vergleich zu den Kontrollen signifikant erhöhten FRET-Signal bei Kombinationen von TRPC1, 4 und 5 bzw. TRPC3, 6 und 7. Kombinationen jenseits der Subfamilien erzeugten kein signifikantes Signal (Hofmann et al., 2002). Betrachtet man allerdings die Abbildung der FRET-Messungen genauer, ist klar zu erkennen, dass die Kombinationen von TRPC1, 4 und 5 ein sehr schwaches FRET-Signal erzeugen, das nur geringfügig höher ist als die Signale, die von TRPC2-Kombinationen oder Kombinationen außerhalb der Subfamilien erzeugt wurden, die als nicht signifikant eingeordnet wurden. Die homo- und heterotypischen Kombinationen von TRPC3, 6 und 7 erzeugen ein wesentlich stärkeres FRET-Signal als alle anderen Kombinationen. Die Subfamilienregel trifft in diesem Fall nur begrenzt zu. Es ist auch möglich, dass sich die Signale bei Verwendung anderer Spleißvarianten v.a. von TRPC2 und TRPC1 ändern. Eine prinzipielle Assoziationsfähigkeit dieser Isoformen außerhalb der von Hofmann et al. aufgestellten Regel kann auf Grundlage dieser Daten nicht ausgeschlossen werden.

Zur Überprüfung der aufgestellten Regel führten Hofmann et al. Coimmunpräzipitations- experimente in HEK293-Zellen mit hTRPC1(A), mTRPC2, hTRCP3, mTRPC4, mTRPC5 und hTRPC6 durch, die mit einem HA- oder einem myc- Epitop gekennzeichnet waren. Wie bei allen vorhergehenden Experimenten führten alle homotypischen Kombinationen zu einem positiven Ergebnis. Heterotetramere Komplexe traten nur zwischen TRPC3 und TRPC6 sowie zwischen TRPC4 und TRPC5 bzw. TRPC1 auf. Kombinationen außerhalb der Subfamilien wie auch mit TRPC2 führten zu keinen detektierbaren Coimmunpräzipitaten.

Coimmunpräzipitationsversuche mit TRPC7 wurden nicht durchgeführt oder nicht gezeigt, das gleiche gilt für die Kombination von TRPC1 mit TRPC5 und TRPC1 selbst sowie die Kombination von TRPC2 mit TRPC5. Darüber hinaus wurden nicht alle Kombinationen aus beiden Richtungen gezeigt. Z.B. wurde TRPC1 nur zur Immunpräzipitation eingesetzt, aber nicht als assoziiertes Protein im Westernblot gezeigt (Hofmann et al., 2002). Eine nicht nachweisbare Assoziation mit mTRPC1 und mTRPC2 kann daran liegen, dass diese beiden von Hofmann et al. verwendeten Isoformen nicht wie die übrigen TRPC-Proteine in der Plasmamembran lokalisiert waren, sondern intrazellulär. Mit anderen, N-terminal längeren Spleißvarianten von TRPC1 und TRPC2 können also möglicherweise andere Coimmunpräzipitate erhalten werden.

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere Es stellt sich nun also die Frage, ob TRPC1 und TRPC2 zu Interaktionen mit TRPC3 in der Lage sind oder nicht. Für den Widerspruch zwischen den verschiedenen Ergebnissen kann es mehrere Erklärungen geben: Erstens können die unterschiedlichen Interaktionen auf verschiedene Spleißvarianten von TRPC1 und TRPC2 zurückzuführen sein, d.h. die ersten N-terminalen Aminosäuren könnten für die Assoziation essentiell sein. Zweitens wurden bei den Versuchen unterschiedliche Antikörper und verschiedene Epitope zum Nachweis der TRPC-Formen verwendet, die abweichende Detektionssensitivitäten besitzen und daher zu unterschiedlichen Ergebnissen beitragen können. Drittens kann auch das Zellsystem einen Einfluss auf die Komplexbildung haben, denn untransfizierte 293T-Zellen zeigen nur einen sehr geringen Kationeneinfluss im Vergleich zu z.B. Xenopus Oocyten oder Sf9-Insektenzellen (Xu et al., 1997). Möglicherweise werden die endogenen TRPC-Proteine in COS-M6-Zellen stärker exprimiert als in HEK293-Zellen, so dass sie normalerweise unwahrscheinliche Heterotetramere verbrücken können. Viertens und letztens wurde von Hofmann et al. eine starke Bandenverbreiterung bei TRPC3 und TRPC6 beobachtet, die durch N-Glykosylierung erklärt wurde. Derartige Banden wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht beobachtet, möglicherweise findet diese posttranslationale Modifikation in COS-M6-Zellen an TRPC-Proteinen nicht statt. Eine derartige Modifikation könnte ebenfalls mögliche Assoziationen von TRPC1 und TRPC2 mit TRPC3 verhindern.

Zwei weitere Studien widmeten sich der Untersuchung von endogenen TRPC-Kanälen. Goel et al. bemühten sich um die Aufklärung der Zusammensetzung von TRPC-Kanäle im Gehirn von Ratten, wo TRPC1, 3, 4, 5, 6 und 7 sowohl in Cerebellum (Kleinhirn) als auch im Cortex (Hirnrinde) überlappend exprimiert werden. Als Vorversuch und zur Charakterisierung der generierten Antikörper, die spezifisch für die jeweiligen humanen Isoformen waren, wurden hTRPC1, hTRPC3, bTRPC4, mTRPC5, mTRPC6 und mTRPC7 allein und in verschiedenen Kombinationen in Sf9-Insektenzellen exprimiert. Nach Feststellung der Spezifität der Antikörper wurden reziproke Coimmunpräzipitationsexperimente durchgeführt, die zeigten, dass TRPC1, 4 und 5 miteinander assoziierten sowie TRPC3, 6 und 7. Eine Interaktion über die Subfamilie hinaus trat nicht auf (Goel et al., 2002). Diese Beobachtung ist im Einklang mit der Subfamilien-These von Hofmann et al., steht aber im Widerspruch zu den im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Interaktionen. Die Abweichungen können aus mehreren Details resultieren. Erstens haben Goel et al. wie Hofmann et al. die humane TRPC1-Variante verwendet, die als hTRPC1A oder hTRPC1β bezeichnet wird. In der vorliegenden Untersuchung hingegen wurde mTRPC1β eingesetzt. Zwar fehlen sowohl hTRPC1β als auch mTRPC1β 34 Aminosäuren im N-Terminus im Vergleich zu hTRPC1α und mTRPC1α, aber

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere die murinen Formen sind am N-Terminus jeweils um 16 Aminosäuren länger als die humanen, wobei die Sequenz GAPPPSPGLPPSWAA jedoch in der dritten menschlichen Variante (hTRPC1) enthalten ist. Möglicherweise sind diese Reste für die Assoziation an hTRPC3 entscheidend (siehe Anhang 11.1.1).

Eine andere Möglichkeit wäre, dass in Sf9-Insektenzellen säugerspezifische Proteine, die für die Lokalisation oder die Komplexbildung notwendig sind, fehlen, so dass nicht alle möglichen TRPC-Kanäle gebildet werden können. Ein solches Protein könnte auch ein drittes TRPC-Protein sein. Auch untransfizierte Sf9-Zellen zeigen einen nicht-spannungsabhängigen Calciumeinstrom (Xu et al., 1997; Goel et al., 2002), besitzen aber endogen höchstwahrscheinlich nur TRP-Proteine, die denen aus Drosophila sehr ähnlich sind. Eine Interaktion zwischen TRP-Proteinen aus Wirbeltieren und Wirbellosen wurde bereits ausgeschlossen (Xu et al., 2000). Gegen die Verbrückung durch ein endogenes TRPC-Protein in Säugerzellen spricht allerdings die Tatsache, dass die Interaktionen nicht beliebig sind (Hofmann et al., 2002).

Mit Hilfe der hergestellten Antikörper untersuchten Goel et al. die TRPC-Kanäle in synaptosomalen Präparationen aus Cortex und Cerebellum. Reziproke Coimmun- präzipitationen bestätigten die Vorversuche in Sf9-Zellen und zeigten, dass TRPC1, 4 und 5 bzw. TRPC3, 6 und 7 miteinander interagieren, aber keine Assoziationen über die Subfamilie hinaus vorliegen (Goel et al., 2002). Allerdings konnte TRPC4 zwar durch TRPC1 und 5 präzipitiert werden, nicht aber TRPC1 und 5 durch TRPC4. Die Autoren schlugen daher vor, dass das Epitop durch andere TRPC-Proteine oder durch weitere Proteine des Signalkomplexes verdeckt ist, das in Sf9-Zellen nicht vorkommt. Außerdem merkten die Autoren an, dass nicht bekannt ist, welche Spleißvarianten im Gehirn von Ratten exprimiert werden, d.h. andere Spleißvarianten könnten andere Assoziationen eingehen. Außerdem existiert zumindest von TRPC4 eine Spleißvariante, bei der das Epitop, gegen das der Antikörper gerichtet ist, fehlt (TRPC4β). Sollte diese β-Variante in einem Komplex mit TRPC3, 6 oder 7 vorliegen, könnte sie mit dem verwendeten Antikörper nicht nachgewiesen werden. Die bekannten Spleißvarianten unterscheiden sich nur um 34 bis 84 Aminosäuren, was in etwa 4 bis 9 kDa entspricht. Solche geringen Abweichungen vom berechneten Molekulargewicht können im Westernblot wahrscheinlich nicht festgestellt werden, bedenkt man das bekannte anormale Laufverhalten von TRPC-Proteinen im SDS-PAA-Gel.

Zudem gibt es bei TRPC3 zwei Abweichungen in der Sequenz von Ratten zu der vom Menschen, gegen die Antikörper generiert wurden. Die Sequenz der Ratten-Form von TRPC7 ist nicht bekannt, so dass Abweichungen nicht festgestellt werden können. Es ist möglich,

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere dass durch diese Abweichungen die Antikörper nicht ausreichend stark binden, um schwache Interaktionen nachweisen zu können. Die Untereinheitenstruktur von TRPC-Kanälen in neuronalen Zellen ist also auch mit dieser Studie nicht abschließend geklärt.

Hochinteressante Ergebnisse liegen in einer erst kürzlich veröffentlichten Studie über TRPC-Komplexe in embryonalem Gehirn vor. Im pränatalen Gehirn wurden mit Hilfe von Coimmunpräzipitationsexperimenten mittels spezifischer Antikörper verschiedene endogene TRPC-Heterotetramere detektiert, die TRPC3 oder TRPC6 und die DAG-insensitiven Proteine TRPC1 und TRPC4 oder TRPC5 einschlossen. Die Zusammensetzung der TRPC-Kanäle könnte ontogenetisch reguliert sein, da TRPC3 und TRPC6 nur im vorgeburtlichen, aber nicht im adulten Gehirn detektiert werden konnte. Allerdings waren TRPC1, 4 und 5 im Gehirn ausgewachsener Tiere ebenfalls wesentlich geringer exprimiert (Strübing et al., 2003).

Die Expression von TRPC2 wurde nicht untersucht, obwohl in Nagern ein offenes Leseraster vorliegt (Liman et al., 1999). Da in Synaptosomen aus Rattenhirn keine derartigen gemischten Heterotetramere gefunden worden waren (Goel et al., 2002), mutmaßten die Autoren, dass in verschiedenen zellulären Kompartimenten unterschiedliche TRPC-Kombinationen existieren (Strübing et al., 2003). Alternativ könnte die Kanalbildung auch vom Entwicklungszustand des Gewebe abhängen, d.h. in embryonalem Gehirn könnten andere Kanäle gebildet werden als in adultem. Zudem wäre es möglich, dass TRPC3 und TRPC6 in der Studie von Goel et al. auf Grund der geringeren Expression der verschiedenen TRPC-Proteine in adultem Gehirn und der Verwendung anderer Antikörper nicht detektierbar waren. Strübing et al. spekulierten, dass die unterschiedlichen Heterotetramere in embryonalem und adultem Gehirn evtl. eine spezialisierte Funktion der Kanalsubtypen reflektiert, z.B. beim neuronalen Wachstum, der Wegfindung oder der Differenzierung von Neuronen.

Um die Bildung dieser Heterotetramere mit mehr als zwei Komponenten nachvollziehen zu können, wurden hTRPC1(α), hTRPC3, mTRPC4(β), mTRPC5 und hTRPC6 in verschiedenen Kombinationen in 293T-Zellen exprimiert und Coimmunpräzipitationsexperimente vorgenommen. Tatsächlich konnte die Assemblierung von Komplexen aus TRPC1 und TRPC4 oder TRPC5 sowie eine der DAG-sensitiven Untereinheiten TRPC3 oder TRPC6 bestätigt werden. Dabei stellte sich heraus, dass die Bildung der gemischten Komplexe kritisch von der Anwesenheit von TRPC1 zusammen mit TRPC4 oder 5 abhängig war. Ohne TRPC1 interagierten TRPC3 oder TRPC6 nicht mit TRPC4 oder TRPC5, aber ohne TRPC4 oder TRPC5 interagierte TRCP1 auch nicht mit TRPC3 oder TRPC6 (Strübing et al., 2003).

Der letzte Fund steht wieder im Gegensatz zu der von Xu et al. und den im Rahmen dieser

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere Arbeit vorgelegten Coimmunpräzipitationen von TRPC1 und TRPC3. Dabei ist zu beachten, dass Strübing et al. hTRPC1α verwendeten. Diese Spleißvariante besitzt im N-Terminus eine insertierte Region, die sowohl der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten murinen Variante mTRPC1β als auch der von Hofmann et al. und Goel et al. untersuchten humanen Form hTRPC1A (hTRPC1β) nicht enthalten ist. Allerdings fehlen dieser menschlichen Spleißvariante im Vergleich zu den TRPC1-Proteinen der Maus am Beginn des Protein 16 Aminosäuren. Eine dritte von Wes et al. veröffentlichte hTRPC1-Sequenz besitzt einen längeren N-Terminus (Wes et al., 1995). Diese enthält auch das möglicherweise für die Interaktion mit TRPC3 relevante GAPPPSPGLPPSWAA-Motiv (siehe Anhang 11.1.1).

Auch in der Studie von Hofmann et al. wurde untersucht, ob TRPC1, 4 und 6 einen gemeinsamen Komplex bilden. Bei Präzipitation von TRPC1 wurde nur TRPC4 detektiert, TRPC6 hingegen nicht (Hofmann et al., 2002). Strübing et al. argumentierten, dass in der neuen Studie die ungespleißte Variante von hTRPC1 (also hTRPC1α) statt der verkürzten Form hTRPC1A (auch als hTRPC1β bezeichnet) eingesetzt wurde (Strübing et al., 2003).

Möglicherweise ist also dieser Bereich im N-Terminus für die Bildung der dreifach gemischten Heterotetramere unabdingbar. Eine Studie mit der murinen TRPC1α-Form, die beide relevante Bereiche enthält, wäre hochinteressant und könnte Komplexe der Art TRPC1+3 sowie TRPC1+3/6+4/5 ermöglichen.

In der gleichen Studie wurde die funktionelle Wirkung der gefundenen Komplexe mit Hilfe einer dominant-negativen Mutanten von TRPC5 (TRPC5-DN) verifiziert (Strübing et al., 2003). Die Mutante wurde analog der zu von TRPC6 (Hofmann et al., 2002) hergestellt, indem drei konservierte Reste in der mutmaßlichen Porenregion durch Alanin ersetzt wurden.

Coexpression von TRPC5-DN in HEK293-M1 unterdrückte den Strom durch TRPC5- oder TRPC4-enthaltende Kanäle. TRPC3-assoziierte Ströme blieben unbeeinflusst, es sei denn TRPC1 war ebenfalls exprimiert. Sie wurden allerdings nicht durch TRPC1 allein inhibiert, sondern nur durch TRPC5-DN in Gegenwart von TRPC1. Dieser komplexe Assemblierungsmechanismus erhöht nach Meinung der Autoren die Diversität von TRPC-Kanälen im Gehirn von Säugern und könnte neue Heterotetramere erzeugen, die spezifische Rollen im sich entwickelnden Gehirn haben könnten (Strübing et al., 2003).

Darüber hinaus wurden in HEK293-M1-Zellen Kanäle, die aus TRPC1, 3 und 5 gebildet wurden, mit denen aus TRPC1 und TRPC5 sowie aus TRPC3 oder TRPC6 verglichen. Die gemischten Heterotetramere bildeten dabei einen neuartigen funktionellen Kanal, der einige Ähnlichkeiten zu TRPC1+5-Kanälen und geringere zu TRPC3- oder TRPC6-Kanälen

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere aber unklar, da weder TRPC1 noch TRPC4 oder 5 allein mit TRPC3 oder TRPC6 assoziierten. Die Autoren schlugen daher zwei Modelle vor. Entweder könnte die Interaktion von TRPC1 mit TRPC4 oder TRPC1 mit TRPC5 die Heterotetramere allosterisch modifizieren, so dass eine Bindestelle für TRPC3 oder TRPC6 geschaffen würde. Alternativ könnte die Bildung von TRPC1+4/5+3/6-Heterotetrameren eine simultane Bindung einer DAG-sensitiven Untereinheit sowohl an TRPC1 als auch an TRPC4 oder TRPC5 benötigen.

Unabhängig davon wäre zur Bildung von Tetrameren die sequentielle oder gleichzeitige Interaktion mit einer vierten Untereinheit notwendig, um einen funktionellen Kanalkomplex zu bilden. Die exakte Stöchiometrie der gemischten TRPC-Heterotetramere bleibt also unbekannt, weshalb die Analyse endogener Kanalkomplexe vorgeschlagen wurde (Strübing et al., 2003).

Fasst man also die bisher vorliegenden Studien zusammen, kann man feststellen, dass wenigstens in COS-M6-Zellen mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 in der Lage sind, homo- als auch heterotetramere Komplexe zu bilden, für deren Bildung eine Wechselwirkung über den N-Terminus ausreichend ist, die aber auch durch eine Assoziation der mutmaßlichen Porenregion bewerkstelligt werden können.

Die möglichen TRPC-Komplexe können von den verwendeten oder endogen exprimierten Spleißvarianten sowie vom untersuchten Gewebe abhängen. Unterschiedliche Zelltypen könnten also unterschiedliche TRPC-Spleißvarianten exprimieren, die zu unterschiedlichen Komplexen mit unterschiedlichen Kanaleigenschaften assoziieren. Möglicherweise hat auch das verwendete Zellsystem mit variierenden, endogen exprimierten Adapterproteinen einen Einfluss auf die Interaktion, d.h. die TRPC-Proteinen könnten nicht nur eher zufällig zusammen kommen und direkt miteinander wechselwirken, sondern über ein regulierendes Protein zusammengebracht und verbrückt werden. Um die Vermittlung der Interaktion durch ein säugerspezifisches Adapterprotein zu überprüfen, sollten Experimente parallel in Säugerzellen wie z.B. HEK293 oder COS-M6 und in Sf9-Insektenzellen durchgeführt werden. Wahrscheinlich ist, dass die Insektenzellen das möglicherweise spezifisch benötigte Protein nicht besitzen. Wenn die Ergebnisse übereinstimmen, bedeutete dies, dass TRPC-Proteine direkt und ohne Hilfe anderer TRPC-Proteine miteinander interagieren. Darüber hinaus hängen die nachweisbaren Interaktionen auch von den verwendeten Antikörpern ab, die spezifisch gegen verschiedene Bereich in den jeweiligen TRPC-Proteinen (Goel et al., 2002;

Strübing et al., 2001; Strübing et al., 2003) oder gegen angehängte Epitope (Friedrich, 2001;

8 Diskussion 8.1 TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere Hofmann et al., 2002; Xu et al., 1997; diese Arbeit) gerichtet sein können, und die unterschiedliche Detektionssensitivitäten besitzen.

Die Bildung von gemischten Heterotetrameren aus TRPC1, TRPC2 und TRPC3 in B-Zellen könnte einen ganz speziellen Kanal formieren, der im Rahmen der Aktivierung der Zellen das entscheidende, für Proliferation und Differenzierung notwendige Calciumsignal erzeugt. Die Charakterisierung der endogen in Maus-B-Zellen existierenden TRPC-Komplexe ist also der nächste unverzichtbare Schritt. Parallel müssen die heterotetrameren Kanäle aus Kombinationen von TRPC1, 2 und 3 funktionell charakterisiert und mit dem endogen in B-Zellen der Maus nach BCR-Quervernetzung auftretenden Strom verglichen werden. Welche Rolle TRPC2 dabei spielt und durch welches Protein es in menschlichen B-Zellen ersetzt wird, bleibt zu ergründen.

8.2 Die Assoziation über den N-Terminus bevorzugt Heterotetramere mittels der „coiled-coil“-Domäne

Nachdem die Interaktionsfähigkeit von mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 nachgewiesen worden war (Lintschinger et al., 2000; Friedrich, 2001; Kapitel 8.1), sollte der zur Assoziation notwendige Bereich identifiziert werden. Auf Grund der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen und der „coiled-coil“-Domäne galt der N-Terminus als wahrscheinlicher Kandidat. Für die Drosophila TRP-Proteine TRP, TRPL und TRPγ war von Xu et al. bereits die Assoziationsfähigkeit über die N-Terminus belegt worden. Zunächst war ein inhibierender Effekt auf die durch TRP erzeugten Ströme beobachtet worden, wenn eine nur cytosolische N-terminale Mutante von TRP, TRPL oder TRPγ gleichzeitig exprimiert wurde. Daher wurde vermutet, dass die N-Termini mit den vollständigen TRP-Proteinen interagierten und so die Bildung eines funktionellen Kanals störten. Alternativ könnten die N-Termini auch mit regulatorischen Proteinen assoziieren und so deren Bindung an den TRP-Kanal verhindern.

Um die tatsächliche Funktion des N-Terminus von TRP, TRPL und TRPγ zu klären, wurden Y2HS-Experimente durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass die C-Termini weder mit sich selbst noch mit den N-Termini interagierten, dass die N-Termini zur direkten Assoziation in der Lage waren, und dass v.a. die „coiled-coil“-Domäne dabei eine entscheidende Rolle spielte. Die Interaktion der N-Termini wurde mit Hilfe von in vitro-Bindungsversuchen („GST-pulldown-assay“) und Coimmunpräzipitationen aus transfizierten 293T-Zellen

8 Diskussion 8.2 Die Assoziation über den N-Terminus Terminus bereits untersucht worden. Eine Region im N-Terminus von TRPC6 (AS 3-56) scheint entscheidend für die Aktivierung durch Diacylglycerin zu sein (Zhang & Saffen, 2001). Außerdem hatten Groschner et al. eine nur cytosolische N-terminale Mutante von hTRPC3 (hTRPC3-NT, AS 1-302) in HUVEC-Zellen exprimiert. HUVEC-Zellen bilden endogen hTRPC1, 3 und 4 und zeigen einen durch Speicherentleerung induzierten Membranstrom, der von hTRPC3-NT spezifisch unterdrückt wurde. Diese Inhibierung konnte nicht durch hTRPC3 an sich verursacht worden sein, da die Transfektion mit hTRPC3 den endogenen aktivierbaren Ca -Einstrom leicht erhöhte. Dieses Ergebnis impliziert einen positiv-regulatorischen Einfluss des N-Terminus im vollständigen Protein (Groschner et al., 1998). Der gleiche Ansatz wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit mit dem N-Terminus von mTRPC1β versucht, blieb jedoch ohne Ergebnis, da der Versuch einer stabilen Expression von mTRPC1β-NT in IIA1.6- und HEK293-Zellen negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatte und die Zellen zudem nach einiger Zeit die Expression des transfizierten Proteins einstellten (vgl. Engelke, 2003). Also sollte die Interaktionsfähigkeit des N-Terminus von mTRPC1β und die Rolle der enthaltenen Domänen auf anderen Wegen erforscht werden. Friedrich setzte die N- und C-Termini von mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 sowie Deletionsmutanten von mTRPC1β analog zu den Versuchen mit den Drosophila TRP-Proteinen (Xu et al., 1997; Xu et al., 2000) in Y2HS-Tests ein und fand übereinstimmend, dass die C-Termini nicht in Wechselwirkungen traten, dass die N-Termini sowohl homo- als heterotypische Interaktionen eingingen und dass dazu die „coiled-coil“-Domäne notwendig war (Friedrich, 2001; Engelke et al., 2002). Durch Coimmunpräzipitationsexperimente konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass zur Interaktion von der untersuchten drei TRPC-Isoformen in Säugerzellen der N-Terminus ausreichend war, wobei sich in Bezug auf die „coiled-coil“-Domäne deutliche Unterschiede zeigten, die auf eine Bevorzugung von Heterotetrameren hindeuteten.

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Betrachtet man die Homotetramerisierung von mTRPC1β in der Coimmunpräzipitation (Abb.

7.7 (A) , (C) und (D), Abb. 7.8 (A) und (B) und Abb. 7.9 (A)), scheint die Interaktion behindert zu sein, wenn in beiden Partnern die „coiled-coil“-Domäne vorhanden ist. Diese Beobachtungen stehen scheinbar im Widerspruch zu den Daten, die Engelke, Friedrich und Budde mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems („Yeast Two Hybrid System“, Y2HS) erhalten haben (Engelke et al., 2002), nach denen die „coiled-coil“ Domäne für eine Dimerisierung essentiell sei, die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen jedoch keinen Einfluss auf die Bindung haben sollen. Für die verstärkte Interaktion nach Deletion der „coiled-coil“-Domäne gibt es

8 Diskussion 8.2 Die Assoziation über den N-Terminus zwei Erklärungen. Entweder beeinflusst die cc-Domäne die Zusammensetzung des TRPC-Komplexes, indem die durch unterschiedliche Affinitäten die Tetramerisierung steuert. In dem Fall könnten Heterotetramere gegenüber mTRPC1β-Homotetrameren bevorzugt sein.

Oder die cc-Domäne ist eigentlich für die Interaktion mit einem anderen nicht-TRPC-Protein zuständig. Die Interaktion mit einem zweiten TRPC-Protein wird dann verstärkt eingegangen, wenn die Bindung an den normalen Partner nicht möglich ist, da die cc-Domäne fehlt.

Vergleicht man daher die Ergebnisse der verschiedenen Versuche mit mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3, die in Abbildung 7.7 bis 7.9 dargestellt sind (Kapitel 7.2.4 und 7.2.5), kommt man zusammenfassend zu folgenden Schlussfolgerungen:

Das Assoziationsverhalten vom membranständigen TRPC1β und hTRPC3 zur cytosolischen Variante von mTRPC1β (mTRPC1β-NT) ist gleich. Es ist unabhängig davon, in welchem Partner die „coiled-coil“-Domäne fehlt bzw. vorhanden ist. Das Bindungsverhalten hängt also nicht davon ab, ob in der cytosolischen Mutante oder im membranständigen Protein die cc-Domäne deletiert wurde oder nicht. Die Bindung von mTRPC1β-NT ist stärker zu hTRPC3 als zu mTRPC1β. Die Affinität der „coiled-coil“-Domäne von mTRPC1β ist also höher zu der von hTRPC3 als zu der von mTRPC1β, folglich ist die Heterotetramerisierung bevorzugt gegenüber der Homotetramerisierung. Die „coiled-coil“-Domäne ist in diesem Fall tatsächlich an der Unterscheidung der verschiedenen TRPC-Isoformen, also am Sortierungsprozess, beteiligt.

Bei der Interaktion von mTRPC1β zu mTRPC2β ändert sich das Assoziationsverhalten allerdings leicht, wenn die „coiled-coil“-Domäne im membranständigen oder im cytosolischen mTRPC1β deletiert wurde. Bei dieser Tetramerisierung könnte die „coiled-coil“-Domäne möglicherweise nur für die Bindung verantwortlich sein, wenn das eigentlich zu bindende Protein auf Grund des Fehlens der Domäne die Wechselwirkung nicht eingehen kann. Allerdings sind die Unterschiede so gering, dass eine Aussage nur schwierig getroffen werden kann.

Die Interaktion von mTRPC2β und hTRPC3 konnte auf Grund der vorliegenden Deletionsmutanten nur betrachtet werden, wenn die N-terminalen Domänen im membranständigen hTRPC3 deletiert wurden und im cytosolischen mTRPC2β (mTRPC2β-NT) vorhanden waren. Sie scheint zwischen der von mTRPC1β mit hTRPC3 und der Homotetramerisierung von mTRPC1β zu liegen, denn die Bindung ist etwas stärker, wenn die

„coiled-coil“-Domäne von hTRPC3 fehlt. Man kann also vorläufig eine Reihenfolge

8 Diskussion 8.2 Die Assoziation über den N-Terminus aufstellen hinsichtlich der Stärke der Assoziation, die durch die „coiled-coil“-Domäne moduliert wird:

mTRPC1β-hTRPC3 > (mTRPC1β-mTRPC2β >) mTRPC2β-hTRPC3 > mTRPC1 β-mTRPC1β

Die postulierte Bevorzugung von Heterotetrameren wird unterstützt durch eine Beobachtung, die nach zahlreichen Wiederholungen (n > 20) des Y2HS-Experimentes von O. Friedrich (Friedrich, 2001) gemacht wurde. Der Autor stellte ursprünglich fest, dass mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 miteinander über den N-Terminus eine Wechselwirkung eingehen können, und dass dafür die „coiled-coil“-Domäne entscheidend ist. Dazu wurden die Hefezellen wahlweise simultan oder sukzessive mit den BD- und AD-Konstrukten transformiert und selektioniert. Positive Klone wurden anhand des Wachstums auf Leucinmangelmedium identifiziert und parallel auf X-Gal-haltigem Nährmedium kultiviert, um die lacZ-Expression zu überprüfen. Bei genauerer Betrachtung im Rahmen dieser Arbeit, die in Tabelle 7.2 dargestellt ist, kann eine stärkere β-Galactosidaseaktivität bei Heterodimeren als bei Homodimeren festgestellt werden. Die Expression vergleichbarer Proteinmengen wurde durch Western-Blot-Analyse überprüft. (Abbildung 7.10).

Dabei kann die Wechselwirkung von mTRPC1β mit mTRPC2β nur in die Reihenfolge aufgenommen werden, wenn ausschließlich Abbildung 7.8 betrachtet wird. Möglicherweise ist sie in der Natur nicht relevant oder verläuft eher über die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen.

In der Literatur finden sich einige Hinweise auf die Bevorzugung von Heterotetrameren gegenüber homotetrameren Komplexen. Das Drosophila Protein TRPL interagierte bevorzugt mit TRP anstatt mit anderen TRPL-Proteinen (Xu et al., 1997), und auch TRPγ bildete in erster Linie Heterotetramere mit TRPL und nur in geringem Maß TRPγ-Homotetramere (Xu et al., 2000). Die resultierenden Kanäle stimmen mit den in Drosophila Photorezeptoren gefundenen gut überein (Xu et al., 1997; Xu et al., 2000) (siehe Kapitel 2.4.3). Auch für TRPC-Proteine gibt es bereits Hinweise auf eine Bevorzugung von Heterotetrameren.

Groschner et al. stellten bei ihren Untersuchungen fest, dass untransfizierte HUVEC-Zellen einen deutlichen SOC zeigen, wohingegen HEK293 nur einen geringen endogenen SOC aufweisen. Dabei wird hTRPC3 in HUVEC-Zellen nur wenig exprimiert, in HEK293-Zellen scheint es aber die dominante Form zu sein. Das spricht gegen eine Rolle von hTRPC3-Homotetrameren bei dieser Art von Strom. Also ist die Bildung von Heterotetrameren sehr