mTRPC1β interagiert über seinen N-Terminus mit zellspezifischen

8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen

8.5 mTRPC1β interagiert über seinen N-Terminus mit

8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen PLC-β NORPA („no receptor potential“) zusammengebracht werden und zusammen mit dem Rezeptor Rhodopsin, dem angekoppelten G-Protein in spezielle Membrandomänen lokalisiert sind (Clapham, 1996; van Huizen et al., 1998). Darüber hinaus werden TRPL-enthaltenden Kanäle direkt durch ein rezeptorgekoppeltes Gα -Protein der Gq-Unterfamilie unabhängig von Speicherentleerung aktiviert (Obukhov et al., 1996) und durch Calmodulin in calciumabhängiger Weise inhibiert (Warr et al., 1996; Trost et al., 1999). Im Fall der TRPC-Proteine ist bisher v.a. die Interaktion mit dem IP3-Rezeptor eingehend untersucht worden (siehe Kapitel 2.5.2), die sich bei TRPC1 in menschlichen Blutplättchen als reversibel und durch Aktivierung der Zellen sowie das Actincytoskelett gesteuert herausstellte (Rosado &

Sage, 2000-b; Rosado & Sage, 2001; Rosado et al., 2000-a; Rosado et al., 2002), im Fall von TRPC3 jedoch konstitutiv zu sein schien (Lockwich et al., 2001). Prinzipiell können alle TRPC-Proteine mit dem IP3R und auch mit Calmodulin direkt interagieren, jedoch mit unterschiedlichen Affinitäten (Boulay et al., 1999), was auf unterschiedliche, sich überschneidende Aktivierungsmechanismen schließen lässt (siehe Kapitel 2.5.2). Bisher sind allerdings noch keine Adaptermoleküle identifiziert worden, die TRPC-Proteine mit anderen Signalmolekülen verknüpfen, mit Ausnahme des Na -H -Austausch-regulierenden-Faktors („Na -H -exchange regulatory factor“, NHERF), das wie INAD PDZ-Domänen enthält und sowohl TRPC4 und TRPC5 als auch PLCβ1 und 2 bindet (Tang et al., 2000). Es ist sehr wohl möglich, dass die TRPC-Proteine entsprechend der Subfamilie auf unterschiedlichen Wegen in den Signalkomplex integriert werden, jedoch sind auch die im Rahmen der veröffentlichten Experimente untersuchten Spleißvarianten zu bedenken. Die Regulation durch alternatives Spleißen könnte nicht nur die Interaktion mit dem IP3R (Mery et al., 2001) oder mit Calmodulin (Yildirim et al., 2003) beeinflussen, sondern auch den Aufbau des Signalkomplexes. Die für die Interaktion mit NHERF oder anderen PDZ-Proteinen relevante Domäne eines TRPC-Proteins wurde bisher nicht identifiziert. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit findet die Interaktionen zumindest in B-Zellen nicht über den N-Terminus statt. Entweder wird NHERF in B-Zellen nicht gebildet oder es interagiert nicht mit dem N-Terminus von mTRPC1β.

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Die Lokalisation von TRPC-Proteinen in der Plasmamembran ist hinlänglich bekannt und für ihre Funktion als Ca -Einstromkanal unabdingbar. Dabei sind die Kanäle in spezifischen Membranmikrodomänen enthalten, die als Plattform für Moleküle der Signaltransduktion gelten (Lockwich et al., 2000). Zu diesen Mikrodomänen gehören die detergenzunlöslichen

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8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen intrazelluläre Signalwege beeinflussen (Felberbaum-Corti et al., 2003). Die Anwesenheit von TRPC1 in cholesterinhaltigen Plasmamembranmikrodomänen ist für die durch Speicherentleerung induzierte Kanalaktivität essentiell, da nach Auslösen des Cholesterins aus den „Lipid Raft“ Domänen der TRPC1-vermittelte Ca -Einfluss deutlich verringert war (Lockwich et al., 2000). TRPC1 konnte in HSG-Zellen zusammen mit Caveolin-1, Gα und IP3-Rezeptor Typ III in detergenzunlöslichen Membranmikrodomänen nachgewiesen werden (Lockwich et al., 2000). Mit Hilfe dieser „Lipid Raft“ Domänen in der Plasmamembran können also die Schlüsselproteine für die Ca -Signalleitung wie der muskarinische Rezeptor, der Bradykinin-Rezeptor, Src-Protein Tyrosin Kinasen, Lck, Vav, Grb2, PLCγ1, Ras und für die Ca -Signalkaskade relevante Moleküle wie Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) assembliert und die molekularer Interaktionen, die zur Aktivierung von SOCE führen, koordiniert werden (Lin et al., 1999; Lockwich et al., 2000). Caveolae, ein Spezialfall dieser Lipiddomänen, sind kolbenförmige Einstülpungen in der Plasmamembran, die Caveolin-1 enthalten und viele Eigenschaften mit „Lipid Raft“ Domänen (Lipidfloß) teilen. Allerdings sind „Lipid Raft“ Domänen nicht eingestülpt und enthalten kein Caveolin. Caveolae spielen eine Rolle im Albumintransport, besitzen aber auch endocytotische Eigenschaften, wobei das pH-neutrale sogenannte Caveosom gebildet wird, das selbst keine Degradationsfähigkeit besitzt, jedoch die endocytierten Proteine unweigerlich dem Abbau zuführt (Felberbaum-Corti et al., 2003).

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Der Fund von Clathrin im Rahmen der Genbankdurchmusterung erstaunt zunächst, wurden doch zumindest TRPC1 und TRPC3 den Caveolae oder „Lipid Raft“ Domänen zugeordnet (Lockwich et al., 2000; Lockwich et al., 2001). Allerdings liegen mehrere Membranproteine in beiden Arten von Membranmikrodomänen vor wie z.B. der TGF-β Rezeptor, der so durch unterschiedliche endocytotische Wege verschiedene Signale in der Zelle auslösen und beeinflussen kann (Felberbaum-Corti et al., 2003). Das würde auch die widersprüchlichen Daten bezüglich der Assoziation von TRPC1 an Caveolin-1 erklären (Lockwich et al., 2000;

Singh et al., 2001-a; Friedrich, 2001). Der relative Anteil von Caveolae und Clathrin-bedeckten Gruben kann sich von Zelltyp zu Zelltyp unterscheiden, so dass Assoziationsnachweise von den verwendeten Zellen abhängen könnten. Während der Genbankdurchmusterung mit Hilfe des N-Terminus von mTRPC1β konnte Caveolin nicht gefunden werden. Das bedeutet, dass eine Interaktion von mTRPC1β und Caveolin entweder in B-Zellen nicht stattfindet oder dass sie über den C-Terminus von mTRPC1 geschieht. Eine für die Bindung relevante Domäne innerhalb von TRPC1 wurde bisher nicht beschrieben (Lockwich et al., 2000). In Leukocyten und speziell in B-Zellen ist Endocytose mittels

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8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen bedeckter Gruben („clathrin coated pits“, CCP) ein wohl studierter Prozess. Clathrin-bedeckte Vesikel („clathrin coated vesicles“, CCV) dienen dem rezeptorvermittelten Transport von Makromolekülen zwischen membrangebundenen Kompartimenten. In B- und T-Zellen werden v.a. rezeptorgebundene Antigene oder Immunglobulin-Antigen-Komplexe auf diese Weise internalisiert und nachfolgend verarbeitet. Die Internalisierung erfolgt dabei durch direkte oder indirekte Bindung der cytoplasmatischen Domänen eines Rezeptors an Clathrin-assoziierte Proteine. Nach der Quervernetzung der Adaptermoleküle kommt es zur Polymerisation von Clathrin, der die Vesikulation folgt. Anschließend kommt es zum Abbau der Clathrindecke, was der Fusion der Vesikel mit der Zielmembran und der Wiederverwertung der Clathrinmoleküle dient. Demnach können CCV auch dem Transport von Proteinen an die Zelloberfläche dienen (Pley et al., 1995; Felberbaum-Corti et al., 2003).

Clathrin könnte dem Transport von mTRPC1β in oder aus der Plasmamembran dienen, wodurch die Kanalaktivität dem Sekretionsähnlichen Modell folgend hoch- oder herunterreguliert werden könnte. LRD bzw. Caveolae und Clathrin-bedeckte Gruben stellen also zwei alternative Internalisierungswege dar, die die Bildung von zwei verschiedenen Proteinkomplexen zur Bedingung haben. Proteine, die in „Lipid Raft“ Domänen auf der Zelloberfläche oder in Caveolae lokalisiert sind, interagieren mit Smad7 und Smurf2 und sind letztlich zur Degradation bestimmt (Felberbaum-Corti et al., 2003). Dazu im Gegensatz steht die Rezeptorwiederverwertung innerhalb des Clathrinweges, die durch die Bildung eines Komplexes mit Smad2 und Sara bewerkstelligt wird, was sicherstellt, dass das Protein nicht abgebaut wird und in frühen Endosomen verbleibt (Felberbaum-Corti et al., 2003). Um weitere Hinweise auf die tatsächliche Lokalisation von TRPC-Proteinen zu bekommen, sollten Interaktionstest und Colokalisationsversuche mit den genannten Markierungsproteinen für die jeweiligen Membranmikrodomänen vorgenommen werden.

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Auch Calmodulin, das bekanntlich TRPC-Proteine negativ reguliert, bindet an CCV und die leichten Ketten von Clathrin in Ca -abhängiger Weise. Die Bindestelle für CaM liegt im C-terminalen Bereich von CLa (AS224-243) (Pley et al., 1995). Das hier gefundene CLa-Fragmente gibt keinen Aufschluss über die zur Interaktion mit mTRPC1β notwendige Domäne, da es die Aminosäuren 1-224 umfasst. Nur die letzten Aminosäuren am C-Terminus 225-236 spielen für die Assoziation an mTRPC1β-NT keine Rolle, so dass die Interaktionen von CLa mit TRPC1β und CaM nicht in Konkurrenz stehen.

8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen Eine andere Gruppe von Proteinen, die eine Rolle im Aufbau des Signalkomplex oder in der Lokalisation von TRPC-Proteinen haben könnten, sind die 14-3-3-Proteine. Man betrachtet die 14-3-3-Proteine als Adaptermoleküle („scaffolding molecules“), die Protein-Protein-Interaktionen, die intrazelluläre Proteinlokalisation und Enzymaktivitäten modulieren. Es gibt bisher sieben verschiedene 14-3-3-Proteine, sigma (σ), beta (β),epsilon (ε), eta (η), zeta (ζ), gamma (γ) und theta (θ) (Rajan et al., 2002), welches gelegentlich auch als tau (τ) bezeichnet und in Lymphocyten stark exprimiert wird (Foucault et al., 2002). Daher ist es nicht überraschend, dass gerade diese Isoform bei der A20-Genbankdurchmusterung gefunden wurde.

Die Bindung an 14-3-3-Proteine führt oft zu veränderter subzellulärer Lokalisation, wobei v.a.

der Transport ins Cytoplasma durch Blockieren von Signalsequenzen wie der NLS („nuclear localization sequence“) oder der NES („nuclear export sequence“) gefördert wird, wie im Fall des proapoptotischen Proteins BAD, der Zellzyklus-regulierenden Phosphatase Cdc25, der Protein Kinase Uα, der Transkriptionsfaktoren FKHRL1, MSN2 und MSN4 oder des Kernfaktors aktivierter T-Zellen („nuclear factor for activated T cells“, NFAT) (Kurz et al., 2000; Muslin & Xing, 2000). Sie können aber auch die Kernlokalisation ihrer Partner fördern, z.B. die der katalytischen Untereinheit der Telomerase (TERT) oder von Tlx-2 (Kurz et al., 2000; Muslin & Xing, 2000). 14-3-3σ schützt vor Apoptose durch Bildung eines Komplexes mit Bax und CDK1. Infolgedessen wird Bax schnell aus dem Cytoplasma transportiert (Laronga et al., 2000; Temesgen et al., 2001). 14-3-3-Proteine verhindern zudem die Translokation von PKCθ zur Plasmamembran, wodurch sie auch in Lymphocyten an der Signaltransduktion beteiligt sind (Foucault et al., 2002). Für den Transport der Zwei-Poren-Domänen Kaliumkanäle (K -Kanäle) TASK-1, 3 und 5 in die Plasmamembran ist die Interaktion mit einem 14-3-3-Protein über ihre C-terminale Domäne essentiell (Rajan et al., 2000). Es ist daher gut möglich, dass die 14-3-3-Isoformen epsilon und theta in die Translokation von mTRPC1β in die Plasmamembran von B-Zellen involviert sind, oder aber diese vor der Aktivierung der Zelle verhindern. Bemerkenswerter Weise werden TASK-1 und 3 durch die Aktivierung von heptahelikalen Rezeptoren, die an G- Proteine des αq/11-Untertyps gekoppelt sind, inhibiert (Rajan et al., 2000). Dabei handelt es sich um genau die Art von Rezeptoren, deren Stimulation in vielen Zellen zur Aktivierung von TRP(C)-Kanälen führt.

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In manchen Fällen, wie z.B. bei Ras oder KSR-1, hat die Bindung keinen Einfluss auf die Lokalisation, sondern wirkt auf andere Weise regulativ. Die Bindung an Ras ermöglicht die Aktivierung von Raf-1 durch Ras oder andere Proteine, wobei der genaue Mechanismus noch

8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen nicht bekannt ist. Zur Ras-vermittelten Aktivierung der Raf-1/ MEK/ERK MEPK-Kaskade ist diese Bindung auf jeden Fall notwendig. Es wird vermutet, dass Ras das 14-3-3-Protein von seiner Bindestelle an Raf-1 verdrängt und so zu dessen Aktivierung führt (Muslin & Xing, 2000; Foucault et al., 2002). Auch der cytoplasmatische Adaptor 3BP2 (SH3-Domänen-bindendes Protein, SH3BP2) wird durch Bindung an 14-3-3-Proteine inaktiviert, was die Aktivierung von Ras- und Calcineurin-abhängigen Signalwegen und daher die transkriptionelle Aktivität von NFAT und AP-1 negativ reguliert (Foucault et al., 2002). Die Ras-abhängigen Signalwege, die zu Aktivierung von NFAT führen, werden darüber hinaus durch die Interaktion von 14-3-3-Proteinen mit der katalytischen Untereinheit der PI3-K und dem Cbl-Protoonkogen reguliert (Bonnefoy-Bérard et al., 1995; Foucault et al., 2002). Die Interaktion mit PI3-K p110 ist in aktivierten T-Zellen schwächer als in ruhenden, so dass die enzymatische Aktivität von PI3-K während der rezeptorinitiierten Signaltransduktion reguliert wird (Bonnefoy-Bérard et al., 1995). 14-3-3-Proteine kontrollieren Apoptose außerdem, indem sie die Assoziation von BAD an Bcl-2 und Bcl-X verhindern (Kurz et al., 2000). 14-3-3-Proteine interagieren mit der Protein Kinase Raf-1, der Protein Kinase C (Kurz et al., 2000; Toker et al., 1992), deren Aktivität durch Bindung an 14-3-3σ und 14-3-3ζ erhöht (Dellambra et al., 1995) oder auch gesenkt (Toker et al., 1992) wird, sowie mit der Bcr-Kinase, deren Aktivität moduliert wird und die wiederum 14-3-3-Protein phosphoryliert (Reuther et al., 1994). 14-3-3-Proteine könnten eine ähnliche Rolle wie INAD in Drosophila Photorezeptoren spielen und als Gerüst zur Assemblierung eines Signalkomplexes dienen.

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Generell dienen 14-3-3-Proteine einer molekularen Einmischung in die Signaltransduktion, so dass sie eine regulatorische Rolle in der Signaltransduktion von Überlebenswegen wie Apoptose, Differenzierung und Zellzykluskontrolle spielen (Muslin & Xing, 2000).

Außerdem stimulieren sie die Ca²⁺-abhängige Exocytose (Bonnefoy-Bérard et al., 1995). Dies könnte in Zusammenhang mit der Interaktion von mTRPC1β mit Clathrin stehen.

Möglicherweise regulieren die 14-3-3-Proteine einen sekretionsähnlichen Transport von TRPC-Kanälen in die Plasmamembran nach Stimulation der Zellen und Freisetzung von Ca²⁺

aus intrazellulären Speichern.

Die Bindung an 14-3-3-Proteine ist allerdings kein konstitutives und statisches Ereignis, sondern unterliegt der Regulation durch Phosphorylierung. Eine Phosphorylierung des Partnerproteins stärkt zumeist die Bindung (Liu et al., 1999), wohingegen die Phosphorylierung von 14-3-3 selbst die Bindung des öfteren schwächt (Megidish et al., 1998). Für die phosphorylierungsabhängige Assoziation an 14-3-3-Proteine wurde die

8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen enthält die Sequenz LSGVSSSSLPSSPSSSSP (AS 27-36), die Ähnlichkeit zur Consensus-Sequenz besitzt. X ist in diesem Fall GV und L, R fehlt allerdings. Auch im N-Terminus von mTRPC2 ist ein ähnliches Motiv enthalten, und zwar RSLSNSSSQP, mit L und Q als X und einem insertierten N. Das Motiv liegt jeweils vor der ersten Ankyrin-ähnlichen Wiederholung und ist daher in allen von TRPC1 bekannten Spleißvarianten vorhanden, kommt allerdings nur in den Spleißvarianten AF111107 (AS und 94-103) und AF111108 (AS 194-203) von mTRPC2 vor (Vannier et al., 1999), nicht aber in den kürzeren Varianten (Hofmann et al., 2000-a). In TRPC3, 4, 5 , 6 oder 7 liegt keine ähnliche Sequenz vor. Das im Rahmen dieser Arbeit als Interaktionspartner gefunden 14-3-3θ-Protein zeigt eine leichte Bevorzugung für die N-Termini von mTRPC1β und mTRPC2β, die 14-3-3- Isoform ε interagiert im Y2HS nur mit den N-Termini von mTRPC1β und hTRPC3. Die tatsächlich für die Interaktion relevante Sequenz muss also noch bestimmt werden.

Bisher weniger genau untersucht ist der Interaktionspartner FGD-2, einen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor („guanine nucleotide exchange factor“, GEF), dessen homologes Protein FGD-1 bei der Erforschung der „faciogenital dysplasia“ entdeckt wurde. Die genauen Interaktionspartner von FGD-2 sind bisher noch unbekannt, aber es wird angenommen, dass es sich um Rho-GTPasen handelt wie im Fall von FGD-1 (Pasteris & Gorski, 1999). Die FGD-Proteine enthalten eine FYVE-Finger-Domäne, die als Proteinstruktur mit hoher Bindungsspezifität für das Membranlipid Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI3P) identifiziert wurde, welches für den vesikulären Transport wichtig ist (Gaullier et al., 1998). Dadurch könnte FDG-2 in Verbindung mit dem Transport von TRPC-Kanälen in die Plasmamembran entsprechend dem Sekretionsähnlichen Aktivierungsmodell stehen. Auch könnte FGD-2 die TRPC-Kanäle in B-Zellen mit Signaltransduktionswegen verknüpfen, die kleine G-Proteine involvieren. Möglicherweise bewirkt die TRPC-Kanalöffnung eine Konformationsänderung in FGD-2, die zur Aktivierung von G-Proteinen weiter „down-stream“ in der Signalkaskade führt. Dadurch würden TRPC-Proteine nicht nur durch Einlass von Ca in die Zelle, sondern auch auf anderem Wege aktivierend in Bezug auf Differenzierung und Proliferation von B-Zellen wirken. FGD-1 aktiviert z.B. durch Cdc42 die c-Jun N-terminal Kinase (JNK) Signalkaskade, einen Weg, der Zellwachstum und Differenzierung reguliert. Cdc42, Rac und Rho wiederum sind Ras-ähnliche GTP-bindende Proteine, die neben der Zellzyklusprogression und der Modulation der Genexpression auch die Cytoskelettorganisation und den vesikulären Transport regulieren (Pasteris & Gorski, 1999).

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8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen FGD-2 könnte auch durch Aktivierung dieser GTPasen in die Regulation der Lokalisierung von TRPC-Proteinen involviert sein.

TRIM27, auch als „ret finger protein“ (RFP) bekannt, ist durch ein Tripartit-Motiv gekennzeichnet, das aus einem RING-Finger, einem B-Box-Finger und einer „coiled-coil“-Domäne besteht. Während RING-Finger und B-Box die subzelluläre Kompartimentation von TRIM27 beeinflussen, dient die „coiled-coil“-Domäne der Homodimerisierung (Cao et al., 1997). Zunächst sollte daher ausgeschlossen werden, dass die Bindung an der ebenfalls eine

„coiled-coil“-Domäne enthaltenden N-Terminus von mTRPC1β ein Artefakt ist. Daher sollte die gemeinsame Lokalisation von mTRPC1β und TRIM27 in B-Zellen oder einem anderen Säuger-Expressionssystem nachgewiesen werden. Die Lokalisation im Cytoplasma oder im Zellkern hängt vom Zelltyp ab. TRIM27 besitzt ein Kernexportsignal (NES), das in der

„coiled-coil“-Domäne liegt. Die Bindung verschiedener Proteine kann das NES maskieren und so den Export verhindern, wohingegen PKC den Export fördert (Habers et al., 2001). Im Cytoplasma ist TRIM27 ist punktuell lokalisiert, allerdings auf Grund der fehlenden Colokalisation mit Transferrin vermutlich nicht in Wiederverwertungsendosomen („recycling endosomes“) (Reymond et al., 2001). Wenn in B-Zellen das NES nicht durch ein spezifisch exprimiertes Protein maskiert ist, sollte eine Interaktion mit mTRPC1β prinzipiell möglich sein.

TRIM-Proteine sind in die verschiedensten Prozesse wie Proliferation und Differenzierung verwickelt. TRIM27 wird onkogen, wenn die Tripartit-Domäne mit der Tyrosinkinase des ret-Protoonkogens kombiniert wird (Cao et al., 1997; Cao et al., 1998; Reymond et al., 2001).

Die Expression von TRIM27 kann, wie im Fall von HEK293-Zellen Apoptose auslösen (Do

& Kwon, 2003), was diese Zellen als Testsystem ausschließt. TRIM27 aktivierte in HEK293-Zellen JNK und die p38-Kinase und erhöht auch die Caspase-3-ähnliche Aktivität. TRIM27 steuert daher einen neuen Todessignalweg, der MAP-Kinasen und Caspasen unabhängig von mitochondriellen Ereignissen rekrutiert (Do & Kwon, 2003). Möglicherweise verhindert TRIM27 in B-Zellen nach Rezeptorstimulation und Ca -Einfluss die Apoptose. Nach Überprüfung der Assoziation von TRIM27 an mTRPC1β in einem Säugerzellsystem, sollte die Rolle von TRIM27 in der B-Zell-Aktvierung ergründet werden.

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Über die Funktion des Cytokinrezeptor-ähnlichen Faktor 3 (CRLF3) und des PKC-bindenden Proteins 1 (PKCBP1) kann nur vage spekuliert werden, da zu beiden Proteinen über die

8 Diskussion 8.5 TRPC1β interagiert mit zellspezifischen Adapterproteinen 2001). Das PKCBP1 könnte ähnlich wie RACK der Verankerung von aktivierten PKC-Isoenzymen dienen, sie mit dem TRPC-Kanal verknüpfen und in den Signalkomplex integrieren. Der CRLF3 könnte TRPC-Kanäle alternativ zum BCR bei die B-Zellaktivierung mit Hilfe von Cytokinen wie den Interleukinen IL-4, IL-6, IL-7 IL-13 oder dem CD40-Ligand stimulieren. Die Rolle dieses neuen Proteins in der cytokingesteuerten B-Zell-Aktivierung und eine Stimulierung von TRPC-Kanälen muss noch untersucht werden.

8.6 Zusammengefasstes Modell und Hypothese der Aktivierung von