1 Abkürzungen und Akronyme
7.4 Interaktion von TRPC1β-NT mit bisher unbekannten Partnern
7.4.2 Erste Untersuchung einiger Interaktoren von mTRPC1β-NT
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern Aktivierung der Reportergene nicht vollständig ausgeschlossen werden konnte, wurden vermerkt und zunächst weiter zusammen mit den sicher positiven Klonen untersucht. Die Plasmid-DNA wurde aus den Hefezellen isoliert, das Genbank-Plasmid pYESTrp durch Transformation von E. coli KC8 selektioniert und die Plasmid-DNA aus den E. coli-Zellen aufgereinigt. Anschließend wurden die Klone durch Spaltung mit der zur Klonierung verwendeten Restriktionsendonuklease BstX I klassifiziert, eventuelle Mischkulturen in Einzelklone getrennt und Klone, die durch spontane Mutation auf dem TRP-Mangelmedium überleben konnten, ausgeschlossen. Die einzelnen Plasmidklone wurden in Doppelbestimmungen auf mögliche Autoaktivierung der Reportergene in Abwesenheit des Interaktionspartners mTRPC1β-NT untersucht, wobei sich das Feld auf 41 sicher positive Klone und 21 indifferente Kandidaten verringert. Die unsicheren Klone wurden erneut vermerkt und zunächst weiter untersucht. Alle übriggebliebenen Plasmideinzelklone wurden in Doppelbestimmung erneut einem Standard Interaktionstest mit mTRPC1β-NT unterzogen.
Nur noch 44 Klone stellten sich als echt positive Interaktoren heraus, so dass deren DNA sequenziert und das Gen bzw. das Protein identifiziert wurde. Alle interagierenden Genprodukte sind in Anhang 10.3.1 dargestellt.
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern
Tabelle 7.4: Auswahl möglicherweise biologisch relevanter Interaktionspartner der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne von mTRPC1β (mTRPC1β-NT)
Die im Weiteren verwendeten Abkürzungen sind hervorgehoben. Das 14-3-3 theta Protein liegt in zwei verschiedenen Klonen vor, die im Fettdruck markiert sind. Die zweite Kopie des Rootletin-Klons (089) ist nicht aufgeführt, da es sich um das gleiche Fragment handelt.
Klon-Nr. identifiziertes Protein oder Genprodukt Klassifizierung
068 Mus musculus Clathrin, leichte Kette Isoform a (CLa) Adapater
102 Mus musculus Rootletin; alternativ: Mus musculus ähnlich zu KIAA0445 Genprodukt [Homo sapiens] (LOC230872)
Cytoskelett
107 Mus musculus „tripartite motif“ Protein 27, auch mus musculus RFP (DNA-bindendes Protein, Ret Finger Protein, Zinkfingerprotein)
Adapter
123 Mus musculus Tropomodulin 3 (Tmod3) Cytoskelett
157 Mus musculus Tyrosin-3-monooxygenase/Tryptophan-5-monooxygenase Aktivierungsprotein, epsilon Polypeptid (Ywhae) ; alternativ: Mus musculus 14-3-3 Protein epsilon Isoform
Adapter
217 Protein Kinase C bindendes Protein 1 (Isoform 2) Fragment (PKCBP1/2) Adapter 218 Mus musculus Cytokinrezeptor-ähnlicher Faktor 3 (Crlf3); alternativ:
Mus musculus Cytokinrezeptor verwandtes Protein 4 (Cytor4); Mus musculus ähnlich zu Cytokin Rezeptor-ähnlichem Molekül 9
Rezeptor
230 Mus musculus Tyrosin-3-monooxygenase/Tryptophan-5-monooxygenase Aktivierungsprotein, theta Polypeptid (Ywhaq); alternativ: Mus musculus 14-3-3 Protein theta Isoform
Adapter
254 Mus musculus Tyrosin-3-monooxygenase/Tryptophan-5-monooxygenase Aktivierungsprotein, theta Polypeptid (Ywhaq); alternativ: Mus musculus 14-3-3 Protein theta Isoform
Adapter
265 Mus musculus FGD1 Familie, Mitglied 2 (FGD2); alternativ: Mus musculus „Faciogenital Dysplasia“ Protein 2
Adapter
Aus der Menge der potentiellen Interaktoren stechen allerdings die 14-3-3 Proteine hervor.
Drei der Genbankklone repräsentieren 14-3-3 Proteine, davon zwei die theta- und einer die epsilon-Isoform. Die 14-3-3 Proteine wurden von Moore und Perez entdeckt und erhielten ihren sonderbaren Namen auf der Basis ihrer Fraktionsnummer bei DEAE-Cellulose-Chromatographie und ihrer Migrationsposition in der Stärkegelelektrophorese (Moore &
Perez, 1967; Muslin & Xing, 2000). Die 14-3-3 Proteine bilden eine Familie hochkonservierter Proteine, die in großer Menge in allen eukaryotischen Zellen vorhanden sind und stark saure Dimere bilden. Sie dienen als Vermittler in Signaltransduktion, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Stressantwort und maligner Transformation durch Bindung an
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern Protein-Proteininteraktionen, die subzelluläre Lokalisation von Proteinen sowie Enzymaktivitäten modulieren (Foucault et al., 2002; Muslin & Xing, 2000). Bisher sind sieben Isoformen bei Mensch und Maus bekannt, und zwar σ, β (= α), θ (= τ), ε, η, ζ (= δ) und γ. Speziell die 14-3-3θ-Isoform ist in Lymphocyten in großem Überschuss exprimiert (Foucault et al., 2002) und es liegen Hinweise für ihre Beteiligung an der Signaltransduktion in Lymphocyten vor (Meller et al., 1996).
Ebenfalls wurde die Isoform a der leichten Kette von Clathrin identifiziert. Clathrin ist namensgebend für die „Clathrin-coated pits“, die eine zentrale Rolle bei der Rezeptor-aktivierten Endocytose, beispielsweise von Antigen-Antikörper- oder Antikörper-Fc-Rezeptor-Komplexen, spielen. Säugerzellen exprimieren die zwei homologen leichten Ketten LCa & LCb („Light Chain a/b“), die auch als Clathrin leichte Kette a oder b (CLa/b) bezeichnet werden und deren Expression gewebespezifisch ist. Die leichten Ketten a und b von Clathrin tragen zur Sortierung von Proteinen bei der Rezeptor-vermittelten Endocytose und der Organellenbiosynthese und so zur Regulation der Bildung der Clathrin-beschichteten Gruben („Clathrin-Coated Pits“, CCP) bei (Chen et al., 2002).
Des weiteren gehört zu den Interaktoren der Cytokinrezeptor-ähnliche Faktor 3 („Cytokine receptor-like factor 3“, Crlf3), der auch als Cytokinrezeptor verwandtes Protein 4 („Cytokine receptor-related protein 4“, Cytor4) oder Cytokinrezeptor-ähnliches Molekül 9 („Cytokine receptor-like molecule 9“, Creme9) bezeichnet wird. Das Protein besitzt eine N-terminale Fibronektin Typ III Domäne und ein WSXWS box-ähnliches Motiv (AS 258-262 mit X = P), aber abgesehen von der Sequenzhomologie zu bekannten Cytokinrezeptoren liegen über Crlf3/Cytor4/Creme9 keine Informationen vor.
Ein weiterer Interaktor ist das FGD2 Protein. Mutationen im humanen Gen von FGD1 resultieren in der Faciogenitalen Dysplasie („Faciogenital Dysplasia“, FGDY), einer X-Chromosom-abhängigen Entwicklungsstörung (Aarskog Syndrom) die die Bildung von vielfältigen Skelettstrukturen nachteilig beeinflusst. Bei Mensch und Maus wurden bisher FGD1, 2 und 3 nachgewiesen. Alle Mitglieder der FGD-Familie besitzen equivalente Signaldomänen, einen konservierten strukturellen Aufbau und sind Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die kleine G-Proteine der Ras-Homologie-Familie (Rho) aktivieren (Pasteris & Gorski, 1999). Alle RhoGEFs einschließlich der FGD-Proteine besitzen eine 210 Aminosäuren lange RhoGEF-Domäne und eine sofort anschließende
Pleckstrin-7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern Homologiedomäne (PH). FGD2 weist darüber hinaus eine zweite C-terminale PH-Domäne und eine sogenannte FYVE-Domäne auf. Dabei handelt es sich um ein cysteinreiches evolutionär konserviertes Zinkfingermotiv, das ähnlich wie PH-Domänen mit Phosphatidylinositollipiden interagiert und selektiv Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI3P) bindet. Im Gegensatz zu FGD1 besitzt FGD2 zusätzlich eine N-terminale prolinreiche Region (Pasteris & Gorski, 1999).
Unter den potentiellen Interaktionspartnern von mTRPC1β über dessen N-Terminus ist die Isoform 2 des Proteinkinase-bindenden Proteins 1 (PKCBP1/2), das zu 87 % identisch ist zum menschlichen RACK-ähnlichen Protein 1 (PRKCBP1). Die Rezeptoren für die aktivierte C Kinase (RACK) Familie dienen als Anker für aktivierte Protein Kinase C (PKC) Isoenzyme. Über das Maus-Protein PKCBP1 liegen bisher keine Daten vor, jedoch wurde die mögliche Beteiligung des menschlichen Proteins PRKCBP1 an der Entstehung von Diabetes Typ II untersucht und ausgeschlossen (Fossey et al., 2000).
Außerdem wurde Rootletin gefunden, das bisher nur von Yang et al. als strukturelle Komponente der Wurzelfaser in bewimperten Zellen beschrieben wurde (Yang et al., 2002).
Der Nachweis der Expression in B-Zellen ist daher eine Überraschung. Rootletin ist ein 220 kDa Protein, das eine globuläre Kopfdomäne und einen schwanz besitzt, welcher aus einer ausgedehnten „coiled-coil“-Struktur besteht. Das Protein bildet parallele Homodimere und lange hoch geordnete polymere variabel geformte dicke detergenzunlösliche Filamente, die durch die Schwanzdomäne allein vermittelt werden.
Ein weiterer Interaktionspartner ist TRIM27 (rfp). Das „ret finger protein“ (rfp) ist ein Mitglied der „tripartite motif“ (TRIM) Familie (Cao et al., 1997) und wird daher auch als TRIM27 bezeichnet (Reymond et al., 2001). Das Tripartit-Motiv besteht aus einem RING Finger, einem B Box Finger und einer „coiled-coil“ Domäne, zusammengefasst auch als RBCC bezeichnet (Do & Kwon, 2003). TRIM27 homodimerisiert über seine „coiled-coil“
Domäne, die B Box ist indirekt notwendig für die Interaktion. Sowohl der RING Finger als auch die B Box sind wichtig für die Lokalisierung von TRIM27 in subzellulären Kompartimenten.
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern Zudem wurde die Isoform 3 von Tropomodulin (Tmod3) gefunden. Tropomoduline (Tmod 1- 4) sind eine Familie von Tropomyosin-bindenden Proteinen, die zellspezifisch exprimiert werden und die spitzen, d.h. langsam wachsenden, Enden von Actinfilamenten (F-Actin) kappen, indem sie sowohl an Tropomyosin (TM) als auch direkt an Actin binden und die Kopf-an-Schwanz-Assoziation von TM entlang der Actinfilamente blockieren (Sung et al., 1992). Dadurch wird die konstante Menge an TM-enthaltenden Actinfilamenten, die Länge der dünnen Filamente die Sarcomerorganisation und die kontraktile Funktion erhalten (Fowler, 1996; Littlefield & Fowler, 1998). Tropomodulin 3 wird im Gegensatz zu den übrigen Isoformen ubiquitär exprimiert (Cox & Zoghbi, 2000). Tropomoduline bestehen aus zwei Hauptdomänen, der N-terminalen tropomyosinbindenden Hälfte (Babcock & Fowler, 1994), und aus der C-terminalen unabhängig gefalteten actinbindenden Hälfte (Gregorio et al., 1995). In den immunologisch relevanten Geweben des Menschen Milz, Thymus und Leukocyten ist TMOD3 nur relativ schwach exprimiert (Cox & Zoghbi, 1999; Cox & Zoghbi, 2000; Fowler et al., 2003). Über die Expression in B-Zellen liegen keine Daten vor.
Möglicherweise erfolgt die Interaktion mit der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne von mTRPC1β über ein bestimmtes Aminosäuremotiv. Daher wurde zunächst mit Hilfe von Datenbanken nach konservierten Domänen in der gefundenen Fragmenten gesucht. Das Ergebnis ist in Tabelle 7.5 und 7.6 dargestellt. Alle Proteine besitzen mindestens eine Proteinkinase C- (PKC) und Casein Kinase II- (CK II) Phosphorylierungsstelle, darüber hinaus unterscheiden sie sich deutlich voneinander. Um die mögliche Homologie genauer zu analysieren, wurde ein ausführlicher Sequenzvergleich durchgeführt, der in den Abbildungen 7.14 und 7.15 dargestellt ist. Ein eindeutiges Motiv oder eine charakteristische Sequenz kann nicht identifiziert werden, allerdings sind einige konservierte Aminosäuren vorhanden.
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern
Tabelle 7.5: Häufige auftretende konservierte Domänen der Interaktionspartner von mTRPC1β-NT Die in der Genbankdurchmusterung gefundenen Fragmente wurden mit der Datenbank
„ProSite“ verglichen. Die entscheidenden Aminosäurereste sind durch Großbuchstaben gekennzeichnet.
Fragment N-Glyco- sylierungs- stelle
Tyrosin- Sulfatidierungs- stelle
PKA-Phospho.
Stelle
PKC- Phospho.
Stelle
CK II Phospho.
Stelle
Tyr-Kinase Phosph.
Stelle
N-myristy- lierungs- stelle
14-3-3ε NFSV laerqaerYdmvesm RRaS SmK +
SwR TveE + SsiE + TgnD
Kmkg
DyhrY GArrAS + GLalNF 14-3-3θ NATN +
NFSV + NLTL
laerqaerYdacm + dtlnedsYkdstlim
RKqT SdK + SkK + SyK
SneE + SsiE + TvlE + SkkE + TafD + TlnE + SykD
kmkg DyfrY
GAelSN + GGrrSA + GLalNF
Cla SiR +
TeR + SrK + SsK
SevD + SepE + TewE
KelEewY GApaGA + GNgvAG + GVagAG + GGpdAV + GVmnGE
Crlf-3 NFTK KKaS SyR +
TiK + SdK + TkK
TadD +
SlpE GLreAQ +
GVntAD + GTvaSR
FGD2 NISS SlK +
TpR TpgE + SleD + TwmD PKCBP1 NTTG +
NTSY + NKSS + NSSN + NSTL + NQSS
TsK +
TkK + SkR
TmtE + TiaE + TmaE + SycD + StlD + TttD
GStiAE +
GNksSQ + GNssNT + GSnqSS
rootletin RRlS +
RRqS + RRsS
SvR + SkR + SdK + SiK + TlR + TlR + TeR + TlK
SkrE + TesE + SltD + StqD + StcE + SlgE + SheD + TgaE + SglE
GNlrSK
TRIM27 NVTE TeK +
TeR
SdmE GGvtSA
TMOD3 NKTL + NETL
SlK +
TlK + TlK
TltE + SasD + SdtE + TnvE + TlkD + TlmE + TsvE
GSsnGV
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern
Tabelle 7.6: Seltene auftretende konservierte Domänen der Interaktionspartner von mTRPC1β-NT Die in der Genbankdurchmusterung gefundenen Fragmente wurden mit der Datenbank
„ProSite“ verglichen. Die entscheidenden Aminosäurereste sind durch Großbuchstaben gekennzeichnet.
Fragment Spezielle Domänen 14-3-3ε 14-3-3-Protein Signatur:
RNLLSVAYKNV 14-3-3θ 14-3-3-Protein Signatur:
RNLLSVAYKNV Amidierungsstelle:
gGRR CLa Clathrin leichte Kette Sig.:
FLAQQES
Crlf-3 -
FGD2 DH2 Domäne
EEKRVVRELLETEQAYVARLHLLDQV FFQELLREAGRskAFPEDVVKLIFSNISS IYRFHAQFFLPELQRRVDDWAATPRIG DVIQKLAP–FLKMYSEYVKNFERAAE LLATW MDKSQPFQEVVTRIQCSEAsS SLTLQHHMLEPVQRIPRYELLLKEYVQ KLPAQAPDLEDAQRALDMIFSAAQHS NAA
PKCBP1 Zink-Finger MYND-Typ:
Can - - Ckkeaify- - - - C- - CwntsYCdypCqqahw p e- - Hmks - C
+
CANCKKEAIF-YC- -CWN TSYCDYPCQQAHWPEH MKSC
Serin-reiche Region:
Ssqgnssntqsapsepasapkekeapaek skdssnstldlsgsretpssmllgsnqssvS
Rootletin Zell-Anheftungssequenz:
RGD
Leucin-„Zipper“:
LqeerrlLqerlgsLqralaqL + LqerlgsLqralaqLeaekrdL
Glutamin-reiche Region:
Qvlqerldaarqalsearrqssslgeqvqtlrgelaslelqrg daegqlqqlqqalrqrqegeamalrsvqklqeerrllqerl gslqralaQ
TRIM27 “Microbodies” C-term.
Zielsignal:
SHA
Leucin-„Zipper“:
LkeyvqkLpaqapdLedaqraL
TMOD3 -
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern
Verwendet wurden nur die natürlicherweise translatierten Bereiche der Genbankfragmente.
Sequenzvergleich durchgeführt mit ClustalW, Darstellung bearbeitet mit GeneDoc. 100 % , 80 % und 60 % konserviert
Abbildung 7.14: Sequenzvergleich der Interaktoren hinsichtlich der Identität
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern
Abbildung 7.15: Sequenzvergleich der Interaktoren hinsichtlich Physiochemischer Eigenschaften Enthalten sind nur die natürlicherweise translatierten Bereiche der Genbankfragmente.
Sequenzvergleich durchgeführt mit ClustalW, bearbeitet mit GeneDoc. Prolin, Glycin, sehr klein, klein, positiv, negativ, geladen, amphoter, polar, aliphatisch, aromatisch, hydrophob
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern
Auf Grund der Tatsache, dass in kaum einem Gewebe nur eine einzige TRPC-Isoform exprimiert wird, wäre es interessant zu wissen, ob die verschiedenen Isoformen mit unterschiedlichen Adapter- und Cytoskelettproteinen interagieren und somit unterschiedlich reguliert werden. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass die Interaktion mit den Adaptor- und Cytoskelettproteinen durch eine der N-terminalen Domänen bewerkstelligt wird, entweder durch die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen oder die „coiled-coil“-Domäne.
Daher wurden die bei der A20-cDNA-Genbank-Durchmusterung gefundenen Interaktoren von mTRPC1β-NT einem Y2HS-Test mit dem N-Terminus von mTRPC2β und hTRPC3 sowie mit den Deletionsmutanten von mTRPC1β-NT unterzogen. Das Ergebnis ist Tabelle 7.7 zu entnehmen. Die gefundenen Proteine interagieren unterschiedlich mit den verschiedenen TRPC-Isoformen und –Deletionsmutanten. Die Stärke der Bindung wird aus der relativen Aktivierung des lacZ-Gens geschlossen (Brentlab, 2001; Clontech, 2001-a;
Invitrogen, 2002-a). Als negativ wurde das Signal der nicht-stattfindenden Interaktion von mTRPC1bβ-NT mit mTRPC1β-CT definiert, als Mindestsignal für ein positives Resultat wurde die Homodimerisierung von mTRPC1β-NT gesetzt (+), alles darüber hinausgehende verglichen und mit (++) oder (+++) bezeichnet.
Die leichte Kette von Clathrin interagiert nur mit mTRPC1β und mTRPC2β, wobei sowohl die ank- als auch die cc-Domäne relevant sind. FGD-2 interagiert ebenfalls nicht mit hTRPC3 und die Bindungsstärke nimmt ebenfalls ab, wenn die N-terminalen Domänen deletiert sind.
Fehlt die „coiled-coil“-Domäne von mTRPC1β, ist die Interaktion mit Rootletin, das selbst eine cc-Domäne besitzt, unterbunden. Darüber hinaus assoziiert auch Rootletin nicht an den N-Terminus von hTRPC3. Tropomodulin 3 bindet ebenfalls nicht an hTRPC3-NT, allerdings stärker an mTRPC2β-NT als an mTRPC1β-NT. Durch das Fehlen der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen wird die Bindung geschwächt, durch die Deletion der „coiled-coil“-Domäne wird sie vollständig unterbunden. Die theta Isoform der 14-3-3 Proteine bindet wesentlich stärker an TRPC-Proteine als die epsilon-Form und ist nicht auf eine bestimmte Domäne zurückzuführen. Dabei ist die Bindung des längeren 14-3-3θ-Fragmentes (Klon 230) an mTRPC1β-NT deutlich stärker als die des kürzeren (Klon 254). Allerdings kann nicht entschieden werden, ob es an den zusätzlichen C-terminalen Aminosäuren (AS 214 bis 230) liegt oder an den zusätzlichen N-terminal translatierten Aminosäuren (AS – 26 bis – 19), die in der Natur vor dem Startcodon liegen.
Obwohl im Y2HS zwei Proteine künstlich in räumliche Nähe gebracht werden und obwohl in
7 Ergebnisse 7.4 Interaktion von TRPC1-NT mit bisher unbekannten Partnern sehr gute Möglichkeit unbekannte Interaktionspartner zu finden. Darüber hinaus kann durch Verwendung einer mit Hilfe von zufälligen Oligonukleotiden hergestellten Genbibliothek die Bindungsstelle auf das gefundene Fragment eingeschränkt werden.
Tabelle 7.7: Untersuchung der Interaktion der A20-Genbank-Interaktoren mit verschiedenen TRPC-Isoformen und Deletionsmutanten
S. cerevisiae [p8op-lacZ] wurde mit den verschiedenen BD-Konstrukten transformiert und anschließend mit den verschiedenen AD-Konstrukten. Die Homodimerisierung des N-Terminus von mTRPC1β diente zur Beurteilung der Reportergenaktvierung, die nichtstatt- findende Wechselwirkung von N- und C-Terminus von mTRPC1β als Negativvergleich. Das zur Durchmusterung der Genbank eingesetzte BD-Konstrukt ist in Fettdruck hervorgehoben.
Die Aminosäurereste der Fragmente sind in Klammern angegeben. Die normalerweise untranslatierten Aminosäuren der Genbankklone sind mit einem „-“ gekennzeichnet.
BD-Fusions-proteine („bait”)
AD-Fusionsprotein („prey”)
BD-mTRPC1β-NT (1 – 331) BD-mTRPC1β-NT∆ank(1-60/177-331) BD-mTRPC1β-NT∆cc(1-212(267-331) BD-mTRPC2β-NT (1 - 492) BD-hTRPC3-NT (1 – 340) AD-mTRP1β-CT (646 – 775) (Neg.) - - - AD-mTRP1β-NT (1 – 331) (Pos.) + + - ++ ++
AD-Clathrin leichte Kette a(-41 – 214) + - - ++ - AD-Cytokinrezeptor lf 3 (-18 – 180) +++ ++ - ++ -
AD-FGD2 (-5 – 318) ++ + + ++ -
AD-PKC bind. Protein 1 (584 – 842) + - - - - AD-Rootletin (1499 – 2010) ++ ++ - ++ - AD-Tropomodulin 3 (103 – 342) ++ + - +++ - AD-14-3-3 theta (-26 – 230) +++ +++ +++ +++ ++
AD-14-3-3 theta (-18 – 213) ++ ++ + ++ -
AD-14-3-3 epsilon (-5 – 190) + - - - +
8 Diskussion __
8 Diskussion
Nach Stimulation von G-Protein-gekoppelten oder Tyrosinkinase-assoziierten Rezeptoren in einer Vielzahl von Zellen, darunter auch die verschiedenen Zellen des Immunsystems, kommt es zu einer Signalkaskade, die in den unterschiedlichen Zellen stark konserviert ist. Nach Aktivierung von Phospholipase C-Isoenzymen (PLC) wird membranständiges Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat in Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) gespalten. IP3 bindet an IP3-Rezeptoren des Endoplasmatischen Retikulums (ER), wodurch aus diesem intrazellulären Speicher Ca -Ionen ins Cytosol ausgeschüttet werden. Darauffolgend kommt es zu einem Einstrom von Ca -Ionen aus dem Extrazellularraum über die Plasmamembran, der für die Aktivierung der Zellen essentiell ist.
In Lymphocyten oder myeloiden Zellen wird dieser Modus der Ca -Eintritts durch Quervernetzung von BCR oder TCR durch Antigene oder von ITAM-haltigen Fc-Rezeptoren durch das jeweilige Immunglobulin aktviert. Vermutlich am besten charakterisiert ist das visuelle System in Drosophila melanogaster, in dem nach Reizung durch Licht der G-Protein-gekoppelte Rezeptor Rhodopsin die augenspezifische PLCβ-Isoform NORPA aktiviert, was wiederum Kanäle in der Plasmamembran anschaltet.
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Die moleku lare Identität der Kanäle, die diesen Einstrom ermöglichen, war zunächst nicht bekannt. In Drosophila Photorezeptoren wurde als geeigneter Kandidat das TRP-Protein entdeckt, das im Rahmen der Weiterleitung des Lichtsignals eine entscheidende Rolle spielt.
In Wirbeltieren und Wirbellosen konnten nachfolgend zahlreiche homologe Proteine identifiziert werden (Harteneck et al., 2000). Während in Drosophila melanogaster nur drei verwandte TRP-Proteine gefunden wurden (Xu et al., 2000; Adams et al., 2000), gibt es in Säugern zahlreiche Proteine mit Ähnlichkeit zum Drosophila TRP-Protein, die in drei Familien unterteilt wurden, TRPV, TRPM und TRPC. Die sieben Mitglieder der letzteren sind enger verwandt mit dem ursprünglichen TRP-Protein und stehen im Zentrum der Diskussion über die Identität des Ca -Kanals, der nach Rezeptorstimulation und Speicherentleerung in B-Zellen aktiviert wird.
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Ein Aminosäuresequenzvergleich der TRP-Proteine zeigte strukturelle Ähnlichkeit zu spannungsgesteuerten Ca -Kanälen in Form von sechs membrandurchspannenden Segmenten mit einer mutmaßlichen Porenregion zwischen dem fünften und sechsten Segment. Basierend auf dieser Analogie wurde außerdem angenommen, dass sich
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Funktionelle spannungsgesteuerte Ca -Kanäle hingegen sind monomere Proteine, die vier homologe interne Wiederholungen enthalten. Einige dieser Annahmen wurden inzwischen experimentell belegt.
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Nachdem die Lage der postulierten Domänen und die Membranständigkeit inzwischen bekannt sind und und bereits zahlreiche Hinweise auf eine tetramere Struktur vorliegen (siehe Kapitel 2.4.2 und 2.4.7), ist nun die Zusammensetzung von TRP-Tetrameren in Vertebraten Zellen, die in Drosophila Photorezeptoren geklärt zu sein scheint (siehe Kapitel 2.4.3), ins Interesse der Forschung gerückt.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 miteinander interagieren und dass für diese Assoziation der N-Terminus ausreichend ist.
Darüber hinaus konnten Hinweise gefunden werden, dass v.a. für mTRPC1β eine heterotypische Wechselwirkung gegenüber einer gleichartigen bevorzugt ist. Zudem wurde belegt, dass die N-terminalen Domänen ank und cc sowohl bei der Interaktion von mTRPC1β als auch von hTRPC3 mit dem Adapterprotein LAT nicht notwendig sind, sondern eher eine die Bindung inhibierende Wirkung zu haben scheinen. Nach Durchmusterung einer B-Zell-Genbank wurden neue Interaktionspartner von mTRPC1β gefunden. Darunter sind Tropomodulin 3, die 14-3-3-Proteine epsilon und theta und FGD-2. Tropomodulin 3 könnte die Interaktion mit dem Actincytoskelett vermitteln. Während die 14-3-3-Proteine wichtige ubiquitäre Adapterproteine darstellen, ist FGD-2 ein GTP-Austauschfaktor, der Rho-GTPasen aktiviert, so dass beide Proteine eine wichtige Rolle in den verschiedensten zellulären Prozessen wie Apoptose und Differenzierung spielen.
Neben den hydrophoben membrandurchspannenden Segmenten und der mutmaßlichen Porenregion besitzen die TRPC-Proteine, einschließlich der Drosophila-Formen, und die TRPV-Proteine drei bis vier Ankyrin-ähnliche Wiederholungen (ank) sowie die TRPC- und Drosophila TRP-Proteine eine sogenannte „coiled-coil“-Domäne (cc). Der C-Terminus von TRPC-Proteinen besitzt eine gewisse Ähnlichkeit zu Dystrophin (dys), weist aber auch die größten Unterschiede zwischen den TRPC-Proteinen auf (Wes et al., 1995). Eine Assoziation an das Cytoskelett mit Hilfe der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen wurde bereits direkt nach der Entdeckung der TRP-Proteine postuliert. Inzwischen wurde eine Rolle des Cytoskeletts bei der Lokalisierung von TRPC-Proteinen gezeigt (Lockwich et al., 2001) sowie eine Interaktion mit Actin (Friedrich, 2001), jedoch keinem Bereich eines TRPC-Proteins zugeordnet. Auch die Funktion der übrigen cytosolischen postulierten Domänen ist bisher ungeklärt.