1 Abkürzungen und Akronyme
6.1 Molekularbiologische Methoden
6.1 Molekularbiologische Methoden
6 Methoden
Die Standard-Methoden wurden dem Handbuch „Molecular Cloning“, J. Sambrook, E.F.
Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989, entnommen und gegebenenfalls wie beschrieben modfiziert. Andere Quellen sind im Folgenden angegeben.
6.1.1 RNA-Isolierung
Zur Isolierung von RNA aus wt Zelllinien und Transfektanten werden fertige Reaktionssätze („Kits“) von Qiagen, Macherey-Nagel und Roche (ehem. Böhringer Mannheim) mit optionaler DNase-Behandlung nach Herstellerangaben verwendet.
6.1.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Konzentration wird photometrisch durch die Messung der Absorption bei 260 nm bestimmt. Um Verunreinigungen an Protein mit einzukalkulieren wird dabei zur Berechnung der Konzentration der Quotient der Absorption bei 260 nm und 280 nm gebildet. Als Referenz dient der Puffer, in dem die Nukleinsäuren vorliegen. Der Quotient OD260nm/OD280nm sollte im Bereich von 1.7 bis 2.1 liegen und richtet sich unter anderem nach dem verwendeten Puffer. Es werden sinnvolle Verdünnungen zur Messung eingesetzt.
Eine OD260 nm = 1 bei einer gemessenen Schichtdicke von d = 10 mm entspricht einer Konzentration von 50 µg DNA/ml oder 40 µg RNA/ml.
6.1.3 Reverse Transkription (Foley, 1993)
Für eine Reverse Transkription (RT) werden 0,5 bis 5 µg Gesamt-RNA mit RNase-freiem Wasser auf 10 µl aufgefüllt und mit 1 µl oligo-Desoxythymidin (OdT) versetzt. Zur Denaturierung wird für 10 Min auf 70 °C erhitzt und sofort in einem Eis-Wasser-Bad
6 Methoden 6.1 Molekularbiologische Methoden abgekühlt. Zu der Reaktionslösung werden 5 µl RT-Puffer, 2µl 0.1 M Dithiothreitol (DTT), 2 µl 10 nM dNTP-Mix und 1 µl MMLV-Reverse Transkriptase (vorher gemischt und gekühlt) gegeben. Die Mischung wird für 1 h bei 37 °C inkubiert und zur Inaktivierung für 20 Min auf 65 °C erhitzt.
6.1.4 Polymerase Kettenreaktion
(Bell, 1898; Mullis et al., 1986; White et al., 1989)
Die Polymerase Kettenreaktion („Polymerase Chain Reaction“, PCR) wird eingesetzt, um mit Hilfe mutagener Oligonukleotide Mutationen in das zu amplifizierende Produkt einzuführen oder um nachfolgend zu einer Reversen Transkription (RT) mittels spezifischer Oligonukleotide („Primer“) ein bestimmtes Gen zu amplifizieren und nachzuweisen.
Transient transfizierte Zellen können durch RT-PCR auf Expression der transfizierten cDNA-Sequenzen untersucht werden. Als Kontrolle dient hier Actin und außerdem die nicht umgeschriebene RNA, um eine Verunreinigung mit DNA auszuschließen. Um den Abbau der DNA und der „Primer“ durch die Polymerase zu verhindern, sollte der Reaktionsansatz bis zum Start der Reaktion gekühlt gehalten werden. Zum Lösen von Sekundärstrukturen kann dem Ansatz 10 % (v/v) DMSO oder 2 % (v/v) Glycerin zugesetzt werden.
Für eine analytische PCR werden in einem Gesamtvolumen von 25 µl 2.5 µl 10 x PCR-Puffer (Qiagen), 0.15 µl dNTP-Mix (mit je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 0.25 µl 3’-Primer, 0.25 µl 5’-3’-Primer, 1.25 µl Template-DNA (1 µg RT-Ansatz oder 10–20 ng DNA) und zum Schluss 0.125 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl) gemischt. Eine präparative PCR sollte in einem Gesamtvolumen von 100 µl durchgeführt werden. Der Reaktionsansatz wird im Thermocycler dem jeweils passenden Programm unterzogen und kann anschließend bei 4 °C gelagert werden. Die amplifizierte DNA kann in der Agarose-Gelelektrophorese analysiert oder aufgereinigt und z.B. für eine Klonierung weiter verwendet werden (6.1.5 bis 6.1.10).
6 Methoden 6.1 Molekularbiologische Methoden
Tabelle 6.1: PCR-Bedingungen für die verwendeten Oligonukleotide
Amplifikat Primer Temperatur-Zeit-Profil Actin
RT-PCR
Actin-5’/Actin-3’ 94 °C (4 Min) - {[94 °C (30 sec) - 60 °C (30 sec) – 72 °C (30 sec)] 20 Zyklen} - 72 °C (5 Min) - 10 °C (∞) HA-Tag
präparativ
mtrp1-CT-Xho-5’/mtrp1-HA-3’
94 °C (2 Min) - {[94 °C (40 sec) - 56 °C (40 sec) – 72 °C (2 min)] 35 Zyklen} - 72 °C (7 Min) - 10 °C (∞) mtrp1-NT
RT-PCR
PBPCC7/
PBPCC10
94 °C (2 Min) - {[94 °C (45 sec) - 55 °C (45 sec) – 72 °C (2 min)] 40 Zyklen} - 72 °C (7 Min) - 10 °C (∞) trp1/2/3
endogen
PBPCC1/2 PBPCC3/4 htrp1-2317/2622 htrp3-2273/2714
94 °C (5 Min) - {[94 °C (45 sec) - 55 °C (45 sec) – 72 °C (45 sec)] 35 Zyklen} - 72 °C (7 Min) - 10 °C (∞)
trp1/2/3-Mutanten transfiziert
PBPCC1/2 PBPCC3/4 htrp3-sn-2273/
htrp3-asn-2714
94 °C (5 Min) - {[94 °C (30 sec) - 56 °C (30 sec) – 72 °C (45 sec)] 33 Zyklen} - 72 °C (7 Min) - 10 °C (∞)
6.1.5 Restriktionsanalyse
Es werden 250 ng bis 1 µg DNA mit 1 bis 4 U der entsprechenden Restriktionsendonuklease und dem passenden Puffer versetzt und nach Angaben des Herstellers behandelt.
Üblicherweise wird für 1 h bei 37 °C inkubiert (Ausnahmen BstE II 60 °C, BstX I bei 55 °C, ApaI bei 30 °C, SmaI bei 25 °C) mit anschließender Hitzedeaktivierung für 10 Min bei 70 °C.
6.1.6 Klenow-Behandlung
Zum Auffüllen von 5’- oder Abbau von 3’-Überhängen zur Erzeugung von glatten Enden („blunt end“) zumeist für Ligationen wird die mit Restriktionsendonukleasen gespaltene DNA nach Herstellerangaben mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I behandelt. Dazu wird die DNA mit dem geeigneten Puffer und 1 µl Klenow-Enzym in 10 – 20 µl Gesamtvolumen versetzt. Zum Auffüllen von 5’-Enden wird die Reaktionsmischung mit 2.5
6 Methoden 6.1 Molekularbiologische Methoden µl dNTP-Mix (mit je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) versetzt. Anschließend wir für 30 Min bei 37 °C inkubiert und zur Inaktivierung für 10 Min bei 65 °C.
6.1.7 Dephosphorylierung von Vektor-DNA
Um eine Religation der geschnittenen Vektor-DNA zu vermeiden, v.a. bei der Verwendung von nur einer Restriktionsendonuklease, wird das 5’-Ende der linearisierten DNA zusätzlich enzymatisch mit Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Dazu wird die DNA direkt nach der Spaltung in einem Volumen von 10 – 20 µl mit 0.5 µl alkalischer Phosphatase und dem geeigneten Puffer versetzt, für 45 Min bei 37 °C inkubiert und anschließend zur Inaktivierung für 10 Min bei 65 °C.
6.1.8 Agarose-Gelelektrophorese (McDonell et al., 1977)
Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten wird in Agarosegelen (0,8 bis 2 % (m/v) Agarose in TAE-Puffer) mit 0,005 % (v/v) Ethidiumbromidlösung durchgeführt. Zur nachfolgenden Ligation von DNA-Fragmenten wird „Low Melting Point“ (LMP) Agarose verwendet. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt bei 5 V/cm Elektrodenabstand.
6.1.9 Aufreinigung von DNA-Fragmente
Zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen oder PCR-Reaktionslösungen wird das „High Pure PCR-Product Purification“-Kit von Roche (ehem. Böhringer Mannheim) nach Herstellerangaben verwendet.
6.1.10 Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Klonierung von DNA-Fragmenten werden in LMP-Agarosegelen aufgetrennte Insert-DNA und dephosphorylierte Vektor-Insert-DNA auf einem UV-Transilluminator aus dem Gel ausgeschnitten, bei 65 °C geschmolzen und in mindestens dem doppeltem Volumen Wasser
6 Methoden 6.1 Molekularbiologische Methoden aufgenommen. Die isolierten DNA-Mengen werden anhand des verwendeten DNA-Markers abgeschätzt.
Zur Ligation werden 10 ng Vektor-DNA mit der Insert-DNA in einem Mol-Verhältnis von 1:3 (bei kohäsiven Enden) bzw. 1:5 (bei glatten Enden) und 1 x T4-Ligase-Puffer in ca. 10 µl Gesamtvolumen (abhängig vom Volumen der DNA-Agarose-Lösungen) gemischt. Die Ligation erfolgt durch Zugabe von 2 U T4-DNA-Ligase, bei kohäsiven Enden für 1-4 h bei RT und bei glatten Enden üN bei 16 °C.
6.1.11 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen und Transformation
6.1.11.1 MC1061
(modifiziert nach Hanahan, 1985 und Sambrook et al., 1989)
Der E. coli-Stamm MC1061 wird auf einer LBStrep-Platte ausgestrichen und eine Kolonie in 5 ml TYMStrep-Medium üN bei 37 °C und 250 rpm angezogen. 2.5 ml der frischen Kultur werden in 250 ml TYM verdünnt und bis zu einer OD600 = 0.5 kultiviert. Die Kultur wird bei 4 °C und 4000 rpm für 15 Min zentrifugiert. Das Bakterienpellet wird in 20 ml Tfbm1 resuspendiert und nach einer 5 Min Inkubation auf Eis für 15 Min bei 4 °C und 4000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 ml Tfbm2 resuspendiert und die Bakteriensuspension in 500 µl Portionen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70 °C gelagert.
Zur Transformation werden 200 µl der auf Eis aufgetauten Zellen mit 10 µl des vorgekühlten Ligationsansatzes 30 Min auf Eis inkubiert und anschließend ein Hitzeschock für 5 Min bei 37 °C durchgeführt. Nach Zugabe von 1 ml LB-Medium erfolgt die Regeneration für 1 h bei 37 °C. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 4 Min bei 7000 rpm geerntet und in 100 µl frischem LB-Medium resuspendiert. Die Selektion der Bakterien erfolgt nach Ausstreichen des Transformationsansatzes auf LB-Agarplatten, die ein geeignetes Antibiotikum enthalten.
6.1.11.2 XL-1 Blue
(modifiziert nach Hanahan, 1985 und Sambrook et al., 1989)
Der E. coli-Stamm XL-1 Blue wird auf einer LBTet-Platte ausgestrichen und eine Kolonie in 5 ml LBTet-Medium üN bei 37 °C und 250 rpm angezogen. Es werden 4 ml der frischen Kultur in 400 ml LBTet-Medium überführt und bis zu einer OD600 = 0.4 kultiviert. Nach einer 10 Min
6 Methoden 6.1 Molekularbiologische Methoden Inkubation auf Eis wird die Kultur bei 4 °C und 4000 rpm für 15 Min zentrifugiert und das Bakterienpellet in 50 ml Tfbx1 resuspendiert. Nach einer 5 Min Inkubation auf Eis wird erneut für 15 Min bei 4 °C und 4000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird nun in 10 ml Tfbx2 resuspendiert und die Bakteriensuspension in 500 µl Portionen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70 °C gelagert.
Zur Transformation werden 200 µl der kompetenten Zellsuspension mit 10 µl des vorgekühlten Ligationsansatzes versetzt und für 30 Min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 2 Min bei 42 °C und anschließender kurzer Inkubation auf Eis erfolgt nach Zugabe von 1 ml LB-Medium die Regeneration bei 37 °C für 60 Min. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 4 Min bei 7000 rpm geerntet und in 100 µl frischem LB-Medium resuspendiert. Die Selektion der Bakterien erfolgt nach Ausstreichen des Transformationsansatzes auf LB-Agarplatten, die ein geeignetes Antibiotikum enthalten.
6.1.11.3 KC8
(Clontech, 2001-c; Clontech/Becton Dickinson, 2002; Inoue et al., 1990)
Der E. coli-Stamm KC8 wird auf LBKan-Agarplatten ausgestrichen und üN bei 37 °C kultiviert. Anschließend werden 10 bis 12 große Kolonien (2-3 mm Durchmesser) in 1 SOB-Medium resuspendiert, in 250 ml SOB-SOB-Medium überführt und bei 18 °C bis zu einer OD600 = 0.6 kultiviert (ca. 16-18 h). Alle verwendeten Gefäße, Pipetten und Spitzen werden bei 4 °C vorgekühlt. Nach Beendigung der Kultivierung werden die Zellen für 10 Min auf Eis für 10 Min inkubiert und durch Zentrifugation bei 2500 x g und 4 °C für 10 Min geerntet. Der Überstand wird verworfen und die Zellen in 80 ml eiskaltem Tfbk resuspendiert, anschließend wieder für 10 Min auf Eis inkubiert und bei 2500 x g bei 4 °C für 10 Min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen in 20 ml Tfbk aufgenommen. Unter leichtem Schwenken wird DMSO bis zu einer Endkonzentration von 7 % (v/v) zugegeben und wieder für 10 Min bei 4 °C inkubiert. Die Zellen werden in 1 ml Portionen aliquotiert, sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70 °C gelagert.
Zur Transformation werden die kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und jeweils 200 µl zu 5 µl Hefe-Minipräparationsplasmid-DNA in vorgekühlten 14 ml-Kulturröhrchen gegeben (bei anderer Plasmid-DNA bis zu 10 µl zu 100 µl Zellen). Die Suspension wird durch vorsichtiges Klopfen gemischt und für 30 Min auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Zellen für 45-50 sec bei 42 °C einem Hitze-Schock unterzogen und für 2 Min auf Eis inkubiert. Nach
6 Methoden 6.1 Molekularbiologische Methoden und 250 rpm regeneriert. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 2500 rpm für 5 Min geerntet und in 100 µl des adäquaten Mediums resuspendiert, auf Agarplatten ausgestrichen und üN bei 37 °C kultiviert. Zur Standard-Plasmidselektion können LB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum verwendet werden. Um das Genbank-Plasmid (pYESTrp oder pB42AD) vom „bait“-Plasmid (pLexA) und vom Reporterplasmid (p8op-lacZ) aus den Hefe-Minipräparationen zu isolieren, muss auf M9-Minimalmedium, das Ampicillin enthält und Tryptophan defizient ist, selektioniert werden, wobei 10 bis 100 Kolonien erhalten werden.
Bei der Isolation der Plasmid-DNA ist zu beachten, dass KC8 endA+ ist. Eine Lyse, die einen Erhitzungsschritt beinhaltet, ist auf Grund der Endonuklease A nicht empfehlenswert.
6.1.12 Bakterienkultur und Lagerung
Die E. coli werden, wenn nicht anders angegeben, in LB-Medium in luftdurchlässigen Kulturröhrchen oder Kolben mit dem geeigneten Antibiotikum bei 37 °C und 250 rpm angezogen oder auf LB-Agarplatten bei 37 °C kultiviert. Eine Standard-üN-Kultur beinhaltet 5 ml Medium. Sterile Flüssigkulturen können für wenige Tage, LB-Agarplatten für wenige Wochen bei 4 °C unter Luftabschluss gelagert werden.
Zur Dauerlagerung von Bakterienklonen werden 850 µl einer üN-Kultur mit 150 µl sterilem Glycerin versetzt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die anschließende Lagerung erfolgt bei -70 °C. Für die Weiterkultivierung wird die Glycerinkultur auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen.
6.1.13 CTAB-Plasmidpräparation
Es werden 3 ml einer frischen üN-Bakterienkultur bei 7000 rpm für 4 Min pelletiert und in 400 µl STET-Puffer mit 8 µl frisch angesetzter Lysozymlösung (50 mg/ml) resuspendiert.
Nach 10 Min Inkubation bei RT wird das Lysat 45 sec auf 95 °C erhitzt und nach dem Abkühlen die Zelltrümmer sowie die denaturierten Proteine und chromosomale DNA durch Zentrifugation für 10 Min bei 13000 rpm entfernt. Der Überstand wird mit 16 µl CTAB-Lösung versetzt, gemischt und erneut 5 Min bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 150 µl 1.2 M NaCl-Lösung resuspendiert und unlösliche Anteile durch Zentrifugation für 2 Min bei 13000 rpm entfernt. Der die Plasmid-DNA enthaltende Überstand wird zum Fällen der DNA mit 750 µl eiskaltem Ethanol versetzt und 30 Min bei 4 °C zentrifugiert. Das
6 Methoden 6.1 Molekularbiologische Methoden Präzipitat wird mit 500 µl kaltem 70 % Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 20 µl TE-Puffer durch Inkubation für 10 Min bei 65 °C gelöst.
6.1.14 Plasmidpräparation über Ionenaustauschersäulen
Zur Isolierung hochreiner Plasmid-DNA für Sequenzierungen oder Transfektionen wurden käuflich erworbene Maxi-, Midi- und Minipräparations-„Kits“ der Firmen Macherey-Nagel oder Qiagen bezogen und nach Herstellerangaben verwendet.
6.1.15 Fällen von DNA
Die zu fällende DNA wird vorgelegt und, falls nötig, mit Wasser auf mindestens 50 µl aufgefüllt. Zur Präzipitation wird die Lösung mit 1/10 Volumen 3 M M NaOAc/HOAc pH = 4.7 und 2.5 x Volumen kaltem 100 % Ethanol versetzt. Die Mischung wird zunächst für 1 h bei –70 °C inkubiert und anschließend für mindestens 30 Min bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die ausgefallene DNA wird zweimal mit kaltem 70 % Ethanol gewaschen und im Vakuum für 5 – 10 Min getrocknet. Bei Bedarf wird die DNA schließlich in dem gewünschten Puffer durch Inkubation für 10 – 15 Min bei 65 °C gelöst oder zur Sequenzierung an MWG BIOTECH geschickt.