Interaktion der TRPC-Proteine über den N-Terminus

7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander Ein interessanter Effekt tritt beim Vergleich der Aufarbeitung mit Cytochalasin D und Kaliumiodid auf, nachdem COS-M6 transient transfiziert waren, so dass sie mTRPC1β-NT-HA allein oder zusammen mit hTRPC3-FLAG exprimierten. (Die Interaktion von hTRPC3 mit mTRPC1β-NT wird in den Kapiteln 7.2.4 und 7.2.5 genauer erläutert.) Die Zellen wurden zur Isolierung der Fusionsproteine entweder mit 2.5 µM Cytochalasin D vorbehandelt oder in Gegenwart von 1 M Kaliumiodid lysiert. Wie aus Abbildung 7.6 zu entnehmen ist, ist eine Co-Präzipitation in beiden Fällen nachweisbar, jedoch ist die Aufarbeitung mit Kaliumiodid anscheinend so effektiv, dass mehr an hTRPC3-FLAG assoziiertes Protein (mTRPC1β-NT-HA) detektierbar ist als mit dem Antikörper 12CA5 gegen das HA-Epitop direkt präzipitiert wird. Möglicherweise besteht für mTRPC1β-NT eine Konkurrenz zwischen der Interaktion mit Actin und dem hTRPC3-Protein, wobei die TRPC-Assoziation bevorzugt wird gegenüber der Bindung an Actin. Andererseits ist bekannt, dass hohe Salzkonzentrationen, besonders von Kaliumiodid, die Löslichkeit von membranständigen und cytoskelettassoziierten Proteinen deutlich erhöht (Korsgren & Cohen, 1986; Campbell & Kahl, 1989). Daher könnte KI die Löslichkeit der Transmembranform eines TRPC-Proteins derart verändern, dass scheinbar eine stärkere Wechselwirkung mit der cytosolischen Variante entsteht. Um diesen Effekt auszuschließen, wurden alle weiteren Versuche mit Cytochalasin D statt Kaliumiodid durchgeführt.

7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander anderen Proteinen verantwortlich gemacht worden ist (Lupas, 1996). Es liegt nur in den TRPC-Proteinen vor, nicht in den Mitgliedern der TRPV- und TRPM-Familie (siehe Kapitel 2.4.2). Auch dieses Motiv könnte in die Interaktion mit anderen Proteinen oder in die Multimerisierung verschiedener TRPC-Proteine involviert sein. Daher stellt sich die Frage, ob die N-terminale cytoplasmatische Region und die darin enthaltenen Region einen Einfluss auf die Interaktion der TRPC-Proteine haben. Ist dies der Fall, sollte sich auch herausstellen, welche Domäne für die Interaktion wichtig ist, und ob eine der Domänen für die Bindung essentiell ist. Darüber hinaus ist der Vergleich verschiedener TRPC-Isoformen interessant, da nicht bekannt ist, ob die Assoziation verschiedener TRPC-Proteine über die gleichen Bereiche vermittelt wird.

Ausgehend von den bisherigen Erkenntnissen sollte die Rolle der N-terminalen Region und der enthaltenen Domänen in weiteren Co-Immunpräzipitationsexperimenten untersucht werden. Dazu wurden Deletionsmutanten von mTRPC1β eingesetzt, denen entweder die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen (ank), die „coiled-coil“-Domäne (cc) oder beide Domänen bis auf einige dazwischenliegende Aminosäuren fehlen (Engelke, 1999). Letztere Mutante hat den etwas irreführenden den Namen „∆NT“ erhalten, obwohl nicht der komplette N-Terminus, sondern nur die beiden angegebenen Domänen fehlen.

Zunächst exprimierten COS-M6-Zellen transient wt mTRPC1β-FLAG bzw. die Deletionsmutanten zusammen mit wt mTRPC1β-HA oder hTRPC3-HA. Nach Lyse der Zellen wurde eine Co-Immunpräzipitation mit dem mAk M2 gegen das FLAG-Epitop durchgeführt und die isolierten Proteine nach SDS-PAGE und Western-Blot mittels ECL detektiert. (Dieser Versuch wurde von O. Friedrich durchgeführt, siehe Friedrich, 2001.) Wie in Abbildung 7.7 (A) und (B) zu sehen ist, ließ sich kein Unterschied zwischen der Co-IP mit dem intakten wt Protein und mit den Deletionsmutanten erkennen. Die N-terminalen Domänen haben entweder keinen Einfluss auf die Interaktion oder der Effekt wird durch eine Bindung über die Transmembranregionen überdeckt.

Zur Klärung dieses Problems wurden die Experimente von O. Friedrich modifiziert, indem an Stelle von wt mTRPC1β die N-terminale rein cytosolische Mutante mTRPC1β-NT verwendet wurde. Dadurch sollte ein Einfluss der Transmembranbereiche ausgeschlossen werden. Also wurden COS-M6-Zellen co-transfiziert mit wt mTRPC1β-FLAG bzw. den Deletionsmutanten und der cytosolischen Mutante mTRPC1β-NT, die mit einem HA-Epitop versehen war (mTRPC1β-NT-HA). Nach Aufarbeitung, Immunpräzipitation, SDS-PAGE und Western-Blot wurde mit Hilfe des mAk 3F10 das copräzipitierte mTRPC1β-NT-HA-Protein detektiert. Zur Kontrolle wurde mit dem mAk M2 nachgewiesen, dass vergleichbare Mengen der direkt

7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander präzipitierten Deletionsmutanten vorlagen, die z.T. von den schweren Kette des Antikörpers verdeckt waren. In diesem Fall sind deutlich Mengenunterschiede an Coimmunpräzipitat zu erkennen (Abbildung 7.7 (C) und (D)). Bei Deletion der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen nimmt die Menge an co-präzipitiertem mTRPC1β-NT-HA ab (C), wobei im Fall von mTRPC1β∆pp∆ank-FLAG keine Aussage getroffen werden kann, da das Protein bei einer gleichen apparenten Masse wie die schwere Kette des Maus-Antikörpers zu finden wäre (D).

An mTRPC1β∆cc-FLAG ist genauso viel mTRPC1β-NT-HA assoziiert wie an wt mTRPC1β-FLAG (C), an mTRPC1β∆pp∆cc-FLAG bindet sogar mehr mTRPC1β-NT-HA als an mTRPC1β∆pp-FLAG (D). Auch wenn beide Domänen fehlen (mTRPC1β∆pp∆NT-FLAG) wird etwa genauso viel mTRPC1β-NT-HA gebunden wie an mTRPC1β∆pp-FLAG (C), was im Fall von mTRPC1β∆NT-FLAG nicht überprüft werden kann, da auch diese Mutante das gleiche apparente Molekulargewicht wie die schwere Kette des Antikörpers aufweist (D).

Außerdem ist offensichtlich, dass größere Proteinmengen der Deletionsmutanten, denen zusätzlich die mögliche Porenregion („putative pore region“, pp) fehlt, nachgewiesen werden können (bei gleicher Belichtungszeit in (C) und (D)). Wegen der Reduzierung der hydrophoben Anteile hat sich diese Mutante als wesentlich löslicher erwiesen. Auch das Expressionsniveau scheint höher zu sein (Friedrich, 2001). Beides zusammen erleichtert den Nachweis assoziierter Proteine, so dass diese Mutanten in den nachfolgenden Versuchen bevorzugt verwendet wurde (mehr zur Bedeutung dieser Region in Kapitel 7.2.6).

In diesem Zellsystem scheint die Homotetramerisierung von mTRPC1β behindert zu sein, wenn in beiden Partnern die „coiled-coil“-Domäne vorhanden ist. Es ist allerdings eine Abnahme an assoziiertem Protein zu erkennen, wenn man wt mTRPC1β mit mTRPC1β∆ank vergleicht. Möglicherweise haben also die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen einen positiven Einfluss auf die Interaktion zweier mTRPC1β-Proteine.

7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander

( )B

( )D IP

α-HA

α-HA WB

mTRPC1

-x hTRPC 3-βFlag

HA

mTRPC1 an

k-x hTRPC

3-β∆

Flag

HA

mTRP1

cc-x hT RP

C3-β∆

Flag

HA

mTRPC1 pp

-x hTRPC 3-β∆

Flag

HA

hTRPC 3-HA

hTRPC3-HA MG/kDa

94

α-Flag myc

α-myc α-Flag IP

WB mTRP

C1

-x m TRPC1 -β

β

Flag

myc

mTRPC1 ank

-x m

TRP C1

-β∆

β

Flag

myc

mTRPC1 cc

-+mTRPC1 -β∆

β

Flag

myc

mTRPC1 pp

-x m TRPC1

-β∆

β

Flag

myc

mTRPC1β-myc

mTRPC1 -βmyc ( )A

MG/kDa

67

( )C

WB anti-HA mTRPC1β-FlagX N

T1-HA

mTRPC cc-1

X N T1

-β∆

Flag HA

mTRPC NT -1

X NT1

-β∆

Flag HA

IP anti-Flag

mTRPC1 -NT-β HA 43

mTRPC1β∆cc-Flag mTRPC1β∆NT-Flag mTRP1Cβ∆ank-Flag mTRP1C -βFlag 67

WB anti-Flag

WB anti-HA mTRPC1

-β∆pp

X NT 1-Flag

HA

mTRPC cc

-1

pp X N

T1-β∆

∆ Flag

HA

mTRPC NT

-1

pp X N

T1

-β∆

∆ Flag

HA

WB anti-Flag

mTRPC1 -NT-β HA 43

mTRPC1β∆ ∆cc pp-Flag mTRPC1β∆NT pp∆ -Flag mTRP1Cβ∆ank∆pp-Flag mTRP1Cβ∆pp-Flag 67

IP α-Flag α-HA

Abbildung 7.7: Co-Immunpräzipitation von hTRPC3, mTRPC1β und mTRPC1β-NT durch verschiedene Deletionsmutanten von mTRPC1β

Nach transienter Transfektion von COS-M6 mit verschiedenen Deletionsmutanten von mTRPC1β-FLAG zusammen mit entweder hTRPC3, mTRPC1β oder mTRPC1β-NT versehen mit anderen Epitopen, wurde den Zelllysaten der mAk M2 anti-FLAG zugesetzt.

Zur Kontrolle wurden (A) mTRPC1β-myc mit dem mAk 9E10 anti-myc, (B) hTRPC3-HA mit dem mAk 3F10 HA und (C) + (D) mTRPC1β-NT-HA mit dem mAk 12CA5 anti-HA direkt präzipitiert. Zur Detektion der direkt präzipitierten oder assoziierten Proteine wurden die Immunblots mit den mAk M2 anti-FLAG, 9E10 anti-myc oder 3F10 anti-HA inkubiert und die spezifisch erkannten Proteine nachfolgend mittels ECL sichtbar gemacht.

(A) und (B) der Abbildung sind entnommen aus O. Friedrich, 2001.

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Im Dokument 1 Abkürzungen und Akronyme (Seite 107-111)