1 Abkürzungen und Akronyme
7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
7.2.3 Einfluss der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne von TRPC1β
COS-M6-Zellen wurden mit mTRP1β und mTRP2β mit verschiedenen „Tags“ versehen co-transfiziert und aus den Lysaten mit Hilfe der mAk M2 anti-FLAG, 9E10 anti-myc oder 12CA5 anti-HA eines der beiden Proteine isoliert. Zum Nachweis des direkt präzipitierten als auch des assoziierten Proteins wurde der Immunblot mit dem mAk M2 FLAG, 9E10 anti-myc oder 3F10 anti-HA inkubiert. Die spezifisch erkannten Proteine wurden mittels ECL detektiert.
Im N-terminalen cytosolischen Bereich von TRPC-Proteinen wurden Ankyrin-ähnliche Wiederholungen und eine sogenannte „coiled-coil“-Domäne postuliert (siehe Abbildung 2.1 und Anhang 10.1.1 bis 10.1.3). Wie bereits in Kapitel 2.4.2 erläutert, sind Ankyrin-ähnliche Wiederholungen bei vielen Proteinen für Interaktionen zuständig. Ebenso dienen „coiled-coil“-Domänen in vielen Proteinen zur Dimerisierung. Daher sollte geklärt werden, ob diese Domänen möglicherweise eine Rolle bei der Assemblierung der TRPC-Kanäle spielen. Aus dem Grund wurden Deletionsmutanten von mTRPC1β (Engelke, 1999) und hTRPC3 hergestellt, denen jeweils eine dieser N-terminalen Domänen (∆ank oder ∆cc) oder auch beide Domänen (∆NT) fehlen und für Co-Immunpräzipitationsexperimente eingesetzt. Um einen Einfluss der Transmembranregionen, die bei vielen Plasmamembranproteinen zur
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander Tetramerisierung beitragen (Galvan et al., 1999), auszuschließen, wurde eine aus der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne bestehende Mutante eingesetzt.
Die Isolierung der vollständigen TRPC-Proteine wie auch der Deletionsmutanten wurde bereits von O. Friedrich etabliert (Friedrich, 2001). Der Versuch, die ausschließlich cytoplasmatische N-terminale Domäne auf die gleiche Weise zu isolieren, führte zu einer sehr geringen Menge an nachweisbarem Protein und war darüber hinaus nur selten reproduzierbar (Abbildung 7.4 A).
Auf Grund dessen sowie der nachgewiesenen Interaktion von mTRPC1β mit Actin (Friedrich, 2001) und den Untersuchungen von hTRPC3 in diesem Zusammenhang (Lockwich et al., 2001), wurde angenommen, dass TRPC-Proteine über den N-Terminus mit dem Cytoskelett assoziiert sind. Um diese Assoziation zu zerstören, wurden die Zellen entweder mit Cytochalasin D, einem Derivat des Pilz-Alkaloides Cytochalasin B, vorbehandelt oder in Anwesenheit von Kaliumiodid oder ATP lysiert. Cytochalasin D bindet an das Plus-Ende (schnell wachsendes oder stumpfes Ende) von filamentösem Actin und verhindert dort die weitere Anlagerung von Actinmonomeren. Da das noch freie Minus-Ende (langsam wachsendes oder spitzes Ende) eine höhere Konzentration an Actinmonomeren für ein Kettenwachstum benötigt, kommt es nun zur Depolymerisation des Filamentes (Lodish et al., 1996). Lockwich et al. konnten bereits eine erhöhte Löslichkeit für TRPC1 und TRPC3 in Anwesenheit von 0.5 M Kaliumiodid zeigen (Lockwich et al., 2000; Lockwich et al., 2001).
Monomeres Actin (G-Actin) bindet ATP in einer speziell dafür vorgesehenen Tasche.
Während der Polymerisation zu Actinfilamenten (F-Actin) wird ATP zu ADP hydrolysiert.
Allerdings beeinflusst ATP nur die Geschwindigkeit der Polymerisation, ist aber für den Prozess selbst nicht notwendig. Genauer gesagt wirkt sich ATP auf die kritische Konzentration an G-Actin, die zur Polymerisation benötigt wird, aus. Liegt die ATP-Konzentration weit über der physiologischen ATP-Konzentration, wird die Polymerisation so langsam, dass es faktisch zur Depolymerisation von F-Actin kommt (Lodish et al., 1996).
Daher kann auch die Zugabe von ATP die Isolierung mit dem Cytoskelett verbundener Proteine erleichtern.
Wie in Abbildung 7.4 (A) zu sehen ist, konnte mTRPC1β-NT-HA ohne Zusätze, d.h. nach der Standard-Aufarbeitung von O. Friedrich, kaum nachgewiesen werden. Die Behandlung mit 2.5 µM Cytochalasin D, 1 M Kaliumiodid oder 1 mM ATP hingegen führte zu gut nachweisbarem mTRPC1β-NT-HA-Protein. Die Methoden waren also vergleichbar effektiv.
Der Nachweis von mTRPC1β∆pp-HA dient dabei der Kontrolle, dass es sich bei der 40 kDa-Bande um den spezifischen Nachweis von mTRPC1β-NT-HA handelt.
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
Abbildung 7.4: Isolierung von mTRPC1β-NT und Interaktion mit Actin unter verschiedenen Bedingungen
(B) Die verschiedenen mTRPC1β-Deletionsmutanten, die entweder mit einem FLAG- oder einem HA-Epitop versehen waren, wurden transient in COS-M6-Zellen exprimiert. Nach Lyse unter Standardbedingungen wurde entweder mit dem mAk M2 anti-FLAG oder mit dem mAk 12CA5 anti-HA präzipitiert. Die Deletionsmutante mTRPC1β∆pp-HA, der die mutmaßliche Porenregion fehlt, wurde nachfolgend im Immunblot mit dem mAk 3F10 anti-HA detektiert, Actin mit dem mAk 10A5 anti-Actin. Die spezifisch markierten Proteine ( )A B( )
NT1
ohne Zusätze -HA
NT1
10 mM M CD, 2.5 µM Cy.D
-β
HA NT1
1 mM ATP -HA NT1
1 M KI -HA mTRP1
pp -β∆
HA10 mM MCD, 2.5 µM Cy.D β
WB anti-HA
WB anti-Actin
IP αHA αHA HA HA HAα α α
mTRP1 -NT-β HA
Actin
mTRP1β∆pp-HA 43
67
43 67 MG/kDa
WB anti-HA
WB anti-Actin NT1-FlagX mtrp1
β∆pp -HA
mTRP1 pp -β∆
HA
IP Flag α αHA
mTRP1β∆pp-HA
Actin 43
67 MG/kDa
43 67
(A) Die N-terminale cytoplasmatische Domäne von mTRPC1β wurde mit einem HA-Epitop versehen transient in COS-M6 exprimiert und mittels des mAk 12CA5 gegen das HA-Epitop isoliert. Zur Lyse wurden die Zellen mit NP-40 und Methyl-β-cyclodextrin behandelt. Dabei wurde ein Teil ohne weitere Zusätze, ein Teil mit 1 M Kaliumiodid oder 1 mM ATP zusätzlich lysiert und ein Teil mit 2.5 µM Cytochalasin D vorbehandelt. Zum Vergleich wurde mTRPC1β∆pp-HA nach Standard-Bedingungen isoliert. Zur Detektion der HA-Fusionsproteine wurde mit dem mAk 3F10 anti-HA und zur Detektion von Actin mit dem mAk 10A5 anti-Actin inkubiert und nachfolgend mittels ECL detektiert.
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander Die nachfolgende Inkubation der PVDF-Membran mit dem mAk 10A5 gegen Actin zeigte einerseits, dass die Interaktion mit Actin durch die Aufarbeitung mit Kaliumiodid und Cytochalasin D zerstört wurde, jedoch nicht durch die Anwesenheit von ATP.
Andererseits war kein Actin detektierbar, wenn mTRPC1β-NT nicht präzipitiert wurde, was ein weiterer Hinweis für die Assoziation von Actin mit dem N-Terminus von mTRPC1β ist.
Es konnte auch kein Actin assoziiert an mTRPC1β∆pp-HA nach Vorbehandlung mit Cytochalasin D detektiert werden, was wiederum die Zerstörung der Interaktion durch dieses Reagenz belegt.
In einem anderen Experiment, das in Abbildung 7.4 (B) dargestellt ist, wurden COS-M6 transient transfiziert mit mTRPC1β∆pp, das mit einem HA-Epitop versehen war, allein oder zusammen mit der cytosolischen N-terminalen Domäne von mTRPC1β in Fusion mit einem FLAG-Epitop (mTRPC1β-NT-FLAG). Die Aufarbeitung erfolgte nach einer Vorinkubation der Zellen mit 10 mM Methyl-β-cyclodextrin zum Herauslösen des Cholesterins aus den Membranmikrodomänen sowie mit 2.5 µM Cytochalasin D zur Lösung des Komplexes vom Cytoskelett. Die Proteine wurden aus den Lysaten mit Hilfe des mAk M2 gegen die FLAG-Fusionsproteine isoliert.
Der Versuch, eine Co-Immunpräzipitation von mTRPC1β∆pp-HA nachzuweisen, war erfolglos. Allerdings konnte bei einer nachfolgenden Inkubation der PVDF-Membran mit dem mAk 10A5 Actin detektiert werden, wenn es sich um eine Präzipitation mit dem mAk M2 handelte. Dies war jedoch nicht der Fall, wenn die Immunpräzipitation mit dem mAk 12CA5 gegen das HA-Epitop durchgeführt wurde. Entweder handelt es sich also um eine unspezifische Kreuzreaktion des M2-Antikörpers mit Actin oder die Mengen an präzipitiertem Protein mit Hilfe der 12CA5-Antikörpers reichen nicht immer aus, um ein assoziiertes Protein detektieren zu können, wie bei den TRPC-Co-Immunpräzipitationen bereits beobachtet wurde (vgl. Kapitel 7.2.2).
Abbildung 7.5 (B) verdeutlicht, dass der angeblich für das FLAG-Epitop spezifische monoklonale Antikörper M2 anscheinend eine Kreuzreaktion mit Actin eingeht, so dass Actin unspezifisch präzipitiert wird. Bei Verwendung des für das HA-Epitop spezifischen monoklonalen Antikörpers 12CA5 ist das nicht der Fall.
Für die ersten Co-Immunpräzipitationsexperimente zur Klärung der Rolle der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne von mTRPC1β wurde die Deletionsmutante von mTRPC1β eingesetzt, der die mutmaßliche Porenregion fehlt. Diese Mutante wird wesentlich stärker exprimiert wird und lässt sich besser aufreinigen als wt mTRPC1β. Für den IP3-Rezeptor
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander wurde bereits nachgewiesen, dass die mutmaßliche Porenregion vom fünften bis zum sechsten Transmembranbereich maßgeblich für die Tetramerisierung verantwortlich ist (Galvan et al., 1999). Möglicherweise ist das auch für die TRPC-Proteine der Fall. Die Zellen wurden co-transfiziert mit der nur cytoplasmatischen N-terminalen Domäne mTRPC1β. Die Aufarbeitung erfolgte zum Vergleich mit und ohne Cytochalasin D. Wie aus Abbildung 7.5 (A) zu entnehmen ist, konnte nur nach Vorbehandlung mit Cytochalasin D eine Co-Präzipitation von mTRPC1β-NT-HA an mTRPC1β∆pp-FLAG nachgewiesen werden.
Abbildung 7.5: Einfluss von Cytochalasin D auf die Löslichkeit von mTRPC1β-NT und die Assoziation an Actin
WB anti-Flag
mTRPC1 -NT-β Flag 43
43
Aktin 43
MG/kDa
MG/kDa IP
mTRPC1 pp -β∆
β
x mTRPC1 -N T-HA
Flag
mTRPC1 pp -β∆
βΝΤ−
x m TRPC1
-HA
Flag
mTRPC 1-N
T-β Flag
mTRPC1-N T-β
Flag
- -
-anti-HA anti-Flag
WB anti-Aktin
Cytochalasin D + - - + -
Aktin IP αHA αFlag
WB anti-Aktin
Cytochalasin D + + ( ) ( )A B
(A) Gezeigt ist der Einfluss von Cytochalasin D auf die Löslichkeit von mTRPC1β-NT.
COS-M6-Zellen wurden transient mit mTRPC1β-NT-FLAG allein oder zusammen mit mTRPC1β∆pp-HA transfiziert. Parallel wurden Zellen den gleichen Bedingungen ohne jede DNA-Zugabe unterworfen. Nach 3 Tagen wurden die Zellen mit Cytochalasin D vorbehandelt oder nicht und nach Standardvorgehensweise lysiert. Zur Präzipitation wurden die Zelllysate entweder mit dem mAk M2 anti-FLAG oder 12CA5 anti-HA versetzt. Das FLAG-Fusionsprotein mTRPC1β-NT wurde im Immunblot mit Hilfe des gleichen mAk markiert, Actin mit dem mAk 10A5 anti-Actin. Die spezifisch erkannten Proteine wurden nachfolgend mittels ECL detektiert. (B) Nachweis von Actin nach Behandlung von COS-M6 wt-Lysaten mit verschiedenen mAk.
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander Damit ist erstens bestätigt, dass eine Assoziation des N-Terminus an Actin besteht, wodurch mTRPC1β an das Cytoskelett gebunden wird. Zweitens konnte mit dieser ersten Co-Immunpräzipitation bewiesen werden, dass die Interaktion über den N-Terminus von mTRPC1β ausreichend für eine Dimerisierung ist. Drittens wurde hiermit gezeigt, dass mTRPC1β-NT-FLAG wesentlich besser isoliert werden kann, wenn eine Vorbehandlung mit Cytochalasin D stattfindet und dadurch Actin depolymerisiert wird, was für die weiteren Experimente genutzt wurde.
Nach Standardbedingungen wird mTRPC1β-NT-HA allein oder zusammen mit hTRPC3-Flag transient in COS-M6 exprimiert. Zur Aufarbeitung wird entweder mit Cytochalasin D vorbehandelt oder der Lysepuffer mit Kaliumiodid versetzt. Die Lysate wurden entweder mit dem mAk M2 anti-FLAG oder dem mAk 12CA5 anti-HA versetzt. Zur Detektion wurde der Immunblot mit dem mAk M2 anti-FLAG oder dem mAk 3F10 anti-HA inkubiert und anschließend mit dem entsprechenden Peroxidase-markierten Sekundärantikörper. Die spezifisch erkannten Proteine wurden mittels ECL sichtbar gemacht.
IP αFlag αHA αFlag αHA MG/kDa
hTRPC3-Flag x NT 1-HA
hTRPC3-Flag x NT 1-HA
NT1-HA NT1-HA
WB anti-HA
WB anti-FLAG
Lyse 1 M KI 2.5 µM Cytochalasin D
94 hTRPC3-Flag
43 30
mTRPC1β-NT-HA
Abbildung 7.6: Einfluss verschiedener Lysebedingungen auf die Co-Immunpräzipitation von der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne von mTRPC1β
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander Ein interessanter Effekt tritt beim Vergleich der Aufarbeitung mit Cytochalasin D und Kaliumiodid auf, nachdem COS-M6 transient transfiziert waren, so dass sie mTRPC1β-NT-HA allein oder zusammen mit hTRPC3-FLAG exprimierten. (Die Interaktion von hTRPC3 mit mTRPC1β-NT wird in den Kapiteln 7.2.4 und 7.2.5 genauer erläutert.) Die Zellen wurden zur Isolierung der Fusionsproteine entweder mit 2.5 µM Cytochalasin D vorbehandelt oder in Gegenwart von 1 M Kaliumiodid lysiert. Wie aus Abbildung 7.6 zu entnehmen ist, ist eine Co-Präzipitation in beiden Fällen nachweisbar, jedoch ist die Aufarbeitung mit Kaliumiodid anscheinend so effektiv, dass mehr an hTRPC3-FLAG assoziiertes Protein (mTRPC1β-NT-HA) detektierbar ist als mit dem Antikörper 12CA5 gegen das HA-Epitop direkt präzipitiert wird. Möglicherweise besteht für mTRPC1β-NT eine Konkurrenz zwischen der Interaktion mit Actin und dem hTRPC3-Protein, wobei die TRPC-Assoziation bevorzugt wird gegenüber der Bindung an Actin. Andererseits ist bekannt, dass hohe Salzkonzentrationen, besonders von Kaliumiodid, die Löslichkeit von membranständigen und cytoskelettassoziierten Proteinen deutlich erhöht (Korsgren & Cohen, 1986; Campbell & Kahl, 1989). Daher könnte KI die Löslichkeit der Transmembranform eines TRPC-Proteins derart verändern, dass scheinbar eine stärkere Wechselwirkung mit der cytosolischen Variante entsteht. Um diesen Effekt auszuschließen, wurden alle weiteren Versuche mit Cytochalasin D statt Kaliumiodid durchgeführt.