1 Abkürzungen und Akronyme
7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
7.2.5 Homotetramerisierung von TRPC-Proteinen im Vergleich zu
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
WB anti-HA hTRPC3-HA
MG/kDa
hTRPC3 X NT1 -HA
Flag
hTRPC3 an
k-∆ HA
hTR PC3ank
-∆
X NT 1-HA
Flag
hTRPC3 cc
-∆ HA
hTRPC3 cc
X NT1
-∆ HA
Flag
hTRPC3 NT
-∆ HA
hTR PC3NT
-∆
X NT 1-HA
Flag
IP αHA αFlagαHA αFlag αHA αFlag αHA αFlag Flagα
WB anti-Flag
hTRPC3-HA hTRPC3 cc-∆ HA hTRPC3 NT-∆ HA hTRPC3 ank-∆ HA 94
67
mTRPC1 -NT-β Flag 43
NT1-Flag
MG/kDa
hTRPC3-HA hTRPC3
X NT2 -HA
Flag
hTRPC3 an
k-∆ HA
hTR PC3an
k-∆
X NT 2-HA
Flag
hTRPC3 cc
-∆ HA
hTRPC3 cc
X NT2
-∆ HA
Flag
hTRPC3 NT
-∆ HA
hTR PC3NT
-∆
X NT2 -HA
Flag
hTRPC3 ank-∆ HA hTRPC3-HA hTRPC3 cc-∆ HA hTRPC3 NT-∆ HA anti-HA
mTRPC2 -NT-β Flag WB anti-Flag
67 94 67
Abbildung 7.8: Co-Immunpräzipitation von mTRPC1β- und hTRPC3-Deletionsmutanten durch die N-terminalen cytoplasmatischen Domänen von mTRPC1β und mTRPC2β
Nach transienter Transfektion von COS-M6-Zellen mit einer oder zwei cDNA-Konstrukten und Standard-Aufarbeitung (MβCD, CytD, 0.5 % NP-40), wurden die Zelllysate mit dem mAk M2 anti-FLAG für die Co-Präzipitationen und die Kontrollpräzipitation der N-Termini oder dem mAk 12CA5 anti-HA für die Kontrollpräzipitationen der Deletionsmutanten versetzt. Zum Nachweis wurden die Immunblots mit dem mAk M2 anti-FLAG oder dem mAk 3F10 anti-HA inkubiert und nachfolgend mit Hilfe Peroxidase-markierter Sekundärantikörper durch ECL entwickelt. (Fortsetzung S. 113)
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
MG/kDa mTRPC1
-β∆pp
X NT1 -HA
Flag
mTRPC1 -β∆pp-Flag mTRPC1
-β∆ppHA
mTRPC cc
-1
pp X NT
1-β∆
∆ HA
Flag
mTRPC cc 1
pp -β∆
∆ HA
mTRPC NT
-1 pp
X NT
1-β∆
∆ HA
Flag
mTRPC NT 1
pp -β∆
∆ HA
67
43
WB anti-HA
WB anti-Flag IP
mTRPC1 -NT-β Flag mTRPC1β∆pp-Flag mTRPC1β∆ ∆cc pp-HA mTRPC1β∆NT pp∆ -HA mTRPC1β∆ank∆pp-HA mTRPC1β∆pp-HA
MG/kDa mTRPC1
-β∆pp
X NT2 -HA
Flag
mTRPC1 -β∆ppHA
mTRPC1β-Flag mTRPC
cc -1
pp X NT
2-β∆
∆ HA
Flag
mTRPC cc 1
pp -β∆
∆ HA
mTRPC NT
-1 pp
X NT
2-β∆
∆ HA
Flag
mTRPC NT 1
pp -β∆
∆ HA
67
94 43
67
WB anti-HA
WB anti-Flag IP
mTRPC2 NT-β Flag mTRPC1 -βFlag mTRPC1β∆ ∆cc pp-HA mTRPC1β∆NT pp∆ -HA mTRPC1β∆ank∆pp-HA mTRPC1β∆pp-HA
Abbildung 7.8: Co-Immunpräzipitation von mTRPC1β- und hTRPC3-Deletionsmutanten durch die N-terminalen cytoplasmatischen Domänen von mTRPC1β und mTRPC2β
(Fortsetzung von S. 112) Interaktion von (A) hTRPC3 und N-terminalen Deletionsmutanten mit dem N-Terminus von mTRPC1β, (B) hTRPC3 und N-terminalen Deletionsmutanten mit dem N-Terminus von mTRPC2β, (C) mTRPC1β∆pp und N-term.
Deletionsmutanten mit dem NT von mTRPC1β und (D) mTRPC1β∆pp und N-term.
Deletionsmutanten mit dem NT von mTRPC2β. Dabei ist zu beachten, dass die Reihenfolge der Proben in (A) und (B) eine andere ist als in (C) und (D).
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
Um zu erkennen, ob eine N-terminale Domäne für die Bindung wichtig ist oder sie eher hemmt, muss das Verhältnis von direktem Immunpräzipitat (Kontrolle) und Coimmunpräzipitat (assoziiertes Protein) beim wt Protein und den Deletionsmutanten verglichen werden. Dabei wird deutlich, dass bei den verschiedenen in Abbildung 7.8 dargestellten Komplexen unterschiedliche Domänen einen fördernden oder behindernden Einfluss auf die Bindung haben.
In Abbildung 7.8 (A) ist die Wechselwirkung von hTRPC3-Deletionsmutanten (HA-Tag) mit dem N-Terminus von mTRPC1β (FLAG-Tag) dargestellt. Nebeneinander sind die direkten Präzipitationen der Deletionsmutanten und die durch den N-Terminus co-immunpräzipitierten Deletionsmutanten zu sehen. Dabei fällt auf, dass bei hTRPC3∆ank-HA etwa gleich viel Protein direkt präzipitiert wird wie assoziiert ist. Im Gegensatz dazu ist aber weniger wt hTRPC3-HA an mTRPC1β-NT-FLAG gebunden als direkt präzipitiert wird. Das bedeutet, dass in Abwesenheit der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen in hTRPC3 die Bindung an mTRPC1β besser ist als bei ihrer Anwesenheit. Die ank-Domäne in hTRPC3 behindert die Bindung also deutlich. Das Verhältnis von Coimmunpräzipitat und direktem Immunpräzipitat im Fall von hTRPC3∆cc-HA ist ähnlich wie bei wt hTRPC3-HA. Eher ist sogar etwas weniger hTRPC3dcc-HA an mTRPC1β-NT-FLAG assoziiert als wt hTRPC3-HA. Die
„coiled-coil“-Domäne von hTRPC3 hat also keinen oder einen geringen positiven Einfluss auf die Bindung an mTRPC1β.
Abbildung 7.8 (B) zeigt die Wechselwirkung von hTRPC3-Deletionsmutanten mit dem N-Terminus von mTRPC2β. Die angehängten Epitope und die Auftragung sind die gleichen wie in Abbildung 7.8 (A). Beim Vergleich des Verhältnisses von assoziiertem hTRPC3-HA-Protein und direkt durch mTRPC2β-NT präzipitiertem hTRPC3-HA-hTRPC3-HA-Protein liegt relativ etwas weniger indirekt gebundenes Protein vor, wenn die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen fehlen, aber relativ mehr, wenn die „coiled-coil“-Domäne fehlt. Die ank-Domäne ist also für die Bindung von hTRPC3 an mTRPC2β von Bedeutung, wohingegen die cc-Domäne von hTRPC3 störend wirkt.
Die Homotetramerisierung von mTRPC1β ist in Abbildung 7.8 (C) gezeigt. Die verwendeten Epitope sind wieder die gleichen, jedoch ist die Abfolge der Proben in (C) und (D) anders als in (A) und (B), und zwar sind nun zunächst die assoziierten Proteine und in der folgende Spur die Kontrollen zu sehen. Der Einfluss der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen kann nur bedingt ausgewertet werden, da mTRPC1∆pp∆ank-HA nur ein geringfügig größeres apparentes Molekulargewicht besitzt wie die schwere Kette des ebenfalls detektiertes
M2-7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander Antikörpers (Spuren 1, 3, 5, 7 und 9). Beim Vergleich von direkt präzipitiertem zu indirekt präzipitiertem Protein mTRPC1∆dpp-FLAG-Protein zeigt sich hier ein deutlicher Unterschied bei Anwesenheit und Abwesenheit der „coiled-coil“-Domäne. Fehlt die cc-Domäne im Transmembranprotein (mTRPC1∆pp∆cc-HA) ist deutlich mehr Protein an mTRPC1β-NT-FLAG gebunden als wenn die cc-Domäne in beiden Partnern vorhanden ist (mTRPC1∆pp-HA). Die cc-Domäne hat also einen negativen Einfluss auf die Homotetramerisierung von mTRPC1β. Im Fall der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen (mTRPC1β∆pp∆ank-HA) liegt etwas mehr assoziiertes Protein vor als im Fall des N-terminal intakten Proteins (mTRPC1dpp-HA) und etwas weniger als bei mTRPC1β∆pp∆cc-HA. Die ank-Domäne behindert die Homotetramerisierung also ebenfalls, aber nicht so stark wie die cc-Domäne.
Im Abbildung 7.8 (D) ist schließlich die Interaktion von mTRPC1β mit der N-terminalen cytoplasmatischen Region von mTRPC2β gezeigt. Wie in (C) ist die dem assoziierten mTRPC1β∆ank∆pp-HA entsprechende Bande nahezu von den schweren Ketten des zur Präzipitation verwendeten M2-Antikörpers verdeckt. Darüber hinaus haben mTRPC1β∆pp-HA und mTRPC2β-NT-FLAG nahezu das gleiche apparente Molekulargewicht und blockieren gegenseitig ihr Signal (weiße „Geisterbande“ im anti-HA-Blot, v.a. Spur 1).
Vergleicht man wieder assoziiertes mTRPC1β∆pp-HA-Protein zu direkt präzipitiertem, so ist beim Fehlen der „coiled-coil“-Domäne (mTRPC1β∆pp∆cc-HA) eine geringe Abnahme zu sehen im Vergleich zur Mutante, in der sie vorhanden ist (mTRPC1β∆pp-HA). Demzufolge ist die Bindung geschwächt, wenn die „coiled-coil“-Domäne nicht in beiden Interaktionspartnern vorliegt. Die cc-Domäne könnte also für die Interaktion von mTRPC1β mit mTRPC2β notwendig sein. Über den Einfluss der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen kann hier keine eindeutige Aussage getroffen werden, da nicht zwischen indirekt präzipitiertem mTRPC1β∆pp∆ank-HA und der schweren Ketten des M2-Antikörpers unterschieden werden kann (Abbildung 7.8 D, Spur 3).
Je nach homo- oder heterotypischer Interaktion der TRPC-Proteine haben demnach die N-terminalen Domänen (ank, cc) eine unterschiedliche Bedeutung. Es ist festzustellen, dass die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen die Assoziation von hTRPC3 an mTRPC1β behindert, von mTRPC1β an mTRPC1β leicht behindert, von mTRPC1β an mTRPC2β eher fördert und von hTRPC3 an mTRPC2β deutlich fördert. Die „coiled-coil“-Domäne hemmt die Bindung von mTRPC1β an mTRPC1β stark, hemmt im Fall von hTRPC3 an mTRPC2β, ist eher fördernd bei hTRPC3 an mTRPC1β und deutlich fördernd bei mTRPC1β an mTRPC2β. Die
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander Heterotetramerisierung von hTRPC3 mit mTRPC2β und von hTRPC3 mit mTRPC1β wird teilweise durch die N-terminalen Domänen behindert oder verbessert und für die Heterotetramerisierung von mTRPC1β mit mTRPC2β scheinen beide Domänen (ank, cc) wichtig zu sein.
Um die Frage abschließend zu klären, ob die „coiled-coil“-Domäne der TRPC-Proteine für die Zusammenstellung eines TRPC-Kanals und die Sortierung der verschiedenen Isoformen zuständig ist, wurde das Experiment erneut „umgekehrt“ durchgeführt. Wenn es also Unterschiede in der Affinität verschiedener „coiled-coil“-Domänen der TRPC-Proteine zu einander gibt, sollte das Assoziationsverhalten gleichartig sein, egal ob die „coiled-coil“-Domäne im rein cytosolischen oder im membranständigen Interaktionspartner vorhanden ist.
Das Assoziationsverhalten würde sich allerdings ändern, wenn die „coiled-coil“-Domäne für die Interaktion mit einem anderen, bislang unbekannten Protein zuständig wäre. In diesem Fall wäre die „coiled-coil“-Domäne des membranständigen TRPC-Proteins normalerweise blockiert. Wenn die notwendige Domäne im membranständigen TRPC-Protein fehlt, ist diese eigentlich bevorzugte Assoziation nicht mehr möglich. Erst dann kann es zu einer direkten Interaktion mit einem anderen TRPC-Protein kommen, möglicherweise über dessen „coiled-coil“-Domäne. In diesem Fall würden reziproke Ergebnisse erwartet werden, je nachdem ob die „coiled-coil“-Domäne immer im cytosolischem mTRPC1β (mTRPC1β-NT) vorliegt und im membranständigem TRPC-Protein (mTRPC1β, mTRPC2β, hTRPC3) fehlt oder ob die
„coiled-coil“-Domäne immer im membranständigem TRPC-Protein (mTRPC1β, mTRPC2β, hTRPC3) vorliegt und im cytosolischem mTRPC1β (mTRPC1β-NT) fehlt.
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
Also wurden mTRPC1β∆pp bzw. mTRPC2β bzw. hTRPC3 mit intaktem N-Terminus coexprimiert mit dem N-Terminus von mTRPC1β, dem die postulierten Domänen fehlten (mTRPCβ1-NT, mTRPC1β-NT∆ank, mTRPCβ1-NT∆cc, mTRPCβ1∆NT). COS-M6-Zellen wurden wie bisher transient mit einem oder zwei Konstrukten transfiziert und nach drei Tagen aufgearbeitet. Die vollständigen Proteine mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3, die mit einem FLAG-Epitop versehen waren, wurden mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 isoliert.
Die cytosolischen N-terminalen Deletionsmutanten, die in Fusion mit einem HA-Epitop exprimiert worden waren, wurden zur Kontrolle mit dem monoklonalen Antikörper 12CA5 präzipitiert. Nach SDS-PAGE und Western-Blot wurde die Assoziation der N-terminalen Mutanten an die verschiedenen TRPC-Proteine mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers 3F10 gegen das HA-Epitop detektiert. Außerdem wurde mit dem M2 nachgewiesen, dass jeweils äquivalente Mengen der TRPC-Proteine vorlagen.
Ein experimentelles Problem ergab sich dabei mit den Mutanten mTRPC1β-NT∆ank oder mTRPC1β-NT∆NT. Obgleich Transkripte durch RT-PCR nachweisbar waren, konnten die Proteine weder nach Immunpräzipitation noch in der Immunfluoreszenzmikroskopie detektiert werden. Möglicherweise sind diese Deletionsmutanten zu stark verkürzt und derartig falsch gefaltet, dass sie im ER retardiert und von den Zellen abgebaut werden. Auch durch eine geringfügige Variation der Aufarbeitungsbedingungen (0.5 – 1 % NP-40 oder Triton X-100, mit und ohne MβCD) konnten die fehlenden Deletionsmutanten (NT1∆ank und NT1∆NT) nicht nachgewiesen werden. Daher wurde in diesem Ansatz nur die Assoziation von mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 mit dem vollständigen cytoplasmatischen N-Terminus von mTRPC1β sowie mit der um die „coiled-coil“ Region verkürzten Mutante untersucht (mTRPC1β-NT-HA, mTRPC1β-NT∆cc-HA).
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
IP mTRPC1
-β∆pp
NT
Flag x HA
MG/kDa
NT1-HA mTRPC1
pp -NT1
β∆
∆ Flag x
cc-H
Flag x cc-HA
mTRPC1β-NT cc∆ -HA mTRPC1β-NT-HA WB anti-HA
43 ( )A
αFlag αHA αFlag αHA
WB anti-Flag
mTRPC1β∆pp-Flag 67
IP mTRP
C2β x Flag
NT 1-HA
MG/kDa
NT1-HA mTRPC2
-NT1
β
∆ Flag x
cc-HA
mTRPC1β-NT cc∆ -HA WB anti-HA
43 ( )B
αFlag αHA αFlag αHA
WB anti-Flag
94 IP
hTRPC3-Flag xNT 1-HA
MG/kDa
NT1-HA hTRPC3
-NT1∆ Flag x
cc-HA
mTRPC1β-NT cc∆ -HA mTRPC1β-NT-HA WB anti-HA
43 ( )C
αFlag αHA αFlag αHA
WB anti-Flag
67
94 hTRPC3-Flag
mTRPC2 -βFlag
Abbildung 7.9: Co-Immunpräzipitation des N-Terminus’ von mTRPC1β und der um die „coiled-coil“-Domäne verkürzten Mutante durch mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3
COS-M6-Zellen wurden transient mit mTRPC1β-NT oder mTRPC1β-NT∆cc mit HA-Tag allein oder zusammen mit mTRPC1β, mTRPC2β oder hTRPC3 mit FLAG-Tag transfiziert und nach Standardvorgehensweise behandelt. Zur Co-Präzipitation wurden die Zelllysate mit dem mAk M2 gegen das FLAG-Epitop und zur Kontrollpräzipitation mit dem mAk 12CA5 gegen das HA-Epitop versetzt. Zum Nachweis wurden die PVDF-Membranen mit den mAk M2 anti-FLAG oder 3F10 anti-HA inkubiert und mit Hilfe von Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern und ECL spezifisch sichtbar gemacht. Assoziation von mTRPC1β-NT und mTRPC1β-NT∆cc an (A) mTRPC1β, (B) mTRPC2β und (C) hTRPC3.
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
In Abbildung 7.9 (A) ist die Interaktion von mTRPC1β∆pp mit mTRPC1β-NT und mTRPC1β-NT∆cc dargestellt. Zur Bewertung wird der Vergleich der Menge an assoziiert vorliegendem cytosolischen N-Terminus mit und ohne „coiled-coil“ Region (Spur 2 und 4) mit der Menge an direkt präzipitiertem Protein (Spur 1 und 3) herangezogen. Hier wird deutlich, dass deutlich weniger Protein co-präzipitiert wird, wenn die „coiled-coil“ Region bei beiden Interaktionspartnern vorhanden ist als wenn sie im cytosolischen N-Terminus fehlt.
Bei der Wechselwirkung von hTRPC3 mit der cytosolischen Mutante von mTRPC1β (mTRPC1β-NT), die in Abbildung 7.9 (C) zu sehen ist, ist relativ zu den Kontrollen gleich viel Protein co-präzipitiert wenn die „coiled-coil“-Domäne in beiden Proteinen vorhanden ist oder wenn sie im N-Terminus von mTRPC1β fehlt.
Zusammengefasst lässt sich also feststellen, dass in dieser Kombination die „coiled-coil“-Domäne sowohl die Homotetramerisierung von mTRPC1β als auch die Heterotetramerisierung von mTRPC1β und mTRPC2β behindert, die Heterotetramerisierung von mTRPC1β und hTRPC3 aber nicht stört.
Folglich ist es sowohl für die Homotetramerisierung von mTRPC1β als auch für die Heterotetramerisierung von hTRPC3 unerheblich, ob die cc-Domäne in der Transmembranform des TRPC-Proteins fehlt oder in der cytosolischen Mutante. Die cc-Domäne übt somit einen direkten Einfluss auf die Interaktion aus. Im Fall der Heterotetramerisierung von mTRPC1β und mTRPC2β kehrt sich das Assoziationsverhalten um, je nachdem ob die cc-Domäne im Transmembranprotein oder in der cytosolischen Form fehlt. In diesem Fall könnte die cc-Domäne eine andere Rolle spielen als eine direkte Steuerung der Interaktion.
Die Interaktion von mTRPC2β mit dem cytosolischen N-terminalen Bereich von mTRPC1β ist in Abbildung 7.9 (B) dargestellt. Dabei kann festgestellt werden, dass etwa gleich viel mTRPC1β-NT assoziiert vorliegt wie direkt präzipitiert werden konnte. Auffällig ist aber, dass beim Fehlen der „coiled-coil“-Domäne im N-Terminus von mTRPC1β sogar mehr dieses cytosolischen Proteins co-präzipitiert wird als direkt mit Hilfe des Antikörpers isoliert werden kann. Die Interaktion ist also anscheinend stärker, wenn die cc-Domäne in der cytosolischen verkürzten Form von mTRPC1β fehlt.
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander
Tabelle 7.2: β-Galactosidaseaktivität bei der Dimerisierung der cytosolischen Domänen von mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3
Saccharomyces cerevisiae EGY48 wurden simultan mit den BD- und AD-Konstrukten transformiert und selektioniert. Positive Klone wurden anhand des Wachstums auf Leucinmangelmedium identifiziert und anschließend auf X-Gal-haltiges Nährmedium übertragen, um die lacZ-Expression zu überprüfen. Dabei wurde bei Heterodimeren eine stärke Blaufärbung beobachtet. Eine Reportergenaktivierung bei Verwendung des C-Terminus einer TRPC-Isoform wurde nie beobachtet.
AD-Fusions- proteine
BD-Fusionsprotein
Kontrollvektor AD-mTRP1β-NT AD- mTRP1β-NT∆ank AD-m TRP1β-NT∆cc AD-m TRP1β-CT AD-mTRP2-NT AD-mTRP2-CT AD-hTRPC3-NT AD-hTRPC3-CT
Kontrollvektor - - -
BD-mTRP1β-NT - + + - - ++ - ++ -
BD-mTRP1β-CT - - -
BD-mTRP2-NT - ++ ++ - - + - ++ -
BD-mTRP2-CT - - -
BD-hTRPC3-NT - ++ ++ - - ++ - + -
BD-hTRPC3-CT - - -
Nach den vorliegenden Ergebnissen existieren Unterschiede bei der homo- und der heterotypischen Interaktion von TRPC-Proteinen. Diese Daten werden unterstützt durch eine Interaktionsstudie mit Hilfe des „Yeast Two Hybrid“ Systems (Y2HS). Dabei wird die Assoziationsfähigkeit der cytosolischen N- und C-terminalen Regionen von mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 untersucht sowie die Wechselwirkung mit Deletionsmutanten des N-Terminus von mTRPC1β, denen entweder die „coiled-coil“-Domäne (∆cc) oder die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen (∆ank) fehlen. Die Hefezellen wurden sukzessive mit den BD- und AD-Konstrukten transformiert und selektioniert. Positive Klone wurden anhand des Wachstums auf Leucinmangelmedium identifiziert und parallel auf X-Gal-haltigem Nährmedium kultiviert, um die lacZ-Expression zu überprüfen. Das erste Ergebnis ist, dass die Dimerisierung über die N-Termini stattfindet. Eine Wechselwirkung mit den C-Termini
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander existiert nicht (siehe auch Engelke et al., 2002; Friedrich, 2001). Bei mehrfacher Wiederholung dieses Versuches fiel auf, dass bei Heterodimeren eine stärkere β-Galactosidaseaktivität als bei Homodimeren festgestellt werden kann. Das Ergebnis ist in Tabelle 7.2 dargestellt. Die Expression vergleichbarer Proteinmengen wurde durch Western-Blot-Analyse überprüft. (Abbildung 7.10). Durch Deletion der cc-Domäne wird die Interaktion im Y2HS unterbunden, die ank-Domäne hat in diesem System keinen Einfluss auf die Assoziation.
S. cerevisiae EGY48 [p8op-lacZ] wurden transformiert mit pLexA, der eine TRPC-cDNA enthielt, und mittels der TCA-Methode aufgearbeitet. Nach SDS-PAGE und Westernblot Zum Nachweis der LexA-Fusionsproteine wurde die PVDF-Membran mit dem pAk anti-LexA, einem Peroxidase-markierten Ziege-anti-Kaninchen Ak inkubiert und einer ECL unterzogen.
Es ist offensichtlich, dass die untersuchten TRPC-Proteine unterschiedliche Affinitäten zueinander haben. Besonders bei Beteiligung von mTRPC1β scheinen JHeterotetramere besonders bevorzugt zu sein. Dabei hat die „coiled-coil“-Domäne vermutlich einen steuernden Effekt.
LexA-mTRPC2-NT β
LexA-mTRPC1 -NT β
LexA-hTRPC3-NT LexA-mTRPC1-NT cc
β
∆
LexA-mTRPC1-NT ank β
∆
LexA-mTRPC1 -NTβ LexA-mTRPC1 -NT ccβ ∆ LexA-mTRPC1 -NT ankβ ∆ LexA-mTRPC2 -NTβ LexA-hTRPC3-NT MG/kDa
67 43 94
WB anti-LexA
Abbildung 7.10: Nachweis von LexA-Fusionsproteinen der N-Termini von hTRPC3, mTRPC2β, mTRPC1β und Deletionsmutanten
7 Ergebnisse 7.2 Interaktion verschiedener TRPC-Isoformen miteinander