Interaktion mit dem LAT-Protein

Das 1992 entdeckte (Gilliland et al., 1992) und 1998 klonierte (Weber et al., 1998; Zhang et al., 1998-a) Verbrückungsprotein für die Aktivierung von T-Zellen („linker for activation of T cells“, LAT) (Zhang et al., 1998-a) ist ein 36-38 kDa Adapterprotein, das v.a. in T-Zellen (Gilliland et al., 1992; Zhang et al., 1998-a; Pasquet et al., 1999), aber auch in natürlichen

7 Ergebnisse 7.3 Interaktion mit dem LAT-Protein Killer- und Mastzellen (Saitoh et al., 2000) sowie in myeloiden Zellen (Tridandapani et al., 2000) in großen Mengen exprimiert wird. Nach Aktivierung des T-Zell-Rezeptors („T cell receptor“, TCR) oder verschiedener ITAM-tragender Fc-Rezeptoren wird LAT stark phosphoryliert, bindet verschiedene andere Adaptermoleküle, Kinasen sowie die Phospholipase C, rekrutiert sie so zur Plasmamembran und bringt die Reaktionspartner zusammen (Boerth et al., 2000; Clements et al., 1999; Gilliland et al., 1992; Gross et al., 1999; Pasquet et al., 1999; Sieh et al., 1994; Tridandapani et al., 2000; Zhang et al., 1998-a;

Zhang et al., 1999). Die Signalmoleküle werden von LAT in die glycolipidangereicherten Membran-Mikrodomänen („glycolipid-enriched microdomains“, GEM), die auch als detergenzunlösliche Lipidflöße („Lipid Raft Domains“, LRD) bezeichnet werden, rekrutiert, in denen wo LAT selbst lokalisiert sein muss, um seine Funktion zu erfüllen (Boerth et al., 2000; Buday et al., 1994; Lin et al., 1999; Zhang et al., 1998-b; Zhang et al., 1999). LAT besitzt einen kurzen extrazellulären Bereich, eine Transmembranregion und eine längere cytoplasmatische Domäne, in der sich die zu phosphorylierenden Tyrosinreste befinden (Lin et al., 1999). LAT ist daher nicht nur kritisch für die Aktivierung, Expansion und Differenzierung von T-Lymphocyten (Pivniouk & Geha, 2000; Zhang et al., 1999), sondern auch für die Aktivierung verschiedener anderer Zellen des Immunsystems. Da sowohl LAT als auch die TRPC-Proteine in den glycolipidangereicherten Membranmikrodomänen lokalisiert sind, sollte die Fähigkeit zur Assoziation von LAT an mTRPC1β und hTRPC3 untersucht werden. Bedenkt man die allgemeine Funktion von LAT, besteht die Möglichkeit, dass LAT auch zur Rekrutierung der TRPC-Kanäle in den Signalkomplex dient.

Nachdem O. Friedrich bereits gezeigt hatte, dass wt mTRPC1β, mTRPC2β und hTRPC3 mit LAT in Wechselwirkung treten können (Friedrich, 2001), sollte nun der Einfluss der N-terminalen cytoplasmatischen Region und der darin enthaltenen Domänen untersucht werden.

Zur Untersuchung der Wechselwirkung von LAT mit mTRPC1β und den Deletionsmutanten wurden (wie bereits beim Nachweis der Interaktion von TRPC-Proteinen) COS-M6-Zellen transient mit der cDNA für die zu untersuchenden Proteine transfiziert. Als Kontrolle wurde parallel nur mit der cDNA für LAT mit einem c-myc-Epitop versehen transfiziert. Die Zellen wurden zur Aufarbeitung wie gehabt mit 10 mM Methyl-β-cyclodextrin vorbehandelt und lysiert. Als Negativkontrolle wurden untransfizierte wt COS-M6-Zellen verwendet.

Anschließend wurden mTRPC1β und die Deletionsmutanten, die in Fusion mit einem FLAG-Epitop exprimiert wurden, mit Hilfe des mAk M2 Maus-anti-FLAG isoliert. Nach

SDS-7 Ergebnisse 7.3 Interaktion mit dem LAT-Protein PAGE wurden im Western-Blots sukzessive sowohl die direkt präzipitierten mTRPC1β-Proteine als auch das assoziiert vorliegende LAT-myc nachgewiesen (Abbildung 7.12). Die Menge an coimmunpräzipitiertem LAT ist jeweils etwa gleich groß, wohingegen die Menge an nachweisbarem mTRPC1β abnimmt. Von wt mTRPC1β kann die größte Menge nachgewiesen werden, gefolgt von mTRPC1β∆ank-FLAG und zum Schluss mTRPC1β∆cc-FLAG, was mit bisherigen Beobachtungen übereinstimmt. Es liegt also mehr LAT assoziiert vor, wenn die N-terminalen Domänen fehlen.

mTRP1

β-FlagX LAT-myc mTRP1

An k-β∆

X LAT -Flag

myc

mTRP1 -β∆cc

X LAT -Flag

myc

LAT-myc

-IP αmyc αFlag Flag Flag Flag α α α WB anti-myc

43 LAT-myc

WB anti-Flag 67

76

43

mTRP1 -βFlag mTRP1β∆NT-Flag mTRP1β∆ank-Flag mTRP1β∆cc-Flag

Abbildung 7.12: Co-Immunpräzipitation von LAT durch mTRPC1β-Deletionsmutanten

COS-M6-Zellen wurden transient co-transfiziert mit wt mTRPC1β oder verschiedenen N-terminalen Deletionsmutanten, versehen mit einem FLAG-Epitop, und LAT in Fusion mit einem myc-Epitop. Für die Co-Immunpräzipitationen wurden die Lysate mit dem mAk M2 anti-FLAG versetzt, für die Kontrolle mit dem mAk 9E10 anti-myc. Die direkt oder indirekt isolierten Proteine wurden im Immunblot mit den gleichen Antikörpern spezifisch markiert und nachfolgend mittels ECL detektiert.

7 Ergebnisse 7.3 Interaktion mit dem LAT-Protein

yc-Epitop.

Das Experiment wurde in ähnlicher Weise mit LAT und hTRPC3 sowie Deletionsmutanten durchgeführt. LAT war wie bisher mit einem c-myc-Epitop versehen, hTRPC3 und die zugehörigen Deletionsmutanten hingegen mit einem HA-Epitop. Die bisherigen Erfahrungen hatten gezeigt, dass Assoziationen schlecht nachzuweisen waren, wenn mit dem mAK 12CA5 (Maus) oder dem mAk 3F10 (Ratte) gegen das HA-Epitop präzipitiert wurde. Daher wurde stattdessen bei den Co-Immunpräzipitationsversuchen LAT-myc direkt präzipitiert mit dem monoklonalen Maus Antikörper 9E10 gegen das c-m

WB anti-HA

LAT-myc 43

WB anti-myc 94

67

hTRPC3-HA hTRPC3 ank-∆ HA hTRPC3 cc-∆ HA hTRPC3 NT-∆ HA hTRPC3-HA

hTRPC3-HAX LAT-myc hTRPC3

an

k-∆ HA

hTR PC3 Ank

-∆

HA X LAT-myc

hTRPC3 cc

-∆ HA

hTR PC3

cc

-∆

HAX LAT-myc

hTR PC3∆

NT-HA

hTRPC3 NT

-∆

HA X LAT -myc

L AT-myc IP αHA αmyc mycαHA HA αmyc mycα α αHA αmyc α

Abbildung 7.13: Co-Immunpräzipitation von hTRPC3 und Deletionsmutanten durch LAT

Nach transienter Transfektion von COS-M6-Zellen mit wt hTRPC3 oder N-terminalen Deletionsmutanten allein oder zusammen mit LAT oder zur Kontrolle mit LAT alleine wurde den Zelllysaten der mAk 9E10 anti-myc (CoIP oder Kontrolle LAT) oder 12CA5 (Kontrolle hTRPC3) zugesetzt. Nach SDS-PAGE und Westernblot wurden die Proteine mit den mAk 9E10 anti-myc oder 3F10 anti-HA und nachfolgender ECL detektiert.

Im Western-Blot sollten dann zuerst LAT und nachfolgend die assoziiert vorliegenden und die zur Kontrolle direkt präzipitierten hTRPC3-Deletionsmutanten nachgewiesen werden.

Abbildung 7.13 zeigt, dass vergleichbare Mengen an LAT-myc vorlagen. Außerdem wurden vergleichbare Proteinmengen von hTRPC3-HA, hTRPC3∆ank-HA, hTRPC3∆cc-HA und hTRPC3∆NT-HA durch LAT präzipitiert. Allerdings wurde durch den gegen das HA-Epitop gerichteten mAk 12CA5 wenige hTRPC3dcc-HA als wt hTRPC3-HA direkt präzipitiert. Eine noch geringere Menge wurde von hTRPC3∆ank-HA und am wenigsten von hTRPC3∆NT-HA direkt nachgewiesen. Folglich bindet hTRPC3 besser an LAT, wenn die

„coiled-coil“-7 Ergebnisse 7.3 Interaktion mit dem LAT-Protein Domäne fehlt und noch besser, wenn die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen deletiert sind, wobei es erstaunlich ist, dass mehr von den hTRPC3-Mutanten durch die Bindung an LAT isoliert werden konnte als direkt durch den zugehörigen Antikörper. Bedenkt man die relativ geringe Affinität des 12CA5 zu seinem Epitop (siehe Kapitel 7.2.1), könnte dieser Effekt durch eine feste Bindung von hTRPC3 an LAT verursacht werden. Für diese Assoziation scheinen sowohl die ank- als auch die cc-Domäne eher hinderlich zu sein, ebenso wie im Fall von LAT und mTRPC1β.