Einfluss des Cytoskeletts auf die Aktivierung von TRPC-Kanälen

Neben einer Ca²⁺-abhängigen kompetetiven Regulation durch IP3-Rezeptoren und Calmodulin ist auch eine Steuerung durch andere Proteine denkbar, die das Signal vom

2 Einleitung 2.5 Signalkomplexbildung und Aktivierung von TRP-Proteinen Oberflächenrezeptor oder vom Ca²⁺-Speicher zum TRPC-Kanal leiten. Dazu können Adapterproteine ebenso wie das Actincytoskelett gehören, die eine korrekte Lokalisation der TRPC-Kanäle ermöglichen.

In Drosophila Photorezeptoren bindet TRP an das Adapterprotein INAD („inactivation no after potential“), das ebenfalls mit NORPA interagiert, so dass die photorezeptorspezifische Phospholipase C, und das Kanalprotein TRP zusammengeführt werden, wobei zwei PDZ-Domänen von INAD mit NORPA und eine mit dem C-Terminus von TRP interagiert (Clapham, 1996; van Huizen et al., 1998). Darüber hinaus scheinen der Rezeptor Rhodopsin, das angekoppelte G-Protein, der Effektor NORPA und der Kanal TRP auf spezielle subzelluläre Membrandomänen beschränkt zu sein. Für G-Proteine wiederum liegen Hinweise auf eine direkte Interaktion mit Cytoskelettproteinen vor (van Huizen et al., 1998). Als erster Ansatz wurde die Bindung an das Drosophila Gerüstprotein INAD untersucht. Dabei war eine Coimmunpräzipitation mit TRPC1, 4 und 5 möglich, jedoch nicht mit TRPC3, 6 und 7. Eine Bindung an TRPC2 wurde nicht untersucht (Goel et al., 2002). Daher wurde vorgeschlagen, dass auch in Wirbeltieren PDZ-Domänen enthaltende Proteine eine Verbindungsstelle für die Bildung eines Signalkomplexes sowie für die korrekte Lokalisation von TRPC-Proteinen anbieten. TRPC4 und TRPC5 binden über ihren C-Terminus in HEK293-Zellen und im Gehirn erwachsener Mäuse an die erste PDZ-Domäne des Na⁺-H⁺ -Austausch-regulierenden-Faktors („Na⁺-H⁺-exchange regulatory factor“, NHERF), welcher ebenfalls an die endogene PLC-β bindet. NHERF ist ein zwei PDZ-Domänen-enthaltendes Protein, das mit dem Cytoskelett über Interaktionen mit Mitgliedern der Ezrin/Radixin/Moesin-Familie assoziiert.

Es ist also möglich, das NHERF TRPC4- und TRPC5-enthaltende Kanäle mit PLCβ-Isoenzymen verbindet und beide mit dem Actincytoskelett verknüpft, wodurch die Verteilung und Regulation der Kanäle moduliert werden könnte (Tang et al., 2000). Die entfernt Ca²⁺ -Kanalproteine TRPV5 und TRPV6 assoziieren ebenfalls über eine konservierte Sequenz im C-Terminus spezifisch mit Hilfsproteinen, in diesem Fall Annexin 2 und S100A10, die eine entscheidende Rolle beim Transport („routing“) von TRPV5 und TRPV6 zur Plasmamembran spielen (van de Graaf et al., 2003).

Auch der Zustand des Actincytoskeletts selbst hat einen Einfluss auf den IP3R-TRPC-Komplex. Die Kopplung zwischen dem IP3R II mit hTRPC1 in Blutplättchen wurde durch die Stabilisierung des kortikalen Actincytoskeletts verhindert, wohingegen die gleichen Reagenzien in HEK293-Zellen zur Internalisierung von hTRPC3 führten, die Bindung zum IP3R jedoch nicht beeinflussten (Rosado & Sage, 2001; Lockwich et al., 2001). Die Kopplung des IP3R an hTRPC1 in Blutplättchen fand nur statt, wenn die intrazellulären Ca²⁺

-2 Einleitung -2.5 Signalkomplexbildung und Aktivierung von TRP-Proteinen Speicher direkt oder durch Rezeptorstimulation entleert waren, und wurde durch Wiederauffüllen der Speicher gelöst (Rosado & Sage, 2001; Rosado et al., 2002).

Verschiedene TRPC-Proteine scheinen also über verschiedene Mechanismen reguliert zu werden, wobei sich das Kopplungsmodell und des sekretionsähnliche Modell gegenseitig ergänzen anstatt auszuschließen. Der Mechanismus kann darüber hinaus auch vom Zelltyp und spezifisch exprimierten Adaptermolekülen beeinflusst werden.

Die Interaktion zwischen dem IP3R und TRPC3 in HEK293-Zellen kann zwar durch eine Modifikation des Cytoskeletts nicht unterbunden werden, jedoch kommt es zur Internalisierung der TRPC3-IP3R-Komplexe nach Bildung einer festen Actinschicht unter der Plasmamembran. Daher könnte es zu einer sekretionsähnlichen Aktivierung der Kationenströme kommen, indem die durch feste Bindung an den IP3R konstitutiv aktiven TRPC3-Kanäle nach Rezeptorstimulation in die Plasmamembran transportiert werden (Lockwich et al., 2001). Die verschiedenen Modelle zur Aktivierung rezeptorgesteuerter Ca²⁺-Kanäle sind demnach nicht strikt getrennt, sondern stellen Grenzfälle dar, für die es zahlreiche Mischfälle gibt. Je nachdem wie der TRPC-Kanal zusammengesetzt ist und wie stark die Bindung der beteiligten TRPC-Proteine an den IP3R, an CaM, das Actincytoskelett und an Adapterproteine ist, können die resultierenden Kanäle auf unterschiedliche Weise reguliert werden, wobei verschiedene Wege sich überschneiden, ergänzen oder parallel verlaufen können.

3 Problemstellung

3 Problemstellung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Rolle des Maus Proteins mTRPC1β näher geklärt werden.

Ein Schwerpunkt lag in der Charakterisierung der möglichen Untereinheitenstruktur eines funktionellen Kanals notwendig ist. Daher sollte die Interaktion mit zwei anderen TRPC-Proteinen (mTRPC2β und hTRPC3), die ebenfalls in B-Zellen der Maus vorkommen, erforscht werden. Außerdem sollte die Rolle der postulierten N-terminalen „coiled-coil“-Domäne und der Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen in der Tetramerisierung untersucht werden.

Der zweite Schwerpunkt lag in der Durchmusterung einer B-Zell-Genbank, um noch unbekannte Interaktionspartner des N-Terminus von TRPC1 zu finden. Dadurch sollten neue Erkenntnisse über die Signalkaskade und den Signalkomplex, in den TRPC1 involviert ist, und über den Aktivierungsmechanismus, der zur Öffnung von TRPC1-enthaltenden Kanälen führt, gewonnen werden.

Daneben sollte die Rolle der cytoplasmatischen Domäne von TRPC1 bei der Assoziation an das Actincytoskelett und das Adapterprotein LAT studiert werden.

4 Zusammenfassung

4 Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Dissertation wurde die mögliche Untereinheitenstruktur von Kanälen, die aus TRPC1, TRPC2 und TRPC3 aufgebaut werden können, untersucht. Dabei konnte folgende Ergebnisse herausgestellt werden:

1. TRPC1, 2 und 3 bilden sowohl Homo- als auch Heterotetramere.

Aus den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Coimmunpräzipitations- experimenten geht hervor, dass die Assoziation von TRPC1 und TRPC2 mit anderen TRPC-Proteinen ist abhängig von der jeweiligen Spleißvariante. Ein Literaturvergleich zeigt, dass TRPC1 mit TRPC3 nur interagiert, wenn das N-terminale Motiv GAPPPSPGLPPSWAA vorhanden ist. Für die Interaktion mit der TRPC4/5-Subfamilie ist dieses Motiv nicht relevant. TRPC2 benötigt für die Heterotetramerisierung die ersten 180 (280) N-terminalen Aminosäurereste. Eine Homotetramerisierung scheint über einen anderen Bereich stattzufinden.

2. Die Assoziation von TRPC1 über den N-Terminus bevorzugt Heterotetramere.

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Coimmunpräzipitationsexperimente zeigen außerdem, dass die prinzipielle TRPC-Komplexbildung zwar über die mutmaßliche Porenregion geschieht, aber auch die cytosolische N-terminale Domäne zur Assoziation befähigt ist und einen regulativen Einfluss auf die Tetramerisierung ausübt. Dies geschieht v.a. durch die unterschiedlichen Affinitäten der „coiled-coil”-Domänen zueinander. TRPC1 bevorzugt daher Heterotetramere gegenüber Homotetrameren.

3. Die Interaktion von TRPC1 und 3 mit dem Adapterprotein LAT benötigt weder die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen noch die „coiled-coil”-Domäne.

Beide Domänen scheinen nicht für die Bindung an LAT zuständig zu sein, wie durch Coimmunpräzipitationsexperimente untersucht wurde. Die Bindung der TRPC-Proteine an LAT wird verstärkt, wenn die Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen und die

„coiled-coil“-Domäne fehlen. Also scheint diese Interaktion durch ein weiteres Protein behindert zu werden, das mit den Ankyrin-ähnlichen Wiederholungen oder der

„coiled-coil“-Domäne interagiert.

4 Zusammenfassung

4. Die TRPC1-Interaktion mit dem Actincytoskelett über den N-Terminus könnte über Tropomodulin 3 vermittelt werden.

Durch weitere Coimmunpräzipitationsexperimente konnte nachgewiesen werden, dass der N-Terminus von TRPC1 das Kanalprotein am Actincytoskelett verankert. Die Daten der Genbankdurchmusterung mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems legen nahe, dass die Bindung höchstwahrscheinlich über Tropomodulin 3 vermittelt wird. Dadurch bindet TRPC1 ausschließlich an die langsam wachsenden Enden der Actinfilamente, nicht an eine Stelle in der Mitte und auch nicht an monomeres Actin.

Darüber hinaus wurde mit Hilfe der Hefe-2-Hybrid-System-Genbankdurchmusterung das cytoskelettähnliche Protein Rootletin entdeckt, das mit TRPC1 vermutlich über gemeinsame „coiled-coil”-Domänen interagiert und möglicherweise der Positionierung des Endoplasmatischen Retikulums dienen könnte.

5. TRPC-Proteine benötigen zellspezifische regulierende Proteine.

In der A20-Zell-Expressionsgenbank wurden bei der Durchmusterung mittels des Hefe-2-Hybrid-Systems zahlreiche Proteine entdeckt, die an der Translokation von TRPC1 zur Plasmamembran und an der Integration in den Signalkomplex und die Signaltransduktion beteiligt sein könnten. Die 14-3-3-Isoformen epsilon und theta sind Kandidaten für die Regulation der Aktivität oder der Lokalisation der TRPC-Kanäle oder für die Verknüpfung mit dem B-Zell-Rezeptor. Der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor FGD-2 könnte eine Verbindung zu kleinen G-Proteinen der Signalkaskade darstellen. TRIM27/RTF könnte TRPC1 an subzelluläre Kompartimente knüpfen. Eine Verbindung mit der Protein Kinase C könnte über das PKC-bindende Protein 1 bestehen.