Transzellulärer Glukosetransport

Beim transzellulären Glukosetransport (Abbildung 2.1) wird Glukose durch spezifische Transportproteine in der Bürstensaummembran (sodium-dependent glucose transporter 1 (SGLT1), glucose transporter 2 (GLUT2)) in die Enterozyten aufgenommen. In diesen wird ein geringer Anteil der aufgenommenen Glukose im Rahmen des Zellstoffwechsels metabolisiert (PRITCHARD u. PORTEOUS 1977;

FLEMING et al. 1991; OKINE et al. 1994, 1995). Der weitaus größere Anteil wird jedoch aus der Zelle freigesetzt. Diese Freisetzung wird neben spezifischen Transportproteinen in der basolateralen Membran (GLUT2) durch Exozytose vermittelt.

Inwieweit auch die in jüngster Vergangenheit im Dünndarm entdeckten glucose transporter 7 (GLUT7) und sodium-dependent glucose transporter 4 (SGLT4), die für den Fruktosetransport bei niedrigen luminalen Fruktosekonzentrationen (LI et al.

2004) bzw. den Mannosetransport (TAZAWA et al. 2005) zuständig sein könnten, in den transzellulären Glukosetransport involviert sind, ist noch nicht bekannt.

Molekularbiologische und funktionelle Untersuchungen demonstrieren, dass sich der transzelluläre Glukosetransport in den reifen und differenzierten Enterozyten in den oberen Zweidrittel der Dünndarmzotten abspielt (DUDEJA et al. 1990; MEDDINGS et al. 1990; FERRARIS et al. 1992).

Transport durch die Bürstensaummembran (BSM)

Die Aufnahme von Glukose durch die BSM in die Enterozyten erfolgt durch den SGLT1 (HEDIGER et al. 1987), einem Transporter dessen natürliche Substrate Glukose und Galaktose sind und der der Familie der sodium/glucose cotransporter (SLCA5) zugeordnet wird (WRIGHT u. TURK 2004).

Der SGLT1 ist ein integrales Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 75

kDa (HEDIGER et al. 1987). Er weist dem Darmlumen zugewandte Amino- und Karboxylenden auf und durchspannt die BSM mit 14 α-Helices (transmembranale Domänen 1-14), die abwechselnd durch intra- und extrazelluläre polare Amino-säureketten verbunden sind (TURK et al. 1996). Von den transmembranalen Domänen sind maßgeblich die letzten fünf Domänen des Karboxylendes für die Bindung (Affinität und Substratspezifität) und den Transport von Glukose verant-wortlich (PANAYOTOVA-HEIERMANN et al. 1996, 1997).

Der SGLT1 hat mit einem Km-Wert von 0,1 bis 0,6 mmol · l^-1 eine hohe Affinität zu Glukose (WRIGHT et al. 2003). Er transportiert zwei Na⁺-Ionen im Symport mit einem Glukosemolekül (MACKENZIE et al. 1998). WRIGHT et al. (2007) beschreiben den Transportvorgang wie folgt: Zunächst binden die beiden Na⁺-Ionen an den SGLT1.

Dadurch wird eine Konformationsänderung des Transporters ausgelöst, die die nachfolgende Bindung von einem Glukosemolekül ermöglicht. Im Rahmen einer weiteren Konformationsänderung des SGLT1 werden die Liganden durch die BSM in das Zytoplasma transferiert. Hier dissoziieren zunächst das Glukosemolekül und anschließend die beiden Na⁺-Ionen vom Transporter. Mit der Relaxation des SGLT1 zur Ausgangskonformation endet der Transportzyklus. Sie postulieren, dass bei 37°C bis zu 100 Transportzyklen pro s ablaufen können, wobei der limitierende Schritt in der Dissoziation der beiden Na⁺-Ionen vom Transporter liege.

Triebkraft für diesen Transport ist ein zelleinwärts gerichteter elektrochemischer Na⁺ -Gradient (CRANE et al. 1961), der durch die Aktivität der basolateral lokalisierten Na⁺/K⁺-ATPase aufrechterhalten wird (HORISBERGER et al. 1991). Diese pumpt unter ATP-Spaltung Na⁺-Ionen aus der Zelle. Die dabei in die Zelle gelangenden K⁺ -Ionen rezirkulieren durch K⁺-Kanäle in der BLM (Abbildung 2.1). Da der Aufbau des Gradienten auf einem ATP-verbrauchenden Schritt beruht, wird die Glukose-aufnahme durch den SGLT1 als sekundär aktiver Transport bezeichnet.

Eine kohlenhydratreiche Nahrung führt bei den meisten Spezies zu einer gesteigerten Expression des SGLT1 in den Enterozyten und damit einhergehend zu einer erhöhten Glukoseaufnahme durch die BSM (BODE et al. 1981; DIAMOND et al.

1984; FERRARIS u. DIAMOND 1986; SOLBERG u. DIAMOND 1987; BUDDINGTON

et al. 1991; FERRARIS u. VINNAKOTA 1993; SALMON et al. 2002; MARGOLSKEE et al. 2007; DYER et al. 2009).

MIYAMATO et al. (1993) konnten zeigen, dass ein Zucker weder transportiert noch metabolisiert werden muss, um eine gesteigerte SGLT1-Expression zu induzieren. In ihren Studien fanden sich nicht nur erhöhte mRNA-Gehalte des SGLT1 bei Ratten, die mit den natürlichen Substraten des SGLT1 (Glukose, Galaktose) gefüttert wurden. Auch Ratten, die vom SGLT1 nicht transportierbare (Mannose, Fruktose, Xylose) oder in den Enterozyten nicht metabolisierbare Zucker (3-O-Methylglukose) erhielten, wiesen erhöhte mRNA-Gehalte auf.

Die von FERRARIS und DIAMOND (1992, 1993) durchgeführten Experimente an Mäusen demonstrieren, dass eine kohlenhydratreiche Nahrung die gesteigerte Expression des SGLT1 nur in den Enterozyten der Dünndarmkrypten und nicht in denen der Zotten induzieren kann. Weiterhin ist aus ihren Untersuchungen ersichtlich, dass die Zeitspanne von 1 bis 3 Tagen vom Stimulus bis zur in den Dünndarmzotten gemessenen Zunahme der Transportermenge auf der Migration der vermehrt SGLT1 exprimierenden Enterozyten entlang der Krypten-Zottenachse beruht. Nach der Fütterung einer kohlenhydratreichen Diät konnten die Autoren mit der Wanderung der Enterozyten von den Krypten zur Zottenspitze nach 12 h erhöhte Transportermengen im mittleren Drittel der Zotten nachweisen. Nach 36 h zeigten die Enterozyten im oberen Drittel der Zotten und nach 156 h auch diejenigen in den Zottenspitzen eine vermehrte Expression des Transporters.

Ihre Experimente demonstrieren ferner, dass auch eine verminderte Expression des SGLT1 nur in den Enterozyten der Krypten induziert werden kann. Mit der Umstellung der Mäuse von einem kohlenhydratreichen auf ein kohlenhydratarmes Futter fanden sie nach 1 Tag zunächst verringerte Transportergehalte in den Dünndarmkrypten sowie in den unteren Bereichen der Dünndarmzotten vor. Nach 3 Tagen war die Anzahl an Transportern auch in den oberen Bereichen der Dünndarm-zotten reduziert.

Untersuchungen jüngeren Ursprungs deuten jedoch darauf hin, dass die SGLT1-Expression auch in den Enterozyten der Dünndarmzotten induziert werden kann. So

wiesen Nagetiere, denen eine kohlenhydratreiche Nahrung verabreicht wurde, bereits nach 1 h einen erhöhten Gehalt an SGLT1-mRNA in den Enterozyten sowie eine gesteigerte SGLT1-Expression und eine erhöhte Na⁺-abhängige Glukose-aufnahme in intestinale BSMV auf (SHIRAZI-BEECHEY 2009, persönliche Mitteilung).

In die Regulation der SGLT1-Expression scheinen die im Dünndarm vorgefundenen Sweet-Taste-Rezeptoren (T1R2 + T1R3) und das ebenfalls im Dünndarm detektier-bare G-Protein α-Gustducin involviert zu sein. So zeichnete sich in den von MARGOLSKEE et al. (2007) durchgeführten Studien ab, dass sowohl T1R3 als auch α-Gustducin für eine erhöhte Expression des SGLT1 notwendig sind. In ihren Studien führte eine zuckerreiche Nahrung bei Wildtypen zu einer erhöhten Expression. Bei T1R3-Knockout Mäusen und α-Gustducin-Knockout Mäusen wurden jedoch keine erhöhten Expressionen vorgefunden. Le GALL et al. (2007) kamen zu einem ähnlichen Ergebnis. Sie zeigten, dass ein durch Zucker verursachter Anstieg im mRNA-Gehalt des SGLT1 durch Lactosole, einem Inhibitor des T1R3, gehemmt werden kann.

Weitere Hinweise darauf, dass die Sweet-Taste-Rezeptoren T1R2 und T1R3 in die Regulation der SGLT1-Expression involviert sind, liefern zum einen Studien, bei denen der Glukosetransport über die BSM bei Katzen nicht infolge einer kohlenhydratreichen Nahrung zunahm (BUDDINGTON et al. 1991) und zum anderen solche, bei denen Hühner keine vermehrte SGLT1-Expression bei erhöhten luminalen Glukosekonzentrationen zeigten (BARFULL et al. 2002). Diese Befunde könnten unter Berücksichtigung der zuvor dargestellten Erkenntnisse darauf zurückzuführen sein, dass weder Katzen noch Hühner den Sweet-Taste-Rezeptor T1R2 exprimieren (LI et al. 2005; SHI u. ZHANG 2006).

MARGOLSKEE et al. (2007) und DYER et al. (2007) nehmen an, dass die in der luminalen Membran von enteroendokrinen Zellen lokalisierten Sweet-Taste-Rezeptoren T1R2 und T1R3 ab einer bestimmten Glukosekonzentration im Dünn-darmlumen aktiviert werden (Abbildung 2.2). Vermittelt durch intrazelluläre Signal-kaskaden, in die das G-Protein α-Gustducin involviert sei, würden diese daraufhin

Abbildung 2.2: Modell zur Induktion der SGLT1-Expression in den Enterozyten. Durch erhöhte luminale Glukosekonzentrationen können Sweet-Taste-Rezeptoren (T1R2 + T1R3) in enteroendo-krinen Zellen aktiviert werden, die daraufhin gastrointestinale Hormone (GIP, GLP-1 u. a.) sezernieren. Diese führen auf parakrinem Weg zu einer erhöhten SGLT1-Expression. Abkürzungen:

SGLT1 = sodium-dependent glucose transporter 1, GLP-1 = Glukagon-ähnliches Peptid 1, GIP = Gastric Inhibitory Polypeptide, T1R2 = Sweet-Taste-Rezeptor T1R2, T1R3 = Sweet-Taste-Rezeptor T1R3 (Modifiziert nach SCLAFANI 2007).

gastrointestinale Hormone (u. a. Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP), Glukagon-ähnliches Peptid 1 (GLP-1)) sezernieren. Durch die Hormone werde dann auf parakrinem Weg die Expression des SGLT1 gesteigert.

,,

VAYRO und SILVERMANN (1999) zufolge wird die Glukoseaufnahme auch durch die intrinsische Aktivität des SGLT1 moduliert. In ihren Experimenten wurde durch einen Agonisten der Proteinkinase C die intrinsische Aktivität des SGLT1 in COS-7-Zellen (Fibroblasten-Zelllinie aus Nierengewebe) und dadurch die Glukoseaufnahme in diese Zellen reduziert. Die Affinität und die Anzahl an SGLT1 in der Zellmembran blieben unbeeinflusst. Sie vermuteten, dass die intrinsische Aktivität des Transporters durch dessen Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung reguliert werde.

SUBRAMANIAN et al. (2009) zeigten in jüngster Vergangenheit, dass die Aktivität des SGLT1 tatsächlich durch eine Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung des

Interstitium

Transporters reguliert wird. In ihren Studien führte die Proteinkinase A zu einer Phosphorylierung und damit zu einer Konformationsänderung des Transporters. Die Autoren vermuteten, dass die Konformationsänderung zu veränderten funktionellen Eigenschaften des Transportes (Vmax, Km) geführt haben dürfte. Diese dürften wiederum in Kombination mit einer vermehrten SGLT1-Expression die stimulierten Aufnahmen von α–Methyl-D-Glukopyranosid in Ovarzellen des Hamsters, die in ihren Experimenten beobachtet werden konnten, hervorgerufen haben.

Damit die Enterozyten rasch auf sich ändernde Glukosekonzentrationen im Darm-lumen reagieren können, scheint die Anzahl an SGLT1 in der BSM zudem durch einen Austausch des Transporters zwischen der BSM und intrazellulären Speichern reguliert zu werden. So stellten KIPP et al. (2003), KHOURSANDI et al. (2004) und CHUNG et al. (2002) fest, dass der SGLT1 in Caco-2-Zellen (Zellkulturmodell für humane Enterozyten) sowie im Dünndarm des Menschen und dem des Kaninchens nicht nur in der BSM lokalisiert ist sondern auch in intrazellulären Vesikeln. Diese waren in den Studien eng mit dem Zytoskelett der Enterozyten assoziiert und fungierten als Speicher für den Transporter. KHOURSANDI et al. (2004) und CHUNG et al. (2002) stellten ferner fest, dass der SGLT1 zwischen der BSM und den intrazellulären Speichern verschoben werden kann.

Zusätzlich zum SGLT1 kann auch der GLUT2 in der BSM vorgefunden werden (KELLETT u. HELLIWELL 2000; AU et al. 2002; AFFLECK et al. 2003; GOUYON et al. 2003; COTTRELL et al. 2006).

Beim GLUT2 handelt es sich um einen Transporter, der die erleichterte Diffusion der natürlichen Substrate Glukose, Galaktose, Mannose und Fruktose ermöglicht (THORENS 1996) und zur Familie der solute carriers 2A (SLCA2A) gehört (JOOST u. THORENS 2001; JOOST et al. 2002).

Der GLUT2 ist ein integrales Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 61 kDa (THORENS et al. 1988). In Analogie zum GLUT1 (glucose transporter 1) wird für ihn angenommen, dass er über in das Zytoplasma reichende Amino- und Karboxyl-enden verfügt und zwölf transmembranale Domänen aufweist. Diese sind abwech-selnd durch intra- und extrazelluläre polare Aminosäureketten verbunden

(MUECKLER et al. 1985; BELL et al. 1993). Für den Glukosetransport sind maßgeblich die transmembranalen Domänen neun bis zwölf verantwortlich (MUECKLER et al. 1985; WU et al. 1998).

Der GLUT2 weist mit einem Km-Wert von 15 bis 20 mmol · l^-1 eine niedrige Affinität zu Glukose auf, transportiert diese aber mit einer hohen Kapazität (THORENS 1996;

ZHAO u. KEATING 2007). WALMSLEY (1988), CARRUTHERS (1990) und BELL et al. (1993) postulieren, dass durch die Bindung von Glukose an den Transporter eine Konformationsänderung des Transporters induziert wird, die die Beförderung von Glukose durch die Membran ermöglicht.

Bei niedrigen Glukosekonzentrationen sind nur wenige GLUT2-Moleküle mit einer geringen intrinsischen Aktivität in der BSM vorhanden. Bei hohen luminalen Glukose-konzentrationen (ab 30 bis 50 mmol · l^-1) werden zusätzliche GLUT2 innerhalb weniger Minuten (t1/2 ~ 3,5 min) aus intrazellulären Vesikeln vorübergehend in die BSM eingebaut. Gleichzeitig wird die intrinsische Aktivität der sich bereits in der BSM befindenden GLUT2 temporär gesteigert, so dass Glukose unter diesen Bedingun-gen äußerst effektiv resorbiert werden kann (KELLETT u. HELLIWELL 2000;

KELLETT 2001; KELLETT u. BROT-LAROCHE 2005; KELLETT et al. 2008)

MACE et al. (2007a, b, 2009), MORGAN et al. (2003, 2007) und Kellett et al. (2008) gehen davon aus, dass der Einbau von GLUT2 in die BSM sich folgendermaßen ereignet (Abbildung 2.3): Der Na⁺-gekoppelte Glukosetransport durch den SGLT1 führt zu einer Membrandepolarisation, wodurch sich spannungsabhängige Cav1.3-Kanäle öffnen und die intrazelluläre Calciumkonzentration erhöht wird. Durch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration wird eine Umgestaltung des Zytoskeletts möglich, die für den Transfer von Proteinen durch das Terminale Web notwendig ist. Darüber hinaus kommt es bei einer luminalen Glukosekonzentration ab 30 mmol · l^-1 zu einer Aktivierung von Sweet-Taste-Rezeptoren (T1R2 + T1R3), die in den Enterozyten, Paneth-Zellen und enteroendokrinen Zellen lokalisiert sind.

Hierdurch werden Signalkaskaden ausgelöst, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, zu einer Aktivierung der Proteinkinase C ßII und zu einem Einbau von GLUT2 in die BSM führen.

Abbildung 2.3: Modell zur Regulation der Insertion von GLUT2 in die BSM durch intrazelluläres Calcium (Ca²⁺) und Sweet Taste Rezeptoren (T1R2 und T1R3). Die durchgehenden Pfeile veranschaulichen den transzellulären Glukosetransport. Die gestrichelten Pfeile stellen den Einfluss der Sweet-Taste-Rezeptoren und der Ca²⁺-Ionen auf die Insertion von GLUT2 in die BSM sowie den Einfluss des Na⁺-gekoppelten Glukosetransports via SGLT1 auf die Öffnung der spannungs-abhängigen Cav1.3-Kanäle dar. Abkürzungen: Cav1.3 = spannungsabhängiger Calciumkanal 1.3;

SGLT1 = sodium-dependent glucose transporter 1, GLUT2 = glucose transporter 2, PKC ß II = Proteinkinase C ß II, T1R2 = Sweet-Taste-Rezeptor T1R2, T1R3 = Sweet-Taste-Rezeptor T1R3 (Modifiziert nach KELLETT et al. 2008).

Transport durch die basolaterale Membran (BLM)

Die Freisetzung von Glukose aus den Enterozyten erfolgt durch erleichterte Diffusion, die durch den in der BLM lokalisierten GLUT2 vermittelt wird (THORENS et al. 1990;

THORENS 1993).

Untersuchungsergebnisse von CHEESEMAN und HARLEY (1991), MIYAMATO et al. (1993) und SALMON et al. (2002) geben Anlass zu der Annahme, dass auch der Glukosetransport durch den GLUT2 in der BLM an eine kohlenhydratreiche Nahrung adaptiert werden kann. CHEESEMAN und HARLEY (1991) konnten zeigen, dass sich die maximale Glukoseaufnahme in jejunale BLMV von Ratten erhöht, wenn diese von einem stärkearmen auf ein stärkereiches Futter umgestellt werden. Parallel hierzu beobachteten sie eine vermehrte Bindung von Cytochalasin B (interagiert mit GLUT2) an die BLM. In den Experimenten von MIYAMATO et al. (1993) führte die

Glukose

Verabreichung eines glukosereichen Futters zu erhöhten Gehalten an jejunaler GLUT2-mRNA bei Ratten. Bei den von SALMON et al. (2002) durchgeführten Studien wiesen Pferde, die mit einem stärkereichen Konzentrat gefüttert wurden, eine höhere GLUT2-Expression in der BLM des Dünndarms auf als Pferde, die ausschließlich Gras zu sich nahmen.

Studien mit GLUT2-Knockout-Mäusen deuten darauf hin, dass neben dem GLUT2 noch ein weiterer Ausschleusungsmechanismus für Glukose existiert. Diese Tiere konnten den fehlenden GLUT2 vermittelten Glukosetransport durch die Exozytose von Glukose kompensieren. Voraussetzung hierfür war eine Phosphorylierung von Glukose zu Glukose-6-Phosphat und deren anschließender Transfer in das Endoplasmatische Retikulum (STÜMPEL et al. 2001). Eine ähnliche Beobachtung wurde in der Humanmedizin bei einem Patienten, der unter dem Fanconi-Bickel-Syndrom litt, gemacht. Obwohl dieser Patient keinen GLUT2 exprimieren konnte, war die intestinale Glukoseresorption bei ihm nicht beeinträchtigt (SANTER et al. 2003).