Durchführung

Zu Präparationsbeginn wurde jeweils eine Darmprobe von 20 bis 30 g in 2 ml 4°C kaltem Präparationspuffer 1 pro 1 g Darmgewebe aufgetaut. Um die Proteaseaktivi-tät durch kalte Umgebungstemperaturen weitestgehend zu minimieren, wurden der Puffer und das Gewebe zum Auftauen in ein Becherglas gegeben, das in Eis einge-bettet war. Aus dem gleichen Grund wurden alle nachfolgenden Präparationsschritte ebenfalls in von Eis eingefassten Gefäßen oder bei maximal 4°C durchgeführt.

Nach dem vollständigen Auftauen der Probe wurde das Gewebe zur Isolation der

Enterozyten mit dem Puffer in einen Vibromixerbehälter überführt und die Enterozyten mittels Vibromixer (Vibromixer E1; Chemap AG, Volketswil) durch ein 10 min dauerndes Vibrieren bei höchster Stufe vom restlichen Darmgewebe abgeschüttelt. Anschließend wurde die Suspension aus Zellen und Puffer durch ein gewöhnliches Haushaltssieb vom restlichen Darmgewebe separiert und in einem Becherglas aufgefangen. Um die Zellsuspension möglichst vollständig aufzufangen, wurden der Vibromixerbehälter und das Haushaltssieb mit 4 ml 4°C kalten Aq. dest.

pro 1 ml Präparationspuffer 1 nachgespült.

Hierdurch kam es gleichzeitig zu einer Verminderung der Osmolarität des Mediums in einen zu den Zellen hypoosmolaren Bereich, wodurch die Enterozyten osmotisch aufgebrochen wurden. Dieses wurde durch die bei der darauffolgenden Homo-genisierung der Zellsuspension auftretenden Scherkräfte erleichtert (mechanisches Aufbrechen). Die Zellsuspension wurde im Haushaltsmixer (Turboblender, Modell D70; Moulinex) dreimalig für jeweils 1 min auf der vierten Stufe homogenisiert.

Zwischen den einzelnen Mixvorgängen wurde die Suspension in ein Becherglas gegeben und für 2 min auf Eis gestellt, um ein infolge des Mixens eintretendes Erwärmen der Suspension weitestgehend zu verhindern. Nach dem letzten Mixvor-gang wurde der entstandene Schaum mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt.

Das gewonnene Homogenat, das im Folgenden als Ausgangshomogenat bezeichnet wird, diente als Bezugsgröße bei der Bestimmung der Anreicherungsfaktoren der BLM und der BSM sowie bei der Ermittlung der Proteinausbeuten (Kapitel 3.5.2). Für die zu diesen Berechnungen notwendigen Protein- und Enzymmessungen wurden viermal 250 µl des Ausgangshomogenats in Eppendorf-Caps aliquotiert und bei –20°C eingefroren.

Dem restlichen Ausgangshomogenat wurde MgCl2 bis zu einer Endkonzentration von 10 mmol · l^-1 unter langsamem Rühren tropfenweise hinzugefügt. Hierzu wurde das Becherglas vorübergehend (ca. 30 s) auf einen Magnetrührer gestellt und die Flüssigkeit langsam gerührt. Anschließend wurde das Becherglas erneut in Eis eingebettet und die Probe für 15 min inkubiert. Während dieser Zeit sollten die Mg²⁺-Ionen die verschiedenen Membranfragmente in Abhängigkeit von deren

Ober-flächenladung in unterschiedlichem Maße aggregieren und dadurch deren Sepa-ration durch sich anschließende Differentialzentrifugationen ermöglichen. SCHMITZ et al. (1973) gehen davon aus, dass die BSM weniger negative Ladungen besitzen als die BLM und die Membranen der Zellorganellen. Deshalb, so vermuten SCHMITZ et al. (1973), werden sie im Vergleich zu diesen weniger stark aggregiert. BOOTH und KENNY (1974) sowie WILSON und WEBB (1990) hingegen nehmen an, dass die BSM weniger stark aggregiert werden, da die negativen Ladungen der BSM räumlich anders angeordnet sind als die der anderen Membranen. Die negativen Ladungen seien auf der BSM so angeordnet, dass jeweils zwei benachbarte negative Ladungen die positiven Ladungen eines bivalenten Mg-Ions kompensieren. Bei den anderen Membranen hingegen könne nur eine positive Ladung eines bivalenten Mg-Ions pro Membranfragment kompensiert werden, so dass es zu sog. „Cross-links“

zwischen den Membranfragmenten komme.

Im Anschluss an die Inkubation wurde das Homogenat 18 min (gesamte Zentrifugationsdauer) bei 3.295 g (g bezieht sich auf rmax) und 4°C zentrifugiert (Zentrifuge RC5C, Rotor GSA; Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington), um die Aggregate aus basolateralen Membranfragmenten und Zellorganellen sowie noch integere Zellen auszufällen. Das entstandene Pellet wurde verworfen und der gewonnene Überstand 40 min (gesamte Zentrifugationsdauer) bei 26.890 g (g bezieht sich auf rmax) und 4°C zentrifugiert (Zentrifuge RC5C, Rotor GSA; Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington). Daraufhin wurde der Überstand, der v. a. aus Zytoplasma und Pufferlösung bestand, dekantiert.

Um die in dem Pellet enthaltenen BSM noch stärker anzureichern, wurde das Pellet in 35 ml Präparationspuffer 2 aufgeschwemmt und zusammen mit dem Puffer in ein Pottergefäß überführt. In diesem wurden die Probe und der Puffer mit einem Elvehjem-Potter (Potter S30; B. Braun Melsungen AG, Melsungen) durch zehn

„Strokes“ bei höchster Stufe homogenisiert. Gleichzeitig kam es hierbei zu einem mechanischen und osmotischen (Osmolarität des Präparationspuffers 2: 78 mOsm) Aufbrechen von Membranen, die sich zu Vesikeln geschlossenen hatten. Auf diesen Arbeitsschritt folgte eine zweite MgCl2-Fällung, die in gleicher Weise ausgeführt wurde wie die erste MgCl2-Fällung. Die sich daran anschließenden

Differential-zentrifugationen (18 min, 3.295 g, 4°C und 40 min, 26.890 g, 4°C) wiederholten sich ebenfalls, mit dem Unterschied, dass aufgrund der geringeren Probenmenge ein anderer Rotor (Rotor SS34; Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington) verwendet wurde.

Zur Füllung der Vesikel mit dem Präparationspuffer 3 wurde das Pellet in 35 ml dieser Pufferlösung aufgeschwemmt und anschließend einer Behandlung mit dem Elvehjem-Potter (zehn „Strokes“ bei höchster Stufe) unterzogen. Hierbei kam es zu einem vorübergehenden mechanischen Aufbrechen der zu Vesikeln geschlossenen Membranen. Anschließend haben sich die BSM aufgrund des Bestrebens in einem wässrigen Milieu eine möglichst kleine Oberfläche einzunehmen wieder zu Vesikeln geschlossen, wobei der Präparationspuffer 3 in das Vesikellumen eingeschlossen wurde. Nach RÜBELT (1995), KESSLER et al. (1978), KLIP et al. (1979) und GAINS und HAUSER (1981) schließt sich der überwiegende Teil der BSM dabei entsprechend den In-vivo-Verhältnissen („right-side out“). Das bedeutet, dass die luminale Membranoberfläche nach außen gerichtet ist.

Durch eine letzte Zentrifugation für 45 min (gesamte Zentrifugationsdauer) bei 34.540 g (g bezieht sich auf rmax) und 4°C (Zentrifuge RC5C, Rotor SS34; Sorvall Instruments) wurden die BSMV im Pellet konzentriert.

Das Pellet wurde mit einer 1-ml-Einmalspritze mit einer 0,45 x 23 mm Kanüle durch mehrmaliges Aufziehen je nach Größe des Pellets in 1 bis 2 ml Präparationspuffer 3 resuspendiert. Aus dieser Suspension, die im Folgenden als Vesikelsuspension bezeichnet wird, wurden viermal 125 µl in Eppendorf-Caps pipettiert und bis zur Bestimmung der Enzymaktivitäten und Proteinkonzentrationen bei -20°C eingefroren.

Die Proteinkonzentrationen und Enzymaktivitäten in der Vesikelsuspension dienten neben denen des Ausgangshomogenats zur Berechnung der Anreicherungsfaktoren und Proteinausbeuten (Kapitel 3.5.2). Von der restlichen Vesikelsuspension wurden jeweils 500 µl in Eppendorff-Caps aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Messung der Glukoseaufnahmen in die Vesikel bei -80°C gelagert.

Die einzelnen Präparationsschritte sind zum besseren Verständnis noch einmal schematisch in der Abbildung 3.2 zusammengefasst.

Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der Präparation von jejunalen BSMV der Ziege (g bezieht sich auf rmax, die Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte Zentrifugationsdauer)

Isolation der Enterozyten

Osmotisches und mechanisches Aufbrechen der Enterozyten

Ausgangshomogenat

MgCl2-Fällung Zentrifugation (18 min, 2.987 g)

Pellet verwerfen Überstand

Zentrifugation (40 min, 26.890 g)

Pellet resuspendieren

MgCl2-Fällung Zentrifugation (18 min, 2.987 g)

Pellet verwerfen Überstand

Zentrifugation (40 min, 26.890 g) Überstand verwerfen

Pellet resuspendieren Zentrifugation (45 min, 34.540 g)

Überstand verwerfen

Pellet resuspendieren, Vesikelsuspension

Überstand verwerfen

Untersuchung der Glukose- aufnahme in die BSMV

Proben für Enzym- und Proteinbestimmungen

Proben für Enzym- und Proteinbestimmungen