Bestimmung der Stärke- und Glukosekonzentrationen in den Ingesta 29

3.3.1 Gefriertrocknung der Ingesta

Nach einer Gefriertrocknung (Gefriertrocknungsanlage Alpha 2-4; Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode) von 48 h wurden die Ingestaproben zur Bestimmung der Stärke- und Glukosekonzentrationen in das Institut für Tierernährung der Freien Universität Berlin (zu Hd. Dr. K. Schäfer) geschickt.

3.3.2 Vorbehandlung der gefriergetrockneten Ingesta

Die gefriergetrockneten Proben wurden zunächst einer Vorbehandlung mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und Salzsäure (HCl) unterzogen, um die enthaltene Stärke in eine lösliche Form zu überführen.

Dazu wurde jeweils 1 g Probe in einen 100 ml Erlenmeyerkolben eingewogen. Nach der Zugabe von 20 ml DMSO und 5 ml HCl (8 mol · l^-1) wurde der Kolben mit Para-film verschlossen und für 30 min in einem 60°C warmen Schüttelwasserbad inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde die Probe rasch auf Raum-temperatur abgekühlt, mit 50 ml Aq. bidest. versetzt und mit Natronlauge (NaOH, 8 mol · l^-1) unter kräftigem Schütteln auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 eingestellt.

Danach wurde das Probevolumen mit Aq. bidest. auf 100 ml aufgefüllt und für 5 bis 10 min bei 10.000 bis 13.000 UPM in einer Minizentrifuge (Minifuge 2; Heraeus-Christ GmbH, Osterode) zentrifugiert. Von dem erhaltenen Überstand wurden jeweils 0,1 ml mit einer Pipette abgenommen und zur Bestimmung der Stärke- und Glukosekonzentrationen verwendet.

3.3.3 Bestimmung der Stärkekonzentrationen in den Ingesta

Die Ermittlung der Stärkekonzentrationen erfolgte mit einem modifizierten UV-Test zur Bestimmung von nativer Stärke und von Stärkepartialhydrolysaten in Lebens-mitteln und anderen Probematerialien der Fa. R-Biopharm AG, Darmstadt.

Testprinzip

Bei diesem Test wird Stärke in einem ersten Reaktionsschritt (1) durch Amylogluko-sidase (AGS) zu Glukose gespalten. Während des zweiten Reaktionsschrittes (2) wird die freigesetzte Glukose in Gegenwart von ATP durch Hexokinase (HK) unter Entstehung von ADP zu Glukose-6-Phosphat phosphoryliert. Dieses wird wiederum in einem dritten Reaktionsschritt (3) durch Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P-DH) zu Glukonat-6-Phosphat oxidiert, wobei NADP⁺ zu NADPH und H⁺ reduziert wird. Die entstehende Menge an NADPH ist proportional zur Stärkemenge und kann photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm erfasst werden.

(1) Stärke + H2O Glukose

(2) Glukose + ATP Glukose-6-Phosphat + ADP

(3) Glukose-6-Phosphat + NADP⁺ Glukonat-6-Phosphat + NADPH + H⁺

Durchführung

Jeweils 0,1 ml Probelösung wurden mit 0,2 ml Testlösung 1 (Citrat-Puffer; AGS) gemischt und für 15 min bei 55 bis 60°C in einem Wasserbad inkubiert. 3 min nach Zugabe von 1,0 ml Testlösung 2 (Triethanolamin-Puffer; NADP; ATP) und 1,0 ml Aq. bidest. und dem Mischen der Substanzen wurde die Extinktion (E1) der Probelösung abgelesen. Durch eine weitere Zugabe in Form von 0,02 ml Testsuspension 3 (HK; G-6-P-DH) wurde die Bildung von NADPH gestartet. Nach 10 bis 15 min kam diese zum Stillstand und die Extinktion (E2) der Probelösung wurde abgelesen. Parallel zu den Extinktionen der Probe wurden die Extinktionen E1 und E2 des Reagenzienleerwerts erfasst, indem anstelle von 0,1 ml Probe 0,1 ml Aq.

bidest. eingesetzt wurden.

Die Messung der Extinktionen der Proben und der Reagenzienleerwerte erfolgte als Doppelbestimmung. Zur anschließenden Berechnung der Stärkekonzentrationen wurden die Mittelwerte der Doppelbestimmungen eingesetzt.

Berechnung der Stärkekonzentrationen

Bei der Berechnung der Stärkekonzentrationen wurde für jede Probe zunächst die Extinktionsdifferenz der Probe und die des zugehörigen Reagenzienleerwerts berechnet und anschließend die Extinktionsdifferenz des Reagenzienleerwerts von derjenigen der Probe abgezogen.

ΔE = (E2 - E1)_Probe - (E2 - E1)Reagenzienleerwert

Daraufhin wurde das erhaltene ΔE in die allgemeine Berechnungsformel für die Bestimmung von Konzentrationen eingesetzt und die Stärkekonzentration in g Stärke pro l Probelösung ermittelt.

HK

G6P-DH AGS

Testvolumen · MolekulargewichtStärke · ΔE

Extinktionskoeffizient NADPH · Schichtdicke Küvette · Probevolumen · 1000

Da die Proben im Rahmen der Probenvorbereitung eingewogen wurden, wurde das Analyseergebnis nachfolgend auf die Einwaage bezogen.

cStärke [g · l^-1 Probelösung]

EinwaageProbe [g · l^-1 Probelösung]

In einem letzten Schritt wurde der Gehalt an Stärke pro kg gefriergetrockneter Ingesta schließlich anhand des Probegewichts vor und nach der Gefriertrocknung auf den Gehalt pro kg FM der Ingesta umgerechnet.

3.3.4 Bestimmung der Glukosekonzentrationen in den Ingesta

Die Bestimmung der Glukosekonzentrationen erfolgte ebenfalls mit dem modifizierten UV-Test zur Bestimmung von Stärke und von Stärkepartialhydrolysaten in Lebensmitteln und anderen Probematerialien der Fa. R-Biopharm, Darmstadt (Kapitel 3.3.3), indem die Extinktionen der Probelösungen nach der Vorbehandlung mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und Salzsäure (HCl) (Kapitel 3.3.2) in einem Reaktionsansatz ohne Inkubation mit Amyloglukosidase (AGS) gemessen wurden.

Testprinzip

Analog zu der bei der Stärkebestimmung freigesetzten Glukose wird die in den Ingesta ursprünglich vorhandene Glukose zunächst (1) durch Hexokinase (HK) zu Phosphat phosphoryliert und anschließend (2) durch Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P-DH) zu Glukonat-6-Phosphat oxidiert. Dabei bildet sich NADPH. Die gebildete Menge an NADPH ist äquivalent zur Glukose-konzentration und wird aufgrund seiner Absorption bei 340 nm photometrisch bestimmt.

(1) Glukose + ATP Glukose-6-Phosphat + ADP

(2) Glukose-6-Phosphat + NADP⁺ Glukonat-6-Phosphat + NADPH + H⁺ cstärke =

GehaltStärke [g · kg^-1 Ingestagefriergetrocknet] =

G6P-DH HK

Durchführung

Jeweils 0,1 ml Probelösung wurden mit 1,0 ml Testlösung 2 (Triethanolamin-Puffer;

NADP; ATP) sowie 1,0 ml Aq. bidest. gemischt und die Extinktion (E1) der Probelösung nach 3 min abgelesen. Nach der Zugabe von 0,02 ml Testsuspension 3 (HK; G-6-P-DH) und dem Vermischen der Reagenzien wurde die Extinktion (E2) nach 10 bis 15 min abgelesen. Parallel zu den Extinktionen der Probelösung wurden die Extinktionen E1 und E2 des Probeleerwerts erfasst, indem anstelle von 0,1 ml Probelösung 0,1 ml Aq. bidest. eingesetzt wurden.

Analog zur Bestimmung der Stärkekonzentrationen wurden die Extinktionen der Proben und der Probeleerwerte als Doppelbestimmungen gemessen und für die anschließende Berechnung der Glukosekonzentrationen die Mittelwerte der Doppelbestimmungen verwendet.

Berechnung der Glukosekonzentrationen

Bis auf den Unterschied, dass anstelle von den Extinktionsdifferenzen der Reagen-zienleerwerte mit denjenigen der Probeleerwerte gerechnet wurde, erfolgte die Berechnung der Glukosekonzentrationen wie diejenige der Stärkekonzentrationen (Kapitel 3.3.3). Um die Glukosekonzentrationen in den Ingesta mit Literaturdaten vergleichen zu können, wurden die Gehalte an Glukose in g pro kg FM nachfolgend anhand des Molekulargewichts von Glukose in mmol pro kg FM umgerechnet.