Anreicherungen der BSM und der BLM; Proteinausbeuten

Das Ziel der Präparationen war es, Vesikelsuspensionen zu gewinnen, die hohe Gehalte an BSMV und geringe Gehalte an Verunreinigungen durch Zellorganellen, Zytoplasma und BLM aufweisen.

Bei den Ursprungsarbeiten zur angewandten Präparationsmethode kam es während der Präparationen nur zu minimalen Verunreinigungen der Vesikelsuspensionen mit Mitochondrien, endoplasmatischen Retikula, Lysosomen und Zytoplasma. Diese Zellkomponenten waren in den Vesikelsuspensionen stets in geringeren Mengen vorhanden als in den Ausgangshomogenaten. Anders sah es jedoch für die Verunreinigungen der Vesikelsuspensionen mit BLM aus. Bei einigen Präparationen wurden die BSM nicht auf der Höhe der Schlussleisten (Tight Junctions) von den BLM getrennt, so dass an den BSM noch Fragmente von BLM hafteten. Je nach Präparation lag die Anreicherung der BLM in der Vesikelsuspension gegenüber dem Ausgangshomogenat deshalb in einer Größenordnung von 0,5 bis 5,0 (BOOTH u.

KENNY 1974; BIBER et al. 1981; BINDER u. MURER 1986; RÜBELT 1995).

Um eine Verfälschung der gemessenen Glukoseaufnahmen in die BSMV durch eine zu geringe Anreicherung der BSM in der Vesikelsuspension oder eine zu hohe Verunreinigung derselben durch BLM weitestgehend zu vermeiden, wurden im Zuge dieser Arbeit nach jeder Präparation die Anreicherungsfaktoren der BSM und der BLM in den Vesikelsuspensionen gegenüber den Ausgangshomogenaten bestimmt.

Für die funktionellen Untersuchungen wurden nur diejenigen Vesikelsuspensionen verwendet, die folgende Kriterien erfüllten: die BSM mussten um mindestens das 14-fache und die BLM durften um höchstens das Vierfache in den Vesikel-suspensionen gegenüber den Ausgangshomogenaten angereichert sein. Die relativen Anreicherungen der BSM gegenüber den BLM (Anreicherungsfaktor für die BSM/Anreicherungsfaktor für die BLM) sollten mindestens sechsfach sein.

Auf die Bestimmung der Anreicherungsfaktoren der Mitochondrien, der Endoplasmatischen Retikula, der Lysosomen und des Zytoplasmas wurde verzichtet, da diese Faktoren in den Ursprungsarbeiten zur Präparationsmethode stets kleiner eins waren und die Verunreinigung damit als vernachlässigbar anzunehmen ist.

Zwecks Bestimmung der Anreicherungsfaktoren wurden in den Ausgangshomo-genaten und in den Vesikelsuspensionen die Aktivitäten der alkalischen Phosphatase und der Na⁺/K⁺-ATPase gemessen. Die alkalische Phosphatase gilt als Leitenzym der BSM (GEORGE u. KENNY 1972), die Na⁺/K⁺-ATPase hingegen als Leitenzym der BLM (ROSTGAARD u. MØLLER 1980).

Bei den Präparationen der BSMV kam es v. a. durch das Ausfällen von Zellorganellen und BLM sowie durch das Dekantieren von Zytoplasma zu einer Abnahme der Proteingehalte in den Proben. Als Maß für die Abnahme der Protein-gehalte wurden die Proteinausbeuten berechnet. Hierzu wurde jeweils der Proteingehalt in der Vesikelsuspension durch den Proteingehalt im Ausgangs-0homogenat dividiert und der Quotient anschließend mit dem Faktor 100 multipliziert.

3.5.2.1 Bestimmung der Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (AP)

Die Bestimmung der Aktivitäten der AP erfolgte mit p-Nitrophenylphosphat, das erstmals von OHMORI (1937) zur Aktivitätsmessung der AP verwendet wurde.

Testprinzip

Die AP katalysiert die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat zu Phosphat und p-Nitrophenol, das sich in alkalischer Lösung gelb färbt. Die Freisetzung von p-Nitrophenol und dessen Gelbfärbung erfolgen proportional zur AP-Aktivität, so dass die AP-Aktivität mittels p-Nitrophenol photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen werden kann.

p-Nitrophenylphosphat + H2O Phosphat + p-Nitrophenol

Durchführung

Die bei -20°C zwischengelagerten Proben wurden zunächst vorsichtig in Eis eingebettet aufgetaut, durch Aufziehen mit einer 1-ml Einmalspritze und einer aufgesetzten 0,25 x 40 mm Kanüle homogenisiert und anschließend 1:20 (Aus-gangshomogenat) bzw. 1:160 (Vesikelsuspension) mit Aq. dest. verdünnt. 50 µl der

AP

verdünnten Proben wurden dann in 2,5 ml Makroküvetten (Einmalküvetten; Brand GmbH + Co KG, Wertheim) pipettiert und mit 3 ml 25°C warmen AP-Puffer (1,02 mol · l^-1 Diethanolamin, 0,51 mmol · l^-1 MgCl2, 10 mmol · l^-1 Na-Nitrophenylphosphat, 32%ige HCl, pH 9,8) versetzt. Unmittelbar darauf wurden die Proben in ein Photometer (Spectrophotometer DU 640; Beckmann Coulter GmbH, Krefeld) gegeben und die Extinktionen dieser Proben in Intervallen von jeweils 1 min über einen Zeitraum von 4 min gegen Luft gemessen.

Die Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen. Für die Berechnung der Aktivität der Proben wurde der Mittelwert der Doppelbestimmungen eingesetzt.

Berechnung der Aktivitäten

Zur Berechnung der Aktivitäten wurden die während 1 min stattfindenden Extinktionsänderungen der Proben (ΔEmin) in folgende Formel eingesetzt:

Gesamtvolumen · 1000 · ΔE_min

Extinktionskoeffizientp-Nitrophenol · SchichtdickeKüvette · Probevolumen

Anschließend wurden die Ergebnisse auf den Proteingehalt der Proben bezogen.

U · l^-1 Probe mg Protein · ml^-1 Probe

3.5.2.2 Bestimmung der Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase

Die Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase wurden nach MIRCHEFF und WRIGHT (1976) photometrisch als Differenzen der ATPase-Aktivität ohne und mit Ouabainzusatz ermittelt.

Testprinzip

Durch die Aktivität von ATPasen wird anorganisches Phosphat aus ATP freigesetzt, welches in saurer Lösung mit Molybdat zu Phosphomolybdänsäure reagiert. Die Phosphomolybdänsäure wird anschließend zu Molybdänsäure, einem blauen Farb-komplex, reduziert, der bei einer Wellenlänge von 690 nm im Photometer gemessen

[U · l ^-1]Probe =

[U · mg^-1 Protein]Probe=

werden kann.

Ouabain fungiert als spezifischer Inhibitor der Na⁺/K⁺-ATPase Aktivität. Deshalb ist es möglich, aus der Differenz der Extinktionswerte ohne und mit Ouabainzusatz die Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase separat von denen unspezifischer ATPasen zu erfassen.

Durchführung

Die Proben wurden vorsichtig auf Eis aufgetaut und 1:2 (Ausgangshomogenat) bzw.

1:5 (Vesikelsuspension) mit Aq. dest. verdünnt. Für jede Probe sowie für den Leerwert wurden jeweils 0,5 ml Assaymix-Puffer (5 mmol · l^-1 MgCl2, 100 mmol · l^-1 NaCl, 10 mmol · l^-1 KCl, 100 mmol · l^-1 Tris (basisch), 2 mmol · l^-1 ATP, 3 mmol · l^-1 EDTA; 32%ige HCl, pH 7,95) ohne und mit Zusatz von 6,86 mmol · l^-1 Ouabain für 5 min in einem Heizblock auf 37°C erwärmt. Anschließend wurden 20 µl Probe bzw.

20 µl Aq. dest. (Leerwert) hinzupipettiert, die Substanzen gemischt und für 30 min im Heizblock bei 37°C inkubiert. Die während dieser Zeit stattfindende Freisetzung von anorganischem Phosphat aus ATP wurde durch die Zugabe von 0,5 ml 5%iger Trichloressigsäure und die dadurch hervorgerufene Proteinfällung gestoppt. Nach dem Hinzugeben von 1 ml Farbreagenz (1,15 mmol · l^-1 H2SO4, 8,9 mmol · l^-1 Ammoniumheptamolybdat, 143,8 mmol · l^-1 FeSO4) konnte das freigesetzte anorganische Phosphat dann während einer 30 min andauernden Inkubation bei 21°C mit Molybdat zu Phosphomolybdänsäure reagieren, die unmittelbar darauf zu Molybdänsäure reduziert wurde. Die Extinktionen der Proben wurden im Photometer (2,5 ml Makroküvetten, Einmalküvetten; Brand GmbH + Co KG, Wertheim/Spectro-photometer DU 640; Beckmann Coulter GmbH, Krefeld) bei 690 nm gegen den Leerwert gemessen.

Die Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen; die Berechnungen der Aktivitä-ten erfolgAktivitä-ten mit den MittelwerAktivitä-ten der Doppelbestimmungen.

Berechnung der Aktivitäten

Um die Aktivitäten der Na⁺/K⁺-ATPase zu ermitteln, wurden die Differenzen aus den Extinktionswerten ohne und mit Ouabainzusatz (ΔE) gebildet und diese Werte in die folgende Formel eingesetzt:

Gesamtvolumen · 1000 · ΔE

ExtinktionskoeffizientMolybdänsäure · SchichtdickeKüvette · Probevolumen

Anschließend wurden die Ergebnisse wie unter Kapitel 3.5.2.1 beschrieben auf den Proteingehalt der Proben bezogen.

3.5.2.3 Bestimmung der Proteingehalte

Die Bestimmung der Proteingehalte fußte auf dem Bio-Rad Protein Assay der Fa.

Bio-Rad Laboratories GmbH, München.

Testprinzip

Das Absorptionsmaximum des in diesem Assay enthaltenen Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 verschiebt sich in saurer Lösung durch die Bindung an Proteinstrukturen von 465 nm nach 595 nm (BRADFORD 1976). Hierbei wird der zuvor als rotes Kation vorliegende Farbstoff in eine anionische Form überführt und blau gefärbt. Die Menge des gebildeten blauen Farbstoffs ist proportional zur Proteinkonzentration in der Probe und kann photometrisch bestimmt werden.

Durchführung

Zu Beginn des Tests wurden die Proben in Eis eingebettet aufgetaut, durch Aufziehen mit einer 1-ml Einmalspritze und einer aufgesetzten 0,25 x 40 mm Kanüle homogenisiert und 1:20 mit Aq. dest. verdünnt. 50 µl der verdünnten Proben wurden dann in Reagenzgläser pipettiert und mit der gleichen Menge an Saponinlösung (1%ig) versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 20 min bei 21°C, während derer die Darstellung der Proteinbindungsstellen durch das oberflächenaktive Saponin verbessert werden sollte, erfolgte die Zugabe von je 2,5 ml des 1:5 mit Aq. dest.

verdünnten Bio-Rad Farbreagenz. Hiernach wurden die Ansätze für 10 min bei 21°C stehen gelassen und ihre Extinktionen anschließend im Photometer (2,5 ml Makroküvetten, Einmalküvetten; Brand GmbH + Co KG, Wertheim/Spectrophoto-meter DU 640, Beckman Coulter GmbH, Krefeld) bei 595 nm gegen den Leerwert (50 µl Aq. dest. + 50 µl Saponin + 2,5 ml des 1:5 verdünnten Farbreagenz) gemes-sen. Parallel dazu wurden die Extinktionen von vier verschiedenen Konzentrationen

[U · l ^-1]Probe =

(0,139, 0,278, 0,417 und 0,556 mg · ml^-1) eines Standardproteins (bovines Plasma-γ-Globulin; Bio-Rad Laboratories GmbH, München) gemessen.

Die Extinktionen der Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen. Für die nach-folgende Berechnung der Proteinkonzentrationen wurden die Mittelwerte eingesetzt.

Berechnung der Proteinkonzentrationen

Aus den Extinktionen und Konzentrationen des Standardproteins wurde jeweils eine lineare Regressionsgrade erstellt. Anhand dieser konnte von den Extinktionswerten der Proben auf deren Konzentrationen geschlossen werden.