Messung der Glukoseaufnahmen in die BSMV

3.5.3.1 Durchführung

Zur Messung der Glukoseaufnahmen in die BSMV wurde jeweils eine bei -80°C zwischengelagerte Vesikelsuspension zunächst in Eis eingebettet aufgetaut.

Anschließend wurde sie durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 1-ml Einmalspritze, auf die eine Einmalkanüle (Ø 0,45 x 25 mm) aufgesetzt wurde, homogenisiert.

Pro Probe bzw. Inkubationsansatz wurden dann 20 µl der homogenisierten Vesikel-suspension und 80 µl eines radioaktiv markierten Inkubationsmediums in ein Reaktionsröhrchen pipettiert, auf einem Schüttler vermischt und je nach Versuchs-ansatz für eine bestimmte Zeitdauer bei Raumtemperatur inkubiert.

Durch die Zugabe von 1 ml eiskalter Stopplösung (150 mmol · l^-1 KCl, 10 mmol · l^-1 Hepes; Tris (basisch), pH 7,4) in das Reaktionsröhrchen wurde die während dieser Zeitspanne stattfindende Glukoseaufnahme in die Vesikel abgebrochen.

Unmittelbar darauf folgend wurde die Vesikelsuspension mittels Schnellfiltrations-technik von der Inkubationslösung getrennt. Hierzu wurde der Inhalt des Reaktions-röhrchens auf einen Membranfilter (Nitrocellulose-Membranfilter, Porengröße 0,65 µm; Sartorius AG, Göttingen) gegeben, der sich auf einer Absaugvorrichtung befand.

Diese bestand aus einer Absaugflasche in der mittels einer Membranpumpe (Typ N035AN.18; KFN Neuberger, Freiburg) ein Unterdruck erzeugt wurde und einer

Glasfritte, auf die der Filter gelegt wurde. Die Vesikel blieben in den Poren des Membranfilters hängen, wohingegen die Stopplösung und das Inkubationsmedium die Poren, angesaugt durch den in der Absaugflasche herrschenden Unterdruck, ungehindert passieren konnten und in der Flasche aufgefangen wurden. Um die Probe vollständig aus dem verwendeten Reaktionsröhrchen zu entfernen, wurde dieses mit 1 ml eiskalter Stopplösung nachgespült und der Inhalt erneut auf den Membranfilter gegeben.

Der Filter wurde zweimal mit 4 ml eisgekühlter Stopplösung nachgespült, bevor er in ein Minivial (Polyethylen Vial, 6 ml; PerkinElmer, Life Sciences, Dreieich) gegeben und mit 4,3 ml Szintillationscocktail (Lumasafe^TM Plus; Luma * LSC B.V. der Fa.

PerkinElmer Life Sciences, Dreieich) versetzt wurde. Die Messung der Radioaktivität erfolgte in einem Flüssigkeitsszintillationsmessgerät (Tri-Carb 2500 TR Liquid Scintillation Analyzer; Canberra-Packard GmbH, Dreieich). Die Zähldauer betrug 10 min pro Probe, der statistische Zählfehler lag bei 2 bis 3%.

Ein Teil der radioaktiv markierten Glukose bindet unspezifisch an den Filter. Um diesen Anteil (Leerwert) zu bestimmen, wurden 80 µl des Inkubationsmediums mit 1 ml eiskalter Stopplösung versetzt und in gleicher Weise filtriert wie die Proben.

Zur Ermittlung der Gesamtaktivität im Inkubationsansatz wurden 10 µl des Inkubationsmediums direkt in ein Minivial pipettiert, mit 4,3 ml Szintillationscocktail vermischt, die Aktivität im Flüssigkeitsszintillationszähler erfasst und die counts per minute (cpm) mit acht multipliziert.

3.5.3.2 Inkubationsansätze zur zeitabhängigen Glukoseaufnahme

Mit diesen Untersuchungen sollte die funktionelle Integrität der Vesikel überprüft, der Zeitraum einer schnellen linearen Glukoseaufnahme erfasst, der Ausgleichswert bestimmt und damit das Vesikelvolumen berechnet werden.

Für diese Zielsetzungen war eine separate Erfassung der Gesamtglukoseaufnahme, die sich aus einer Na⁺-abhängigen und einer Na⁺-unabhängigen Komponente zusammensetzte und in einem Inkubationsmedium mit Na⁺-Ionen gemessen wurde, von der Na⁺-unabhängigen Glukoseaufnahme notwendig. Letztere wurde in einem

Medium gemessen, in dem die Na⁺-Ionen äquivalent durch K⁺-Ionen ersetzt wurden.

Je Probe bzw. Inkubationsansatz wurden 20 µl Vesikelsuspension zu 80 µl Inkubationsmedium (Tabellen 3.5 und 3.6) pipettiert und vermischt. Die Glukoseauf-nahmen in die BSMV erfolgten bei einer Glukosekonzentration von 0,05 mmol · l^-1 im Inkubationsansatz. Sie wurden nach jeweils 10, 15, 20, 25 und 30 s, 1, 2, 3 und 5 min sowie 1, 2, 2½, 3 und 4 h durch das Hinzufügen von eiskalter Stopplösung abgebrochen.

Tabelle 3.5: Zusammensetzungen [Komponenten in µl] von 80 µl der Na⁺-Ionen oder K⁺-Ionen haltigen Inkubationsmedien. Die radioaktiv markierte Glukoselösung besaß eine Konzentration von 0,5 mmol · l^-1 und enthielt 1 µl radioaktivmarkierter ³H-Glukose mit einer Aktivität von 37 kBq bzw. 1 µCi. Die Zusammensetzung der Transportpuffer wurde gesondert in der Tabelle 3.6 aufgeführt.

Inkubationsmedium (Na⁺) Inkubationsmedium (K⁺)

Aq. dest. 20 20

NaCl-Transportpuffer 50 –

KCl-Transportpuffer – 50

Radioaktive Glukoselösung 10 10

Tabelle 3.6: Zusammensetzungen [Komponenten in mmol · l^-1] der Transportpuffer. Die Puffer wurden mit Tris (1 mmol · l^-1; basisch) bei 21°C auf einen pH-Wert von 7,40 eingestellt.

NaCl-Transportpuffer KCl-Transportpuffer

NaCl 200 –

KCl – 200

Mannit 200 200

Hepes 20 20

3.5.3.3 Inkubationsansätze zur Glukoseaufnahme in Abhängigkeit von der extravesikulären Osmolarität

Um den Glukoseanteil, der nicht in das Lumen der BSMV aufgenommen sondern an die BSM gebunden wird, zu ermitteln, wurden die Gesamtglukoseaufnahmen nach 180 min Inkubationszeit (Äquilibriumszeitpunkt, die intravesikuläre entspricht zu diesem Zeitpunkt der extravesikulären Glukosekonzentration; Kapitel 4.3.3) in Abhängigkeit von der extravesikulären Osmolarität gemessen.

Unter dieser Bedingung führt eine Erhöhung der extravesikulären Osmolarität dazu, dass sich das intravesikuläre Volumen aus osmotischen Gründen verringert und damit einhergehend die Glukoseaufnahme in die Vesikel abnimmt. Es ist davon auszugehen, dass die Membranoberfläche der Vesikel und damit der an sie gebundene Glukoseanteil bei Erhöhung der extravesikulären Osmolarität im Gegensatz zum verminderten Vesikelvolumen und zur verringerten Glukoseaufnahme relativ konstant bleiben.

Die Vesikelvolumina und die Glukoseaufnahmen werden jeweils als Funktion der inversen extravesikulären Osmolarität dargestellt. Hierdurch ergibt sich der sinnvolle Zusammenhang, dass die Glukoseaufnahme auf 0 nmol · mg Protein · 3h^-1 reduziert ist, wenn ein theoretisches Vesikelvolumen von 0 µl · mg^-1 Protein (sehr hohe extravesikuläre Osmolarität) und keine Membranbindung von Glukose vorliegen (Gerade geht durch den Ursprung).

Bei der Durchführung dieser Studie wurden pro Probe bzw. Inkubationsansatz 20 µl Vesikelsuspension und 80 µl von einem von insgesamt sieben Inkubationsmedien in einem Reaktionsröhrchen inkubiert.

Die in diesem Experiment eingesetzten Vesikel waren gemäß Kapitel 3.5.1.2 mit Präparationspuffer 3 gefüllt und zusätzlich in diesem resuspendiert worden. Dieser bestand aus 100 mmol · l^-1 Mannit, 100 mmol · l^-1 KCl und 10 mmol · l^-1 Hepes und besaß eine gemessene Osmolarität von 296 mosm · l^-1.

80 µl Inkubationsmedium setzten sich aus 50 µl von einem der insgesamt sieben Na⁺-Ionen haltigen Transportpuffer (Tabelle 3.7), 20 µl Aq. dest. und 10 µl einer 0,5 mmol · l^-1 radioaktiv markierten Glukoselösung zusammen. Die radioaktiv markierte Glukoselösung enthielt 1 µl ³H-Glukose mit einer Aktivität von 37 kBq bzw. 1 µCi.

Aus den Mengenanteilen und den gemessenen Osmolaritäten des Präparations-puffers 3 und der einzelnen Inkubationsmedien ergaben sich berechnete extravesikuläre Osmolaritäten von 296, 343, 384, 426, 464, 521 und 568 mosm · l^-1 und daraus resultierende inverse extravesikuläre Osmolaritäten (10^-3) von 3,38, 2,90, 2,60, 2,35, 2,16, 1,92 und 1,76 l · mosm^-1 für die einzelnen Inkubationsansätze.

Tabelle 3.7: Zusammensetzungen [Komponenten in mmol · l^-1] und gemessene Osmolaritäten [mosm · l^-1] der eingesetzten Na⁺-Ionen haltigen Transportpuffer. Die Puffer wurden bei 21°C mit 1,0 mmol · l^-1 Tris (basisch) auf einen pH-Wert von 7,40 eingestellt.

Mannit NaCl Hepes Osmolarität

Puffer 1 200 200 20 296

Puffer 2 300 200 20 354

Puffer 3 400 200 20 405

Puffer 4 500 200 20 458

Puffer 5 600 200 20 505

Puffer 6 700 200 20 576

Puffer 7 800 200 20 635

Die Untersuchungen zur Glukoseaufnahme in Abhängigkeit von der extravesikulären Osmolarität wurden für jeden Inkubationsansatz als Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Erfassung der Gesamtaktivität pro Inkubationsansatz erfolgte ebenfalls als Dreifachbestimmung, die der Leerwerte pro Inkubationsansatz als Vierfachbestimmung. Die nachfolgende Berechnung der Glukoseaufnahmen erfolgte mit den Mittelwerten der Mehrfachbestimmungen.

3.5.3.4 Inkubationsansätze zur konzentrationsabhängigen Glukoseaufnahme Diese Studien wurden mit Na⁺-Ionen enthaltenden Inkubationsmedien und mit solchen, in denen sich K⁺-Ionen anstelle von Na⁺-Ionen befanden, vorgenommen.

Hierdurch war eine separate Messung der Gesamtglukoseaufnahme (Na⁺-abhängige Glukoseaufnahme + Na⁺-unabhängige Glukoseaufnahme) und der Na⁺ -unabhän-gigen Glukoseaufnahme bei verschiedenen Glukosekonzentrationen in den Inku-bationsansätzen möglich. Aus der Differenz der Werte der Gesamtglukoseaufnahme und der Na⁺-unabhängigen Glukoseaufnahme konnte die Na⁺-abhängige Glukose-aufnahme kalkuliert und mittels Michaelis-Menten-Gleichung charakterisiert werden.

Je Probe bzw. Inkubationsansatz wurden 20 µl Vesikelsuspension mit 80 µl Inkubationsmedium für 15 s inkubiert. Diese Inkubationsdauer wurde festgelegt, da die Na⁺-abhängige Glukoseaufnahme bei 15 s im linearen Bereich lag (Kapitel 4.3.3) und die Durchführung der Messung bei dieser Inkubationsdauer gut praktizierbar

war. Die Inkubationsmedien (Tabelle 3.8) wurden so zusammengesetzt, dass sich Glukosekonzentrationen von 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 und 1,5 mmol · l^-1 für die Inkubationsansätze ergaben.

Tabelle 3.8: Zusammensetzung [Komponenten in µl] von 80 µl Inkubationsmedium bei verschiede-nen Glukosekonzentratioverschiede-nen im Inkubationsansatz. Die radioaktiv markierte Glukoselösung (= Radio-aktive Glukoselsg.) besaß eine Konzentration von 0,1 mmol · l^-1 und enthielt 1 µl radioaktivmarkierter

³H-Glukose mit einer Aktivität von 37 kBq bzw. 1 µCi. Die Zusammensetzung der Transportpuffer wurde gesondert in der Tabelle 3.6 aufgeführt.

Glukosekonzentration im Inkubationsansatz [mmol · l^-1]

0,01 0,02 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 1,5

Aq. dest. 20,0 17,0 12,0 11,0 16,2 12,2 12,1 17,0

Transportpuffer 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0

Radioaktive Glukoselsg. 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

0,5 mmol · l^-1 Glukose – 3,0 8,0 – – – – –

1,0 mmol · l^-1 Glukose – – – 9,0 – – – –

5,0 mmol · l^-1 Glukose – – – – 3,8 7,8 – –

10,0 mmol · l^-1 Glukose – – – – – – 7,9 –

50,0 mmol · l^-1 Glukose – – – – – – – 3,0

Die Konzentrationen wurden in Anlehnung an eine Parallelstudie (GIERE 2007, persönliche Mitteilung) ausgewählt. In dieser war die Na⁺-abhängige Glukose-aufnahme bei Ziegen bei einer Glukosekonzentration von 1,5 mmol·l^-1 gesättigt.

Zudem befanden sich in etwa gleich viele der o. g. Glukosekonzentrationen unterhalb und oberhalb der in der Parallelstudie ermittelten Km-Werte (0,08 bis 0,13 mmol · l^-1).

Hierdurch sollte eine möglichst genaue Bestimmung des Km-Werts der Na⁺-abhängigen Glukoseaufnahmen erfolgen.

Die Gesamtglukoseaufnahme und die Na⁺-unabhängige Glukoseaufnahme wurden in jedem Inkubationsansatz als Dreifachbestimmung gemessen. Zur Ermittlung der Leerwerte und der Gesamtaktivitäten wurden von jedem Inkubationsansatz vier Proben für den Leerwert und drei Proben für die Gesamtaktivität genommen. Die weitere Berechnung der Glukoseaufnahmen erfolgte mit den Mittelwerten der Mehrfachbestimmungen.