Methodik/Funktionalität der Gewebe

In-vitro-Untersuchungen in Ussingkammern mit intakten Epithelien des Gastro-intestinaltrakts werden seit Jahrzehnten zur Erforschung von intestinalen Trans-portprozessen durchgeführt, da sie es ermöglichen den epithelialen Transport von Ionen oder Molekülen unter definierten Bedingungen zu studieren.

Für die Qualität dieser Studien ist es entscheidend, dass das untersuchte Epithel über den gesamten Versuchsablauf hinweg funktionsfähig bleibt und damit in der Lage ist, Transportprozesse aufrecht zu erhalten.

Die Funktionsfähigkeit der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Epithelien zeichnete sich zum einen dadurch ab, dass die basalen Kurzschlussströme und Gewebeleitfähigkeiten (0,49 bis 0,65 µEq · cm^-2 · h^-1 und 12,1 bis 18,0 mS · cm^-2; Kapitel 3.6.5.2) in einem ähnlichen Bereich lagen wie die aus der Literatur bekannten jejunalen Kurzschlussströme und Gewebeleitfähigkeiten von Schafen und Ziegen.

Diese werden mit -1,04 bis 0,29 µEq · cm^-2 · h^-1 und 25,3 bis 28,8 mS · cm^-2 angegeben (KÄPPNER 1993; RITTMANN 1996) und dürften sich aufgrund abweichender Pufferzusammensetzungen und weiter kaudal erfolgter Entnahmen des Jejunums geringfügig von den eigenen elektrischen Kenngrößen unterscheiden.

Zum anderen reagierten die Epithelien am Ende der Versuchsprotokolle 1 und 2 auf die Zugabe von Forskolin mit einem Anstieg des Kurzschlussstroms, der, wie in Kapitel 3.6.4.3 erläutert, in einer Stimulation der Chloridsekretion begründet ist (BROWN et al. 1990; HEMPE 2007). Der Anstieg des Kurzschlussstroms kann als sicherer Hinweis darauf gewertet werden, dass die Epithelien auch noch zum Ende der Versuche elektrogene Transportprozesse aufrechterhalten konnten und somit über die gesamte Dauer der Versuche funktionsfähig waren.

5.4.2 Messwerte

Versuchsprotokoll 1

Mit dem Versuchsprotokoll 1 sollte v. a. die durch den SGLT1 erfolgende Glukose-aufnahme in die Enterozyten angesprochen werden (Kapitel 3.6).

In dem ersten Zeitfenster, das 20 bis 60 min nach der serosalen und mukosalen Zugabe von jeweils 5 mmol · l^-1 Glukose andauerte (Kapitel 3.6.5.2), lagen die in den Fütterungsgruppen gemessenen glukoseinduzierten Kurzschlussströme zwischen 0,38 und 0,68 µEq · cm^-2 · h^-1. Die Glukosefluxe Jms beliefen sich auf Werte von 0,28 bis 0,35 µmol · cm^-2 · h^-1 und die Glukosefluxe Jnet nahmen einen Messbereich von 0,18 bis 0,25 µmol · cm^-2 · h^-1 ein (Kapitel 4.4.3).

Die glukoseinduzierten Kurzschlussströme (∆Isc (Glk), ∆Isc (Glk) = Isc – Isc (basal);

Kapitel 3.6.5.2) waren mit den glukoseinduzierten Kurzschlussströmen von 0,28 bis 0,98 µEq · cm^-2 · h^-1 vergleichbar, die in Folgestudien im proximalen Jejunum von

Ziegen bei einer serosalen und mukosalen Konzentration von 1 und 5 mmol · l^-1 Glukose gemessen wurden (BREVES et al. 2008, unveröffentlichte Daten). Ähnliche Glukosefluxe Jms wurden von OKINE et al. (1994) in Ussingkammer-Versuchen mit duodenalen Epithelien von Rindern vorgefunden. In ihren Studien wurden die Glukosefluxe mittels ¹⁴C-Glukose bei einer mukosalen Konzentration von 4 bis 6 mmol · l^-1 Glukose und einer serosalen Konzentration von 0 mmol · l^-1 Glukose gemessen. Hierbei betrugen die Glukosefluxe Jms 0,20 bis 0,30 µmol · cm^-2 · h^-1. Die signifikant positiven Glukosefluxe Jnet konnten als sicherer Hinweis auf die Beteiligung aktiver Mechanismen an der Glukoseabsorption betrachtet werden, da während dieses Zeitfensters weder ein elektrischer (Short-Circuit-Modus; Kapitel 3.6.4.3) noch ein chemischer Gradient (identische serosale und mukosale Glukose-konzentrationen; Kapitel 3.6.4.3) als treibende Kraft für einen unidirektionalen Transport bestand. Vermutlich handelte es sich hierbei zumindest teilweise um einen sekundär aktiven Transport, der durch den SGLT1 vermittelt wurde. Hierauf deuten sowohl der Nachweis von SGLT1 in den BSMV der Ziegen mittels Western-Blot-Analyse (Abbildung 5.4) als auch die Höhe der glukoseinduzierten Kurzschluss-ströme hin. Diese waren ungefähr doppelt so hoch wie die Fluxe Jnet. Ein solches Verhältnis von glukoseinduziertem Kurzschlussstrom zum Glukoseflux Jnet würde bei einem Glukosetransport durch den SGLT1 erwarten werden, da dieser ein Glukose-molekül im Symport mit zwei elektrogenen Na⁺-Ionen befördert (MACKENZIE et al.

1998).

Das Zeitfenster 2 erstreckte sich über 20 bis 60 min nach Erhöhung der mukosalen Glukosekonzentration auf 30 mmol · l^-1 (Kapitel 3.6.5.2) und war durch einen Konzentrationsgradienten von 30 mmol · l^-1 Glukose in der mukosalen Pufferlösung gegenüber 5 mmol · l^-1 Glukose im serosalen Puffer charakterisiert. Trotz der um das Sechsfache höheren mukosalen Glukosekonzentration waren die glukoseinduzierten Kurzschlussströme in diesem Zeitfenster sogar niedriger als in Zeitfenster 2. Die Glukosefluxe Jms und Jnet waren hingegen deutlich angestiegen (Kapitel 4.4.3).

Die Tatsache, dass die glukoseinduzierten Kurzschlussströme nicht durch eine Erhöhung der mukosalen Glukosekonzentration von 5 auf 30 mmol · l^-1 stimuliert

werden konnten, deckte sich mit den Ergebnissen von Folgestudien. Bei diesen wurde ebenfalls keine Zunahme der glukoseinduzierten Kurzschlussströme als Folge einer schrittweisen Erhöhung der mukosalen Glukosekonzentration von 5 auf 10 und 15 mmol · l^-1 verzeichnet (BREVES et al. 2008, unveröffentlichte Daten), was für eine bereits bei 5 mmol · l^-1 Glukose vorliegende Sättigung des SGLT1 spricht. Dass die Kurzschlussströme sogar abnahmen, könnte an den in diesem Zeitfenster gegenüber dem Zeitfenster 1 beobachteten Anstiegen der Gewebeleitfähigkeiten liegen (Kapitel 4.4.3). So geht eine Zunahme der parazellulären Gewebeleitfähigkeit mit vermehrten Ausgleichsströmen über das Epithel und damit mit verminderten Kurzschlussströmen einher.

Aufgrund der niedrigen glukoseinduzierten Kurzschlussströme beruhten die gesteigerten Glukosefluxe Jms und Jnet auf nicht elektrogenen Transportvorgängen.

Hierbei könnte es sich um einen GLUT2 vermittelten Glukosetransport (KELLETT u.

HELLIWELL 2000; KELLETT 2001; KELLETT u. BROT-LAROCHE 2005; KELLETT et al. 2008; MACE et al. 2009) und/oder einen parazellulären Glukosetransport (MADARA u. PAPPENHEIMER 1987; PAPPENHEIMER 1987; PAPPENHEIMER u.

REISS 1987) gehandelt haben.

Für die (Co)Existenz des parazellulären Glukosetransports spricht, dass die Gewebeleitfähigkeiten in Zeitfenster 2 höher waren als in Zeitfenster 1. Zudem konnte auch durch andere Arbeitsgruppen gezeigt werden, dass der parazelluläre Transport von Molekülen bei erhöhten luminalen Glukosekonzentrationen zunimmt.

FIHN et al. (2000) fanden eine Stimulation des intestinalen parazellulären Mannitol-transports bei erhöhten luminalen Glukosekonzentrationen in Ratten vor. D´SOUZA et al. (2003) demonstrierten, dass hohe extrazelluläre Glukosekonzentrationen zu Veränderungen in der physikalischen Barriere von Caco-2 Zellen (Zellkulturmodell für humane Enterozyten) und zu einem gesteigerten parazellulären Mannittransport in diese Zellen führten.

Als eine Ursache für die Zunahme des parazellulären Transports bei erhöhten Glukosekonzentrationen wird diskutiert, dass unter diesen Bedingungen Kontrak-tionen im Zytoskelett und eine damit einhergehende Permeabilitätserhöhung der

Schlussleisten (Tight Junctions) auftreten (MADARA u. PAPPENHEIMER 1987;

PAPPENHEIMER 1987; PAPPENHEIMER u. REISS 1987). Des Weiteren könnte es v. a. bei sehr hohen luminalen Glukosekonzentrationen zu einer vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies kommen. Diese könnten zu Veränderungen des Zytoskeletts und der Struktur der Schlussleisten (Tight Junctions) und somit zu einer Steigerung der parazellulären Transportvorgänge führen (D'SOUZA et al. 2003).

Während der auf die mukosale Zugabe des SGLT1-Inhibitors Phlorizin (Kapitel 3.6), folgenden 80 min des Zeitfensters 3 (Kapitel 3.6.5.2) waren die glukoseinduzierten Kurzschlussströme unter das Niveau der basalen Kurzschlussströme abgesunken.

Die Glukosefluxe Jms und Jnet wurden durch die Zugabe von Phlorizin jedoch nicht vermindert (Kapitel 4.4.3).

Die Abnahmen der glukoseinduzierten Kurzschlussströme dürften zum einen auf deren Minderung infolge weiter angestiegener parazellulärer Gewebeleitfähigkeiten (Kapitel 4.4.3) und zum anderen auf einer nahezu vollständigen Hemmung des SGLT1 durch Phlorizin beruht haben. So konnten BREVES et al. (2008a, b) zeigen, dass die auf dem SGLT1 basierenden Fluxe Jnet von 3-Ortho-Methyl-Glukose bei Ziegen durch Phlorizin um etwa 93% reduziert wurden.

Die Hemmung der elektrogenen Transportkomponente hatte vermutlich keinerlei Auswirkungen auf die Glukosefluxe, da die glukoseinduzierten Kurzschlussströme unmittelbar vor den Zugaben einen Anteil von weniger als 12% an den Fluxen Jms

hatten und die Hemmung dieses Anteils aufgrund der Streuungen der Glukosefluxe wahrscheinlich nicht sichtbar war.

Versuchsprotokoll 2

Beim Versuchsprotokoll 2 waren die Ausgangsbedingungen so gewählt, dass der Glukosetransport v. a. durch den GLUT2 erfolgen sollte (Kapitel 3.6)

Das erste Zeitfenster (60 Minuten vor der Hemmstoffzugabe; Kapitel 3.6.5.2) war durch eine serosale und mukosale Glukosekonzentration von 5 und 50 mmol · l^-1 gekennzeichnet. Unter diesen Bedingungen wurden relativ niedrige glukoseindu-zierte Kurzschlussströme und vergleichsweise hohe Glukosefluxe Jms und Jnet

vorgefunden (Kapitel 4.4.6).

Diese Befunde bestätigen die aus dem ersten Versuchsprotokoll gewonnenen Erkenntnisse, dass der Glukosetransport von mukosal nach serosal bei hohen lumi-nalen Glukosekonzentrationen zum überwiegenden Teil durch nicht elektrogene Transportvorgänge vermittelt wurde. Der nicht elektrogene Transport könnte wie beim ersten Versuchsprotokoll auf einem Glukosetransport via GLUT2 (KELLETT u.

HELLIWELL 2000; KELLETT 2001; KELLETT u. BROT-LAROCHE 2005; KELLETT et al. 2008; MACE et al. 2009) und/oder einem parazellulären Glukosetransport (MADARA u. PAPPENHEIMER 1987; PAPPENHEIMER 1987; PAPPENHEIMER u.

REISS 1987) beruht haben, wobei die in diesem Zeitfenster gemessenen hohen Gewebeleitfähigkeiten (Kapitel 4.4.6) zumindest für eine Beteiligung des parazellulären Transportweges sprachen.

Die Zugabe des GLUT2-Inhibitors Phloretin (Kapitel 3.6) führte in den folgenden 80 min (Zeitfenster 2; Kapitel 3.6.5.2) zwar zu einer vollständigen Hemmung der glukoseinduzierten Kurzschlussströme, die Glukosefluxe Jms und Jnet wurden durch diese Zugabe jedoch nicht nennenswert beeinflusst (Kapitel 4.4.6).

Möglicherweise nahmen die Glukosefluxe nach der Phloretinzugabe nicht ab, da kein GLUT2 in der BSM der Ziegen vorhanden war. Vorstellbar wäre auch, dass nur ein sehr geringer Anteil des nicht elektrogenen Glukosetransports von mukosal nach serosal durch den GLUT2 erfolgte. Um einen Ausbau von GLUT2 aus der BSM durch den Verlust von aktivierenden Zuckern (KELLETT 2001; HELLIWELL et al.

2003; KELLETT u. BROT-LAROCHE 2005) so gering wie möglich zu halten, wurden die Gewebe für das Versuchsprotokoll 2 nach der Entnahme in einer Pufferlösung mit 50 mmol · l^-1 Glukose aufbewahrt (Kapitel 3.2.2). Der Verlust von stimulierenden Hormonen oder anderen Nährstoffen (KELLETT 2001; KELLETT u. BROT-LAROCHE 2005) sowie der potenziell mögliche Stress der Tiere beim Schlachten (SHEPHERD et al. 2004) könnten jedoch dennoch zu einem Ausbau von GLUT2 aus der BSM der Ziegen geführt haben, so dass nur ein geringfügiger Anteil des nicht elektrogenen Glukosetransports durch GLUT2 in der BSM erfolgte.

Eine Hemmung dieses Anteils könnte aufgrund der großen Streuung der

Glukose-fluxe nicht sichtbar gewesen sein. Die Interaktionen mit anderen Transportsystemen sowie die Veränderungen der Epithelstruktur dürften das Sichtbarwerden einer potenziellen Hemmung der GLUT2 in der BSM zusätzlich erschwert haben. So deutet der Abfall der Kurzschlussströme darauf hin, dass Phloretin andere epitheliale Transportvorgänge wie z. B. den Chloridtransport (FAN et al. 2001), den Calciumtransport (PREVARSKAYA et al. 1994) oder den Kaliumtransport (KLUSEMANN u. MEVES 1991, 1992) beeinflusst haben könnte. Zudem scheint Phloretin zu abnehmenden Gehalten an zellulärem ATP und damit zu einer verminderten Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase sowie zu einer Akkumulation zellulärer Na⁺-Ionen zu führen, wodurch die Aktivität Na⁺-abhängiger Transportsysteme moduliert wird (RANDLES u. KIMMICH 1978). Der in diesem Zeitfenster zu verzeichnende Anstieg der Gewebeleitfähigkeiten (Kapitel 4.4.6) könnte darauf zurückzuführen sein, dass Phloretin die Epithelstrukturen veränderte (VALENTA et al. 2001a, b; AUNER et al. 2003).

Beeinflussung des Glukosetransports durch die Fütterung

Aufgrund der in den Kapiteln 2.1.1 und 2.2.2 dargestellten Erkenntnisse aus der Literatur, dass hohe luminale Glukosekonzentrationen zu einer gesteigerten Kapa-zität der intestinalen Glukosetransporter führen können, und in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Vesikelstudien (Kapitel 4.3.6) hätten Unterschiede zwischen den Glukosefluxen Jms, den Glukosefluxen Jnet und den glukoseinduzierten Kurzschlussströmen der drei Fütterungsgruppen erwartet werden können.

In Zeitfenster 1 des ersten Versuchprotokolls stiegen die Glukosefluxe Jnet zwar entsprechend den Glukosekonzentrationen im proximalen Jejunum (Kapitel 4.1.2 und 5.1.3.2 ) in der Reihenfolge „Heu“, „Weizen“ und „Mais“ an, signifikante Unterschiede zwischen den Fluxen oder den glukoseinduzierten Kurzschlussströmen konnten je-doch in keinem der Zeitfenster der beiden Versuchsprotokolle nachgewiesen werden.

Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Streuungen der Parameter relativ groß waren. Zudem dürften die Parameter durch hohe parazelluläre Gewebe-leitfähigkeiten und die Metabolisierung der in die Enterozyten aufgenommenen Glukose moduliert worden sein. Verschiedene Studien sprechen dabei dafür, dass

die intrazelluläre Metabolisierung von Glukose bei erhöhten Glukosekonzentrationen in den Enterozyten zunimmt. So erhöhte sich bei den von OKINE et al. (1994) durchgeführten Ussingkammer-Versuchen die Metabolisierung von Glukose zu CO2

im duodenalen Gewebe von Rindern mit steigenden luminalen Glukosekonzen-trationen. OKINE et al. (1995) bestätigten diesen Befund. Sie konnten zeigen, dass die Metabolisierung von Glukose zu CO2 in isolierten duodenalen Enterozyten mit steigender extrazellulärer Glukosekonzentration zunimmt.

5.5 Glukosekonzentrationen im Blutplasma

5.5.1 Methodik

Die Messung der Glukosekonzentrationen im Blutplasma erfolgte mit einer anerkannten Referenzmethode (Kapitel 3.7.2), die gemäß dem Hersteller des Testkits durch eine hohe Sensitivität, Spezifität und Präzision gekennzeichnet ist^.

5.5.2 Messwerte

Die Glukosekonzentrationen im Blutplasma der drei Fütterungsgruppen (3,5 bis 4,0 mmol · l^-1; Kapitel 4.5) lagen in dem Bereich von 2,6 bis 4,2 mmol · l^-1, der als physiologisch für die Glukosekonzentrationen im Plasma von Ziegen angesehen wird (De JONG 1981; MBASSA u. POULSEN 1991; SAHLU et al. 1993; BOSTEDT u.

DEDIÉ 1996; ALI et al. 2006).

Beeinflussung der Glukosekonzentration im Blutplasma durch die Fütterung Die Glukosekonzentration im Blutplasma wird durch eine hormonelle Regulation relativ konstant gehalten. Sie ergibt sich aus der im Dünndarm resorbierten Glukosemenge, der Neubildung von Glukose durch die Glukoneogenese, der Glukosefreisetzung aus Glykogen und der Glukoseaufnahme in die Gewebe.

In der „Heu“-Gruppe wurde eine tendenziell niedrigere Glukosekonzentration im Blutplasma nachgewiesen als in der „Weizen“- und „Mais“-Gruppe. Ursächlich hierfür könnten zum einen die in dieser Fütterungsgruppe vorgefundenen geringen

Glukosekonzentrationen im proximalen und distalen Jejunum (Kapitel 4.1.2, 4.1.3) sein. Zum anderen könnte die geringe Kapazität der jejunalen Glukosetransporter (Kapitel 4.3.6 und 5.3.2) und damit eine vergleichsweise geringe jejunale Glukoseresorption für diesen Befund verantwortlich sein.

Diese Vermutung wird durch Untersuchungen von KREIKEMEIER et al. (1991) und KREIKEMEIER u. HARMON (1995) gestützt. In ihren Studien wiesen Rinder, die Glukose, Dextrine oder Stärke in den Labmagen infundiert bekamen, höhere arterielle Glukosekonzentrationen und höhere portale Glukosenettofluxe auf als Rinder, die eine Wasserinfusion erhielten.

Dieser Vermutung folgend dürfte in der „Mais“-Gruppe im Vergleich zur „Weizen“-Gruppe aufgrund der wahrscheinlich deutlich höheren Glukosekonzentrationen in den jejunalen Ingesta (Kapitel 5.1.3.2 und 5.1.3.3) und einer tendenziell höheren Kapazität des SGLT1 (Kapitel 4.3.6) mehr Glukose in die Enterozyten aufgenommen worden sein. Infolge einer vermehrten intrazellulären Glukosemetabolisierung bei erhöhtem Glukoseangebot (OKINE et al. 1994, 1995) könnte die in der „Mais“-Gruppe mehr aufgenommene Glukose jedoch in den Enterozyten metabolisiert worden sein, so dass sich die Glukoseresorption und die Plasmaglukose-konzentration nicht nennenswert zwischen der „Mais“- und „Weizen“-Gruppe unterschieden.

Weiterhin wäre es vorstellbar, dass sich die hormonelle Regulation der Glukoneo-genese, der Glykolyse und der Glukoseaufnahme in die Gewebe zwischen den Füt-terungsgruppen unterschied. Möglicherweise variierten die Insulin-, Glukagon- und Catecholaminspiegel zwischen den Gruppen, da diese sich bei hohen und niedrigen Blutglukosekonzentrationen voneinander unterscheiden (STANGASSINGER 2004).

Zudem könnten sich aufgrund der Fütterung (Kapitel 3.1.2) die Produktionsraten und die molaren Anteile der kurzkettigen Fettsäuren zwischen den Fütterungsgruppen unterschieden haben (BREVES u. LEONHARD-MAREK 2004). Da es sich bei einem Teil der kurzkettigen Fettsäuren um Substrate der Glukoneogenese handelt, könnte letztere durch die vermutlich voneinander abweichenden Substratkonzentrationen unterschiedlich stimuliert worden sein. Ähnliche Vermutungen äußerten auch

WIEGHART et al (1986). Sie beobachteten eine Erhöhung der Glukoneogenese mit steigender Energieaufnahme der Tiere und führten diese auf eine wahrscheinlich erhöhte Menge an Ausgangssubstraten der Glukoneogenese bei einer gesteigerten Energieaufnahme zurück.

5.6 Mögliche Bedeutung der Befunde für die Fütterung von