Durchführung der Untersuchungen

3.6.4.1 Eichung

Vor dem Einspannen der Gewebe wurden die Ussingkammern bereits einmal in die Apparatur eingebaut und mit dem später verwendeten Puffer befüllt, um das

Eigenpotential der Elektroden und den Lösungswiderstand zu messen. Hierbei wurde bei beiden Versuchsansätzen der Puffer verwendet, der im eigentlichen Versuch für das serosale Kompartiment eingesetzt wurde. Die später erhobenen Messwerte wurden von den Datenerfassungsprogrammen um die zuvor ermittelten Eigen-potenzial- bzw. Lösungswiderstandswerte korrigiert.

3.6.4.2 Präparation und Einspannen der Mukosa in die Ussingkammern

Zur Präparation der Mukosa wurden von dem jeweils entnommenen Darmabschnitt vom proximalen Ende ausgehend kurze Stücke abgeteilt und am Ansatz des Mesenteriums entlang aufgeschnitten. Anschließend wurde die Mukosa dieser Darmstücke eingeritzt und von der Submukosa abgeschoben. Nach einer Sichtkontrolle auf beschädigte oder veränderte Bereiche wurde ein augenscheinlich einwandfreier Bereich der Mukosa von etwa 2 x 2 cm abgetrennt, mit der mukosalen Seite nach oben über die Präpariernadeln, die auf einer Kammerhälfte kreisförmig um die Öffnung angebracht waren, gebreitet und unter leichter Spannung fixiert. Die beiden Kammerhälften wurden zusammengesetzt, umgehend in das Haltegestell eingebaut, mit den puffergefüllten Gasliften verbunden und die Elektroden angeschlossen.

Alle Mukosastücke wurden mindestens 10 min im Open-Circuit-Verfahren an die Versuchsbedingungen adaptiert. Während dieser Phase wurden die Messwerte für die Gewebeleitfähigkeit auf ihre Plausibilität geprüft. Mukosastücke, die mit ungewöhnlich hohen Werten auffielen, wurden als mutmaßlich beschädigt eingestuft und durch frisch präparierte ersetzt. Zeigten die Gewebestücke eine stabile Poten-zialdifferenz und eine akzeptable Leitfähigkeit, so wurde die Kammer in den Short-Circuit-Modus umgeschaltet und erneut für mindestens 10 min äquilibriert, bevor mit den Zugaben entsprechend den Versuchsprotokollen 1 und 2 begonnen wurde.

3.6.4.3 Versuchsprotokoll 1

Bei diesem Versuchsprotokoll wurden sowohl die serosale als auch die mukosale Seite von vier Ussingkammern pro Versuchstier mit 10 ml der in Kapitel 3.6.3 beschriebenen Pufferlösung 1 gefüllt.

Nachdem sich die Kurzschluss-ströme im Short-Circuit-Modus stabilisiert hatten, wurden bei zwei Kammern 20 µl ³H-Glu-kose (173,9 kBq bzw. 4,7 µCi) in die Pufferlösung der muko-salen Seite gegeben. Bei den anderen beiden Kammern erfolgte die Aktivitätszugabe von 20 µl ³H-Glukose in die Pufferlösung der serosalen Seite (Abbildung 3.6). Darüber hinaus wurden den Puffer-lösungen der serosalen und mukosalen Seite jeweils 5 mmol · l^-1 Glukose hinzugefügt.

Nach 20 min wurde eine Probe von 50 µl („heiße“ Probe 1) aus der Pufferlösung, der die Aktivität zugesetzt worden war, entnommen. Aus der anderen Pufferlösung wurden im Abstand von jeweils 10 min fünf Proben à 500 µl („kalte“ Proben 1 - 5) entnommen. Um einer Volumenabnahme dieser Pufferlösung infolge der Probenentnahmen entgegenzuwirken, wurden nach jeder „kalten“ Probenentnahme 500 µl einer Austauschlösung, die in ihrer Zusammensetzung der Pufferlösung inklusive der bis dahin erfolgten Zugaben entsprach, in die Pufferlösung pipettiert.

Unmittelbar im Anschluss an die Entnahme der fünften „kalten“ Probe wurden der serosalen Pufferlösung 25 mmol · l^-1 Mannit zugefügt und der mukosalen Pufferlösung 25 mmol · l^-1 Glukose. 20 min nach der Entnahme der fünften „kalten“

Probe wurden erneut fünf „kalte“ Proben („kalte“ Proben 6 - 10) im Abstand von 10 min à 500 µl entnommen und durch jeweils 500 µl einer der Zusammensetzung der Pufferlösung entsprechenden Austauschlösung ersetzt. Im Anschluss an die Entnahme der zehnten „kalten“ Probe wurden 0,5 mmol · l^-1 Phlorizin in die Pufferlösung der mukosalen Seite gegeben. 30 min nach dieser Entnahme wurden

Abbildung 3.6: Zeitliche Abfolge der Zugaben (links) und Probeentnahmen (rechts); * verwendete Abkürzungen: ser = serosal, muk = mukosal.

„kalte“ Proben 1-5 „heiße“ Probe 1

„kalte“ Proben 11-16 „heiße“ Probe 2 ser/muk*: 4,7 µCi ³H-Glukose

Short-Circuit-Modus

ser: 10^-5 mmol · l^-1 Forskolin

sechs weitere „kalte“ Proben („kalte“ Proben 11 - 16) im Abstand von 10 min à 500 µl genommen und die Volumenminderung der Pufferlösung wieder durch die Zugabe entsprechender Austauschlösungen ausgeglichen. Nach der Entnahme der 16.

„kalten“ Probe wurde eine Probe von 50 µl („heiße“ Probe 2) von der Pufferlösung, zu der die Aktivität gegeben worden war, genommen. Das Versuchsprotokoll endete mit einer Vitalitätskontrolle des Gewebes. Hierzu wurden 10^-5 mmol · l^-1 Forskolin in die Pufferlösung der serosalen Seite gegeben. Forskolin stimuliert als Aktivator der

Adenylatzyklase (SEAMON u. DALY 1981; SEAMON et al. 1981) die cAMP-vermittelte Chloridsekretion, wodurch es bei einem vitalem Gewebe zu einem

Anstieg des Kurzschlussstroms kommt (BROWN et al. 1990; HEMPE 2007).

Die „heißen“ und „kalten“ Proben wurden jeweils in ein Minivial (Polyethylen Vial, 6 ml; PerkinElmer Life Sciences, Dreieich) pipettiert und mit 4,3 ml Szintillations-cocktail (Lumasafe^TM Plus; Luma * LSC B.V. der Fa. PerkinElmer Life Sciences,

Dreieich) versetzt. Die Messung der Radioaktivität erfolgte in einem Flüssigkeits-szintillationsmessgerät (Tri-Carb 2500 TR Liquid Scintillation Analyzer; Canberra-Packard GmbH, Dreieich). Die Zähldauer betrug 10 min pro Probe, der statistische Zählfehler lag bei 2 bis 3%.

3.6.4.4 Versuchsprotokoll 2 Beim Versuchsprotokoll 2 wur-de die serosale Seite von vier Ussingkammern mit 10 ml Pufferlösung 2 (Kapitel 3.6.3) und die mukosale Seite mit 10 ml Pufferlösung 3 (Kapitel 3.6.3) gefüllt.

Nachdem sich die Kurzschluss-ströme im Short-Circuit-Modus stabilisiert hatten, erfolgte die Zugabe von 20 µl ³H-Glukose

mit einer Aktivität von 173,9 kBq bzw. 4,7 µCi in die Pufferlösung der serosalen oder

„heiße“ Probe 2 ser/muk*: 4,7 µCi ³H-Glukose

Short-Circuit-Modus

Abbildung 3.7: Zeitliche Abfolge der Zugaben (links) und Probeentnahmen (rechts) * verwendete Abkürzungen: ser = serosal, muk = mukosal

der mukosalen Seite der Ussingkammern (Abbildung 3.7). 20 min später wurde, wie in Kapitel 3.6.4.3 beschrieben, die erste „heiße“ („heiße“ Probe 1) und sechs „kalte“

Proben („kalte“ Proben 1 -6) im Abstand von 10 min entnommen und einer Volumen-minderung der Pufferlösung durch die Zugabe von jeweils 500 µl Austauschlösung entgegengewirkt. Im Anschluss an die Entnahme der sechsten „kalten“ Probe wurden 1,0 mmol · l^-1 Phloretin in die mukosale Pufferlösung pipettiert. 30 min nach der Probeentnahme wurden erneut acht „kalte“ Proben („kalte“ Proben 7 - 14) gemäß Kapitel 3.6.4.3 im Abstand von 10 min genommen und einer Volumenminderung der Pufferlösung durch die Zugabe von jeweils 500 µl Austauschlösung entgegen-gewirkt. Danach erfolgten die Entnahme der zweiten „heißen“ Probe („heiße“

Probe 2) und die Vitalitätsüberprüfung des Gewebes, die ebenfalls gemäß Kapitel 3.6.4.3 ausgeführt wurden.

Zur Messung der Radioaktivität der „heißen“ und „kalten“ Proben wurden diese, wie in Kapitel 3.6.4.3 beschrieben, jeweils in ein Minivial pipettiert, mit Szintillations-flüssigkeit versetzt und 10 min im Flüssigkeitsszintillationsmessgerät gezählt.