Thermische Entfaltung des stabilisierten disulfidverbrückten G3P*

Die hohe Stabilität der N1-Domäne in 3SS-G3P* mit den 14 second-site-Mutationen wurde außerdem durch thermische Denaturierung analysiert. Dazu wurde das N1N2-Fragment in 6 M GdmCl aufgenommen und dann erhitzt. Unter diesen Bedingungen liegt die N2-Domäne bereits entfaltet vor. N1 sollte gemäß den Ergebnissen der GdmCl-induzierten Entfaltung (3.3.1) in 6 M GdmCl bei 35 °C noch gefaltet vorliegen, was durch Fern-UV-CD-Spektren in Gegenwart von 6 M GdmCl bestätigt werden konnte. Die thermische Entfaltung in 6 M GdmCl, gemessen anhand der Änderung des CD-Signals bei 230 nm, ist in Abbildung 3.35 a dargestellt.

Der Schmelzpunkt der N1-Domäne in 6 M GdmCl beträgt 68,7 °C. Hier wird nochmals die extreme Stabilisierung des Proteins durch die 14 second-site-Mutationen deutlich. Im Vergleich zum disulfidverbrückten Referenzprotein G3P* (G3P mit vier stabilisierenden Mutationen) aus der Zufallsmutagenese des Wildtyp-Proteins, welches den Ausgangspunkt für die Substitution der Disulfidbrücken darstellte (Martin und Schmid, 2003b), liegt in diesem Protein durch die 10 zusätzlichen Mutationen eine Stabilisierung um 6 M GdmCl vor.

Die N1-Domäne des G3P* besitzt einen Tm von 68,6 °C in Abwesenheit von Denaturierungsmittel. Die niedrige Kooperativität des Entfaltungsübergangs von 3SS-G3P*

mit allen stabilisierenden Mutationen ist durch die hohe Konzentration an GdmCl zu erklären.

Die Bindung von GdmCl ans Protein ist ein exothermer Vorgang, welcher dem endothermen Vorgang der Entfaltung entgegenwirkt. Die apparente Enthalpie ∆HD ist also durch den Effekt des GdmCl verringert.

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Abbildung 3.35: Thermische Entfaltung von 3SS-G3P* mit allen 14 stabilisierenden Mutationen. (a) Entfaltung des N1N2-Fragments in Gegenwart von 6 M GdmCl. (b) Entfaltung von G3P-Wildtyp (─), 0SS-G3P* mit allen stabilisierenden Mutationen (─) und 3SS-G3P* mit allen stabilisierenden Mutationen (─) in Gegenwart von 1,5 M GdmCl. (c) Entfaltung des N1N2-Fragments in Gegenwart von 3 M GdmCl. (d) Entfaltung der isolierten N1-Domäne in Gegenwart von 3 M GdmCl. Die Übergänge wurden mit 4 µM (bzw. 1 µM in c und d) Protein in 100 mM Kalium-Phosphat, pH 7,0 bei einer Schichtdicke von 10 mm und einer Heizrate von 60 K/h gemessen.

Angegeben ist die Änderung des CD-Signals bei 230 nm.

Abbildung 3.35 b vergleicht die thermischen Entfaltungsübergänge von G3P-Wildtyp, 0SS-G3P* mit allen stabilisierenden Mutationen und 3SS-0SS-G3P* mit allen stabilisierenden Mutationen in Gegenwart von 1,5 M GdmCl. Für alle Übergänge ist eine zweiphasige Entfaltung erkennbar, wobei die beiden Übergänge für 3SS-G3P* mit allen stabilisierenden Mutationen am deutlichsten getrennt sind. Für diese Variante ist in Gegenwart von 1,5 M GdmCl keine vollständige Entfaltung bis 104 °C möglich. Der Vergleich der Varianten zeigt trotzdem deutlich die starke Stabilisierung durch die second-site-Mutationen. Die Stabilität von N1 im N1N2-Fragment und der isolierten N1-Domäne in Gegenwart von 3 M GdmCl (Abbildung 3.35 c/d) liegt bei 86 °C bzw. 88 °C. Der zweite Übergang ist eindeutig der N1-Domäne zuzuordnen. Die Analyse der Stabilität der N1-N1-Domäne ist dabei fehlerbehaftet, da die Basislinie des denaturierten Proteins nicht mehr erreicht wird.

Die thermische Entfaltung der stabilisierten Variante in Gegenwart und Abwesenheit der Disulfidbrücken wurde außerdem mittels Absorption untersucht (Abbildung 3.36).

100 80

60 40

20 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

T (°C) rel. Änderung der Absorption bei 296 nm

(a)

100 90 80 70 60 50 40 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

T (°C) rel. Änderung der Absorption bei 286 nm

(b)

Abbildung 3.36: Thermische Entfaltung von 3SS-G3P* mit allen stabilisierenden Mutationen. (a) Thermische Entfaltung der isolierten 2SS-G3P* N1-Domäne mit allen stabilisierenden Mutationen in Gegenwart von 6 M GdmCl verfolgt mittels Absorption bei 296 nm (●) im Vergleich zur thermischen Entfaltung der N1-Domäne des Referenzproteins 3SS-G3P* in Abwesenheit von GdmCl (●). (b) Thermische Entfaltung des N1N2-Fragments beobachtet mittels Absorption bei 286 nm. Die Übergänge wurden mit 10 µM Protein in 100 mM Kalium-Phosphat, pH 7,0 und einer Schichtdicke von 1 cm gemessen. Die durchgezogenen Linien zeigen Angleiche an die Daten gemäß einem Zweizustandsmodell. Die zugehörigen Stabilitätsdaten sind in Tabelle 3.14 aufgeführt.

Die Änderung der Absorption bei 296 nm bei der thermischen Entfaltung der isolierten N1-Domäne in 6 M GdmCl (Abbildung 3.36 a) zeigt den gleichen Verlauf wie die Änderung des CD bei 230 nm bei der thermischen Entfaltung des N1N2-Fragments (Abbildung 3.35 a).

Dies bestätigt die extrem hohe Stabilität dieser N1-Domäne. Im Vergleich zur N1-Domäne des Ausgangsproteins 3SS-G3P* ist die N1-Domäne mit den stabilisierenden Mutationen aus der Selektion um 6 M GdmCl stabilisiert, denn der Schmelzpunkt der N1-Domäne von 3SS-G3P* (Tm = 64,8 °C) in Abwesenheit von GdmCl ist niedriger als der Schmelzpunkt der N1-Domäne des stabilisierten 3SS-G3P* (Tm = 69,4 °C). Um den Übergang der N2-Domäne zu validieren, wurden DSC-Messungen durchgeführt. Die thermischen Entfaltungen bei 0 M und 3 M GdmCl wurde mittels DSC gemessen und sind in Abbildung 3.37 dargestellt.

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Abbildung 3.37: DSC von 3SS-G3P* mit allen stabilisierenden Mutationen. (a) Änderung der Wärmekapazität bei thermischer Entfaltung in Abwesenheit von GdmCl. (b) Enthalpieänderung bei thermischer Entfaltung in Abwesenheit von GdmCl. (c) Thermische Entfaltung in Gegenwart von 3M GdmCl. (d) Enthalpieänderung bei thermischer Entfaltung in Gegenwart von 3 M GdmCl. Die Messung wurde mit 25 µM (in Abwesenheit von GdmCl) bzw. 65 µM (in Gegenwart von 3 M GdmCl) des Proteins in 100 mM Kalium-Phosphat, pH 7,0 bei einer Heizrate von 90 K/h durchgeführt. In (a) und (c) gibt die durchgezogene Linie das Ergebnis der Levenberg-Marquardt-Analyse nach dem Nicht-Zweizustandsmodell wieder, und die rote und blaue Linie repräsentieren die Dekonvolution in zwei unabhängige Entfaltungsübergänge für die Domänen N1 und N2. Die durchgezogene Linie zeigt in (b) den Angleich an die Daten gemäß einem Dreizustandsmodell bzw. in (d) gemäß einem Zweizustandsmodell. Die zugehörigen thermodynamischen Parameter sind in Tabelle 3.14 zusammengefaßt.

DSC ist vor allem für die Entfaltung der N2-Domäne eine sensitive Sonde, da die Enthalpieänderung bei Entfaltung aufgrund der Domänengröße (131 Aminosäuren) groß ist.

Die Übergangsmittelpunkte für die beiden Domänen bei Entfaltung in 0 M GdmCl und in 3 M GdmCl entsprechen den Ergebnissen aus der thermischen Entfaltung beobachtet mittels Absorption und CD (Tabelle 3.14). In Gegenwart von 3 M GdmCl ist die Kooperativität des N1-Übergangs sehr niedrig, und die Übergänge der beiden Domänen sind nicht deutlich getrennt. N1 kann deshalb in Abbildung 3.37 c/d nicht analysiert werden. Im Rahmen der Genauigkeit der Auswertung stimmen auch die Enthalpien für N1 und N2 bei den verschiedenen Meßmethoden gut überein. Die Stabilitätsdaten für die thermische Entfaltung mittels Absorption, CD und DSC sind in Tabelle 3.14 aufgeführt. Sowohl die Tm-Werte als auch die Enthalpien stimmen für die verschiedenen Sonden gut überein.

Tabelle 3.14: Stabilitätsdaten der thermischen Entfaltung mittels CD, Absorption und DSC von 3SS-G3P* mit allen stabilsierenden Mutationen.

3SS-G3P* mit allen

Für die verschiedenen Varianten sind Übergangsmittelpunkt (Tm in °C) und die Enthalpie der Entfaltung am Übergangsmittelpunkt ∆HD in kJ/mol angegeben. Für die Daten aus den CD-Messungen ist für die N2-Domäne die freie Enthalpie der Entfaltung ∆GD55°C bei 55 °C und für die N1-Domäne ∆GD65°C bei 65 °C in kJ/mol angegeben.

3.3.4 Fazit aus der Stabilitätsanalyse von 3SS-G3P* mit allen stabilisierenden