2.11.1 Test auf Überexpression eines Proteins
Um die Überexpression der verschiedenen G3P- bzw. β-Lactamase-Varianten zu überprüfen, wurde eine mit den zu testenden E. coli BL21 (DE3)-Zellen (G3P-Varianten) bzw. E. coli RB791-Zellen (β -Lactamase-Varianten) angeimpfte 5 ml-Kultur (dYT + 300 µg/ml Amp + 25 µg/ml Cm) bis zu einer OD600 von 0,7 bei 37 °C inkubiert. 1 ml der Kultur mit OD600 = 1 wurde abzentrifugiert, der Rest der Kultur mit 1 mM IPTG zur Induktion der Überexpression versetzt. Nach 4 h Inkubation bei 37 °C wurde erneut die OD600 bestimmt und 1 ml der Kultur mit OD600 = 1 abzentrifugiert. Die Zellpellets wurden in 30 µl 1x-Auftragspuffer resuspendiert und wie unter 2.2.2 beschrieben einer SDS-PAGE unterzogen. Die Überexpression konnte durch Vergleich der Intensität der Bande mit entsprechendem Molekulargewicht vor und nach Induktion festgestellt werden.
Für einen Test auf Überexpression der G3P-Konstrukte mit C-terminaler Domäne wurden verschiedene Medien getestet.
LB: 5 g/l NaCl, 10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton (+/- 4 g/l Glucose)
SOB: 5 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 2,4 g/l MgSO4, 0,186 g/l KCl
SOC: 5 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 2,4 g/l MgSO4, 0,186 g/l KCl, 4 g/l Glucose TB: 24 g/l Hefeextrakt, 12 g/l Pepton, 9,4 g/l K2HPO4, 2,2 g/l KH2PO4 (+/- 4 g/l Glucose) dYT: 5 g/l NaCl, 10 g/l Hefeextrakt, 16 g/l Pepton (+/- 4 g/l Glucose)
2.11.2 Expression und Reinigung der G3P-Varianten
2.11.2.1 Zellanzucht, Zellaufschluß und Waschen der inclusion bodies dYT-Medium: 5 g/l NaCl, 10 g/l Hefeextrakt, 16g/l Pepton
Lysepuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM DTT Waschpuffer: 1 mM EDTA, 1 mg/ml Desoxycholat, 20 mM DTT, pH 8,0
Die G3P-Varianten wurden cytoplasmatisch oder periplasmatisch in E. coli BL21 (DE3) exprimiert.
Die Fermentation der verschiedenen Gen-3-Protein-Varianten erfolgte im 2,5 l- bzw. 1 l-Ansatz dYT-Medium mit 300 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Chloramphenicol. Im Falle der periplasmatischen Expression der Varianten wurde die Fermentation in 5 l dYT-Medium durchgeführt. Die Kultur wurde bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,7 (logarithmische Phase) inkubiert, dann wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG die Überexpression des Gen-3-Proteins induziert. 3 h nach Induktion wurden die Zellen geerntet, bei 7 000 rpm und 4 °C 15 min lang im GS3-Rotor abzentrifugiert und das Zellpellet bei -80 °C eingefroren.
Das Zellpellet wurde in 50 ml Lysepuffer resuspendiert; dann wurden die Zellen mit dem Mikrofluidizer aufgeschlossen und Zelltrümmer und inclusion bodies durch 20 min Zentrifugation im SS34-Rotor bei 11 000 rpm und 4 °C pelletiert. Alternativ wurde der Zellaufschluß durch einen Ultraschallschritt im Desintegrator (2x5 min, Intensität 0,5, Pulsbetrieb) unter Eiskühlung erreicht.
Die disulfidfreien G3P-Varianten lagen im Cytoplasma gelöst vor, bei Expression der Varianten mit Exportsequenz wurde das Protein ins Periplasma sezerniert.
Im Falle der ohne Signalsequenz klonierten disulfidverbrückten Gen-3-Protein-Varianten bildeten diese nach der Synthese Einschlußkörper (inclusion bodies). Das nach dem Zellaufschluß erhaltene Pellet wurde in 20 ml Waschpuffer + 0,2 mg/ml Lysozym resuspendiert und bei 15 000 rpm und 4 °C 10 min lang im SS34-Rotor zentrifugiert. Die inclusion bodies wurden dann noch weitere dreimal mit 15 ml Waschpuffer und anschließend dreimal mit je 15 ml Lysepuffer gewaschen und unter den gleichen Bedingungen abzentrifugiert.
2.11.2.2 Reduktive Entfaltung und oxidative Rückfaltung des G3P
Entfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, 1mM EDTA, 6 M GdmCl, 50 mM GSH Rückfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5 mM GSSG
Die inclusion bodies wurden nach dem Waschen zunächst in 5 ml 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, 50 mM GSH resuspendiert und 10 min lang bei 15 000 rpm und 4 °C im SS34-Rotor abzentrifugiert, um das DTT zu entfernen. Das Pellet wurde dann in 20 ml (bzw. 15 ml) Entfaltungs-puffer resuspendiert, und das Gen-3-Protein 3,5 h unter reduktiven Bedingungen entfaltet.
Die oxidative Rückfaltung des Gen-3-Proteins wurde durch 10faches Verdünnen in Rückfaltungspuffer erreicht, so daß eine Endkonzentration von 0,6 M GdmCl, 5 mM GSH und 0,5 mM GSSG vorlag. Die Rückfaltung wurde über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Das ausgefallene Aggregat wurde bei 18 000 rpm und 4 °C 10 min lang im SS34-Rotor abzentrifugiert.
2.11.2.3 Reinigung des G3P
Ni-NTA-Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,8, 100 mM KCl
Ni-NTA-Puffer B: 50 mM Tris/HCl, pH 7,8, 100 mM KCl, 500 mM Imidazol Gelfiltrationspuffer: 20 mM Kalium-Phosphat, 100 mM KCl, pH 7,0
Die Reinigung der G3P-Varianten erfolgte durch Affinitätschromatographie an einer Ni-NTA-Matrix und anschließende Gelfiltrationschromatographie.
Dazu wurde die Proteinlösung zur Komplexierung des im Puffer enthaltenen EDTA mit Mg2+ versetzt und in 10 mM Imidazol auf eine mit Ni-NTA-Puffer A äquilibrierte Säule mittels einer P1-Pumpe mit einer Flußrate von 3 ml/min aufgetragen. Nichtbindende Proteine wurden durch Waschen mit 20 mM Imidazol bei einer Flußrate von 2,5 ml/min eluiert. Das G3P wurde durch Erhöhung der Imidazol-Konzentration auf 250 mM bei einer Flußrate von 2,5 ml/min eluiert. Eventuell noch gebundene Proteine wurden durch Erhöhen der Imidazol-Konzentration auf 500 mM von der Säule gewaschen.
Die G3P-haltigen Fraktionen aus der Ni-NTA-Affinitätschromatographie wurden in 5 ml-Aliquots auf eine mit Gelfiltrationspuffer äquilibrierte HiLoad Superdex 75 prep grade-Säule aufgetragen (Flußrate 1,7 ml/min). Nach 25,5 ml Elutionsvolumen (15 min nach dem Auftragen des Proteins) wurde mit dem Sammeln von 1,7 ml-Fraktionen begonnen.
Die vereinigten Fraktionen aus der Gelfiltration wurden gegen 5l 15 mM und anschließend gegen 5 l 5 mM Ammoniumhydrogencarbonat dialysiert und lyophilisiert. Das getrocknete Protein wurde bei -20 °C gelagert.
2.11.3 Expression und Reinigung der G3P-Konstrukte mit C-terminaler Domäne 2.11.3.1 G3P N1N2CT
Für die Expression des G3P mit C-terminaler Domäne (G3P* N1N2CT) wurde das Genfragment, das die Reste 1-407 codiert, in einer Standard-PCR (2.4.1) aus der doppelsträngigen Phagen-DNA amplifiziert. Es handelte sich um die bereits stabilisierte Variante des G3P mit vier stabilisierenden Mutationen in den beiden N-terminalen Domänen (Martin und Schmid, 2003b) und einem verkürzten Linker zwischen N2- und CT-Domäne (zusätzliche HindIII-Schnittstelle und Deletion der Reste V231-G256). Das Fragment wurde über die Restriktionsenzyme NheI und BamHI in den Expressionsvektor pET 11a kloniert (gemäß 2.10). Das G3P wurde in E. coli BL21 (DE3) gemäß 2.11.2.1 überexprimiert (Medium: dYT + 4 g/l Glucose) und die Zellen aufgeschlossen. Das Protein lag in Form von inclusion bodies vor. Diese wurden wie für das N1N2-Fragment beschrieben (2.11.2) gewaschen entfaltet, rückgefaltet und über Ni-NTA-Affinitätschromatographie und Gelfiltrationschromatographie gereinigt.
2.11.3.2 Isolierte C-terminale Domäne des G3P
Das codierende Genfragment für die C-terminale Domäne (Reste 256-407) wurde in einer PCR (2.4.1) aus doppelsträngiger Phagen-DNA amplifiziert und als NheI / BamHI-Fragment in den Expressions-vektor pET11a kloniert. Die CT-Domäne wurde in E. coli BL21 (DE3) gemäß 2.11.2.1 als cytoplasmatisch gelöstes Protein überexprimiert (Medium dYT + 4 g/l Glucose) und wurde wie das N1N2-Fragment über Ni-NTA-Affinitätschromatographie und Gelfiltration gereinigt.
2.11.3.3 G3P N2CT
Rückfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM GSSG, 0,5 M Arginin, pH 10,4
Anionenaustausch-Puffer A: 20 mM Tris/HCl, pH 7,7
Anionenaustausch-Puffer B: 20 mM Tris/HCl, pH 7,7, 1 M NaCl
Gelfiltrationspuffer: 20 mM Kalium-Phosphat, 100 mM KCl, pH 7,0
Für die Expression der N2-Domäne in Kombination mit der CT-Domäne wurde das Genfragment für die Aminosäuren 102-407 aus der doppelsträngigen Phagen-DNA amplifiziert. Die N2-Domäne enthielt drei stabilisierende Mutationen (eine im globulären Teil, zwei in der Gelenk-Subdomäne) (Martin und Schmid, 2003b) und den in 2.11.3.1 erwähnten verkürzten Linker zwischen N2 und CT.
Das Fragment wurde über die Restriktionsenzyme NheI und BamHI in den Expressionsvektor pET11a kloniert und in E. coli BL21 (DE3) in 5 l dYT-Medium mit Glucose (4 g/l) überexprimiert (2.11.2.1).
Das Protein lag im Cytoplasma in Form von inclusion bodies vor. Nach dem Waschen der inclusion bodies wurden diese in 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 6 M GdmCl aufgenommen. Die Rückfaltung wurde durch 1:10-Verdünnung in Rückfaltungspuffer unter Zusatz von 0,5 M Arginin erreicht. Der Rückfaltungsansatz wurde gegen 20 mM Tris/HCl, pH 7,7 dialysiert und mittels P1-Pumpe auf eine mit Puffer A äquilibrierte Fractogel EMD TMAE-650 (M)-Säule bei einer Flußrate von 2 ml/min aufgetragen. Die Elution gebundener Proteine erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 auf 1 M NaCl innerhalb von 90 min. Eventuell noch gebundene Proteine wurden mit 1 M NaCl von der Säule entfernt. Die Fraktionen wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2.2.2) auf die Gegenwart von G3P N2CT untersucht. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und in 5 ml-Aliquots auf einer mit Gelfiltrationspuffer äquilibrierten HiLoad Superdex 75 prep grade-Säule aufgetrennt (Flußrate 1,7 ml/min). Die Fraktionen wurden über SDS-PAGE und Messung von Absorptionsspektren auf das Vorhandensein von G3P N2CT überprüft. G3P N2CT eluiert bei 40-57 ml. Die Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert, schockgefroren und bei -20 °C gelagert.
2.11.4 Expression und Reinigung der β-Lactamase-Varianten 2.11.4.1 Zellanzucht und Periplasmaaufschluß
LB-Medium: 5 g/l NaCl, 10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton
Lysepuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM DTT
Die β-Lactamase-Varianten wurden periplasmatisch in E. coli RB791 exprimiert. Die Fermentation erfolgte in 5 l LB-Medium unter Zusatz von 300 µg/ml Ampicillin. Die Kultur wurde bei 30 °C bis zu einer OD600 von 0,7 inkubiert, dann wurde durch Zugabe von 0,5 mM IPTG die Überexpression der β -Lactamase induziert. Nach Induktion über Nacht bei 25 °C wurden die Zellen geerntet, bei 7000 rpm und 4 °C 15 min lang im GS3-Rotor abzentrifugiert und das Zellpellet bei -80 °C eingefroren. Der Periplasmaaufschluß erfolgte durch Lysozymbehandlung. Dazu wurde das Zellpellet in 50 ml Lysepuffer aufgenommen und mit 0,2 mg/ml Lysozym und unter Zusatz von DNaseI 60 min lang auf Eis gerührt. Nach Zentrifugation bei 15000 rpm und 4 °C für 30 min wurde der Überstand mit 0,4 % Polyethylenimin versetzt und 15 min auf Eis gerührt, um DNA zerstörter Zellen zu präzipitieren. Nach
erneuter 30minütiger Zentrifugation wurde der Überstand über Nacht gegen 20 mM Tris/HCl, pH 7,7 dialysiert (Erniedrigung der physiologischen Salzkonzentration).
2.11.4.2 Reinigung der β-Lactamase-Varianten Anionenaustausch-Puffer A: 20 mM Tris/HCl, pH 7,7
Anionenaustausch-Puffer B: 20 mM Tris/HCl, pH 7,7, 1 M NaCl Anionenaustausch-Puffer C: 20 mM MES, pH 6,0
Anionenaustausch-Puffer D: 20 mM MES, pH 6,0, 1M NaCl Gelfiltrationspuffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7,7
Die Reinigung der β-Lactamase-Varianten erfolgte durch Anionenaustausch-Chromatographie bei verschiedenen pH-Werten und anschließende Gelfiltrationschromatographie.
Das Dialysat (2.11.4.1) wurde mit Anionenaustausch-Puffer A auf das doppelte Volumen verdünnt und mittels P1-Pumpe auf eine mit Puffer A äquilibrierte Fractogel EMD TMAE-650 (M)-Säule bei einer Flußrate von 5 ml/min aufgetragen. Nach 60minütigem Waschen wurden gebundene Proteine durch einen linearen NaCl-Gradienten von 0-0,2 M NaCl in 90 min eluiert (β-Lactamase eluiert bei etwa 100 mM NaCl). Noch gebundene Proteine wurden mit 1 M NaCl von der Säule gewaschen. Die Fraktionen wurden mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2.2.2) und durch Aktivitätstest mit Nitrocefin auf das Vorhandensein von β-Lactamase untersucht. Die β-Lactamase-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und gegen Puffer C dialysiert. Die Proteinlösung wurde dann auf eine in Puffer C äquilibrierte Fractogel EMD TMAE-650 (M)-Säule aufgetragen. Die Elution erfolgte erneut mit einem linearen Gradienten von 0-0,2 M NaCl. Die β-Lactamase wurde anhand von SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und mittels Nitrocefin-Aktivitätstest identifiziert, die Fraktionen wurden vereinigt und in 5 ml-Aliquots auf eine mit Gelfiltrationspuffer äquilibrierte HiLoad Superdex 75 prep grade-Säule aufgetragen (Flußrate 1,7 ml/min). Die β-Lactamase-haltigen Fraktionen (Elutionsvolumen 66 ml) wurden vereinigt, schockgefroren und bei -20 °C gelagert.