4.3 Grundlagen der submitochondrialen Verteilung von Mba1 in der inneren mitochondrialen Membran . 90
4.3.8 Submitochondriale Verteilung von Mba1-Varianten in Abhängigkeit von der Wachstumstemperatur
Es ist vorstellbar, dass es sich bei der mittels Mutagenese entdeckten Aminosäuresequenz im Mba1-C-Terminus um ein Bindungsmotiv handelt, das die Bindung von Mba1 an ein anderes mitochondriales Protein ermöglicht. Diese Interaktion könnte für die Lokalisation und somit die Bestimmung des Funktionsortes von Mba1 in der inneren Membran verantwortlich sein. Die Wachstumstemperatur könnte die Struktur oder Faltung dieses Bindungsmotivs oder sogar die vermutete Interaktion selbst beeinflussen, die zum beobachteten Lokalisationsphänotyp von Mba1 1-273 führt.
Im Rahmen der Analysen bezüglich der mutierten Oxa1-Variante Oxa1-W128F wurde ein temperatur-sensitiver Lokalisationsphänotyp dokumentiert. So führt die Verwendung einer niedrigeren Wachs-tumstemperatur als 30 °C zu einer teilweisen Revertierung des durch Mutagenese induzierten Lokali-sationsphänotyps (Abb. 8.31). Deshalb wurde an dieser Stelle analysiert, wie sich eine niedrigere bzw.
eine höhere Wachstumstemperatur auf die Verteilung einer lokalisationsveränderten Mba1-Variante auswirkt. Für diese Untersuchung wurden der ∆mba1-Stamm (YKODC) sowie der QCR2-mRFP-Stamm (BY4741) mit mba1 1-273-GFP-Plasmid eingesetzt, die nach der Deletion von MDM10 auf Glukose bei 25 °C, 30 °C sowie 37 °C kultiviert wurden.
Die konfokalmikroskopische Analyse zeigt, dass Mba1 1-273-GFP bei 30 °C und 37 °C im Inneren und bei 25 °C eher am Rand der vergrößerten Mitochondrien lokalisiert (Abb. 8.29, A und B). Die Qcr2-mRFP-Anreicherung im Inneren der vergrößerten Mitochondrien legt nahe, dass die untersuchten Zellen bei allen Wachstumstemperaturen eine normale Cristaestruktur aufweisen (Abb. 8.29, B).
Auf Grund dieser Beobachtung wurde als nächstes die Verteilung von Mba1-GFP, Mba1 1-275-GFP, Mba1 1-273-GFP und Mba1-I272A-GFP im ∆mba1-Stamm (BY4741) sowie im QCR2-mRFP-Stamm (BY4741) bei Wachstum mit Glukose bei 25 °C konfokalmikroskopisch analysiert.
Alle Mba1-GFP-Varianten zeigen eine randständige Lokalisation (Abb. 4.26, A und B), während Qcr2-mRFP im Inneren der vergrößerten Mitochondrien angereichert ist (Abb. 4.26, B). Diese Daten deuten an, dass die Senkung der Temperatur sich nicht auf die Verteilung von Mba1 und Mba1 1-275, aber auf die von Mba1 1-273 und Mba1-I272A auswirkt und in diesen Fällen in einer Lokalisations-verschiebung von der Cristaemembran zur inneren Grenzflächenmembran resultiert.
Um diese Annahme zu überprüfen, wurde als nächstes die Verteilung von GFP bzw. Mba1-FLAG sowie die von Mba1 1-273-GFPund Mba1-I272A-GFP im ∆mba1-Stamm (BY4741), der mit Galaktose bei 25 °C kultiviert wurde, elektronenmikroskopisch analysiert. Die Fusionsproteine wurden immunologisch mit Goldpartikeln markiert.
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Abb. 4.26: Konfokalmikroskopische Lokalisationsanalyse verschiedener Mba1-GFP-Varianten in vergrößerten Mitochondrien bei einer Wachstumstemperatur von 25 °C.
∆mba1-Hefen (BY4741) (A) bzw. QCR2-mRFP-Hefen (BY4741) (B), die jeweils eine MBA1-GFP-Variante vom Plasmid exprimierten, wurden auf Glukoseplatten bei 25 °C kultiviert. Die Mba1-GFP-Fusionsproteine lokalisieren am Rand (A, B) und Qcr2-mRFP stets im Inneren der vergrößerten Mitochondrien (B). Von links nach rechts sind das Hellfeldbild (A, B), das Fluoreszenzbild für GFP (A, B) und mRFP (B), eine Überlagerung der Fluoreszenz-signale (B) und ein Intensitätsprofil der FluoreszenzFluoreszenz-signale (A, B) dargestellt. Weißer Kasten: für die Intensitäts-profilerstellung verwendeter Bereich. Größenstandard = 2 µm.
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Abb. 4.27: Elektronenmikroskopische Lokalisationsanalyse von Mba1-GFP, Mba1-FLAG, Mba1 1-273-GFP und Mba1-I272A-GFP in Mitochondrien mit Wildtypmorphologie bei 25 °C.
Der ∆mba1-Stamm (BY4741) mit MBA1-GFP- (A), mit MBA1-FLAG- (B), mit mba1 1-273-GFP- (C, E) bzw. mit mba1-I272A-GFP-Plasmid (D, F) wurde in Galaktosemedium bei 25 °C kultiviert. In Mitochondrien mit Wildtyp-morphologie sind Mba1-GFP (A), Mba1-FLAG (B), Mba1 1-273-GFP (C) und Mba1-I272A-GFP (D) in der IGM angereichert. Es ist eine statistische Auswertung der Verteilung der Fusionsproteine (links in A, B, C, D) sowie eine repräsentative Aufnahme (rechts in A, B, C, D) dargestellt. Zum Nachweis wurden die Fusionsproteine immunologisch mit Goldpartikeln markiert (Pfeile). Außerdem sind Mitochondrien mit Aggregaten abgebildet (gestrichelte Rahmung in E, F) sowie eine statistische Auswertung ihrer Häufigkeit (links in E, F) und eine repräsentative Aufnahme (rechts in E, F). IGM (innere Grenzflächenmembran); CM (Cristaemembran);
IM (Innenmembran) und AM (Außenmembran). Größenstandard = 100 nm.
Bei Wachstum mit Galaktose bei 25 °C sind für Mba1-GFP von 97 ausgewerteten Goldpartikeln 56 % in der inneren Grenzflächenmembran und 44 % in der Cristaemembran zu finden (Abb. 4.27, A). Im Fall von Mba1-FLAG befinden sich von 93 Goldpartikeln 62 % in der inneren Grenzflächenmembran und 38 % in der Cristaemembran (Abb. 4.27, B). Sowohl für Mba1-GFP als auch für Mba1-FLAG
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kann bei Wachstum mit Galaktose bei 30 °C (Abb. 8.30 und Abb. 4.12) sowie bei 25 °C (Abb. 4.27, A und B) eine präferentielle Lokalisation in der inneren Grenzflächenmembran beobachtet werden.
Demnach ist die Verteilung von Mba1 unabhängig von der Temperatur.
Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen zur Analyse der Verteilung von Mba1 1-273-GFP und Mba1-I272A-GFP bei Wachstum mit Galaktose bei 25 °C zeigen Mitochondrien mit Wildtypmorpho-logie (Abb. 4.27, C und D) sowie Mitochondrien mit Proteinaggregationsstrukturen (Abb. 4.27, E und F), wie es für das Wachstum mit Galaktose bei 30 °C dokumentiert wurde (siehe Kapitel 4.3.4.1 und 4.3.4.3). Auch für diese statistischen Auswertungen der Proteinverteilungen wurden nur elektronen-mikroskopische Aufnahmen mit Mitochondrien mit Wildtypmorphologie herangezogen.
Für Mba1 1-273-GFP wurden 100 Goldpartikel ausgewertet, von denen sich 63 % in der inneren Grenz-flächenmembran und 37 % in der Cristaemembran befinden (Abb. 4.27, C). Nach der Analyse von 133 Goldpartikeln ergibt sich für Mba1-I272A-GFP eine Verteilung von 57 % in der inneren Grenz-flächenmembran gegenüber 43 % in der Cristaemembran (Abb. 4.27, D). Beide Mba1-Mutanten sind bei Wachstum mit Galaktose bei 25 °C in der inneren Grenzflächenmembran angereichert, was im Gegensatz zur Verteilung bei Wachstum mit Galaktose bei 30 °C steht (Abb. 4.15, A und Abb. 4.20, A). Demzufolge findet bei Senkung der Temperatur eine deutliche Lokalisations-veränderung statt, die der von Mba1 entspricht (siehe Kapitel 4.2.2 und 4.3.3.4).
Bei der Beurteilung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen, auf denen Mitochondrien mit Proteinaggregationsstrukturen abgebildet sind, ist zu erkennen, dass bei Wachstum mit Galaktose bei 25 °C deutlich weniger Mitochondrien Aggregate aufweisen. Im Fall von Mba1 1-273-GFP bei 30 °C ergibt die statistische Auswertung, dass 32 % der Mitochondrien Aggregate enthalten (Abb. 4.15, C), während es bei 25 °C nur noch 8 % sind (Abb. 4.27, E). Für Mba1-I272A-GFP wurde bei 30 °C beobachtet, dass der Anteil 12 % beträgt (Abb. 4.20, C), der bei 25 °C auf 4 % sinkt (Abb. 4.27, F).
Bei der elektronenmikroskopischen Lokalisationsanalyse von Mba1 1-273-FLAG, bei der sich nach Auswertung von 89 Goldpartikeln eine Verteilung von 66 % in der inneren Grenzflächenmembran gegenüber 34 % in der Cristaemembran ergibt, sind sogar ausschließlich Mitochondrien mit Wildtyp-morphologie zu verzeichnen (Abb. 8.32).
Insgesamt lässt sich aus diesen Daten schließen, dass die Mutationen mba1 1-273 und mba1-I272A zu einem temperatursensitiven Phänotyp führen. Mba1 lokalisiert unabhängig von der Temperatur präferentiell in der inneren Grenzflächenmembran, während für die mutierten Varianten Mba1 1-273 und Mba1-I272A bei einer niedrigeren Temperatur eine deutliche Verschiebung der bevorzugten Lokalisation von der Cristaemembran zur inneren Grenzflächenmembran stattfindet. Zusammen mit der Beobachtung, dass die Expression von mba1 1-273 und mba1-I272A deutlich weniger bzw. gar keine Proteinaggregationen mehr verursacht, führen die Daten zu der Annahme, dass eine niedrige Wachs-tumstemperatur sich dahingehend auf die Struktur oder die Bindungseigenschaften von Mba1 1-273 und Mba1-I272A auswirkt, dass es zu einer Abmilderung der Folgen der Mutationen kommt.
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Zusammenfassend ist festzuhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass, neben Oxa1, die ebenfalls in die Proteininsertion involvierte Komponente Mba1 eine heterogene Verteilung mit einer Anreicherung in der inneren Grenzflächenmembran aufweist. Die Lokalisation von Mba1 in der Innenmembran erwies sich von der verwendeten Kohlenstoffquelle unabhängig, während die Deletion von nur fünf Aminosäuren (mba1 1-273) bzw. die Substitution einer einzelnen Aminosäure (mba1-I272A) im C-Terminus von Mba1 zu einer drastischen Lokalisationsverschiebung führte. Es zeigte sich, dass die Mutation mba1 1-273 zu einer verminderten Respirationskompetenz der Zellen führt und die Assemblierung von KomplexIII-Dimeren und von KomplexIV-Dimeren zu einem Superkomplex der oxidativen Phosphorylierung beeinträchtigt ist. Des Weiteren wurde belegt, dass die mutierten Varianten Mba1 1-273 und Mba1-I272A einen temperatursensitiven Lokalisations-phänotyp aufweisen.
Anhand der in dieser Arbeit erhaltenen Daten lässt sich zwar nicht endgültig erklären, was genau mit den mutierten Mba1-Proteinen passiert, aber sie weisen darauf hin, dass es infolge der Mutagenese des Mba1-C-Terminus zu einer Störung einer Interaktion von Mba1 mit einem bisher nicht eindeutig identifizierten Interaktionspartner kommen könnte. Solch eine Interaktion könnte die spezifische Lokalisation von Mba1 und somit auch die Stelle in der inneren mitochondrialen Membran bestimmen, an welcher Mba1 seine Funktion ausübt.
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