Stabilität, mitochondriale Lokalisation, Orientierung und Membranständigkeit der

Im Anschluss an die Lokalisationsanalysen wurde mit Hilfe proteinbiochemischer Kontrollen über-prüft, ob die Fusionsproteine von Mba1 ^1-275 und Mba1 ^1-273 strukturell intakt sind und ob sie korrekt in der inneren Mitochondrienmembran inseriert und lokalisiert sind. Hierfür wurden Mitochondrien aus

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in Galaktosemedium bei 30 °C gewachsenen ∆mba1-Stämmen (BY4741) isoliert, die entweder das mba1 ^1-275-FLAG-Plasmid oder das mba1 ^1-273-FLAG-Plasmid enthielten.

Für die Überprüfung der Stabilität von Mba1 ^1-275-FLAG sowie Mba1 ^1-273-FLAG wurden mitochon-driale Lysate mit Hilfe der Western-Analyse untersucht. Unter Verwendung des FLAG-Antikörpers sowie des Mba1-Antikörpers konnte sowohl Mba1 ^1-275-FLAG als auch Mba1 ^1-273-FLAG bei einem erwarteten Molekulargewicht von ungefähr 28,5 kDa (Tab. 8.3) nachgewiesen werden (Abb. 4.16).

Die Deletionsvarianten Mba1 ^1-275-FLAG und Mba1 ^1-273-FLAG sind stabil, da sie im Vergleich zu Mba1-FLAG keinen signifikanten Abbau aufweisen.

Diese Beobachtung wurde ebenfalls für Mba1 ^1-275-GFP und Mba1 ^1-273-GFP gemacht, deren Fusions-gene im ∆mba1-Stamm (BY4741) unter der Kontrolle des nativen MBA1-Promotors vom Plasmid exprimiert wurden. Die Proteinsignale sind wie erwartet bei einem Molekulargewicht von ungefähr 54 kDa (Tab. 8.2) sichtbar (Abb. 8.19).

Als Kontrolle für die gleichmäßige Beladung der SDS-Polyacrylamidgele wurden die Membranen mit Kontrollantikörpern gegen Tim50, Tom20 und Cyc1 behandelt, die bei den erwarteten Molekular-gewichten (Tab. 8.4) detektiert werden können (Abb. 4.16 und Abb. 8.19).

Abb. 4.16: Expression und Stabilität von Mba1 ^1-275-FLAG und Mba1 ^1-273-FLAG.

Der Wildtyp BY4741 WT mit Vektor2 und die ∆mba1-Stämme (BY4741) mit MBA1-FLAG-, mba1 ^1-275-FLAG- bzw. mba1 ^1-273 -FLAG-Plasmid wurden in Galaktosemedium bei 30 °C kul-tiviert. Die Lysate isolierter Mitochondrien wurden mittels Western-Analyse untersucht. Die Membran wurde erst mit FLAG-Antikörper dekoriert und danach mit Antikörpern gegen die Proteine Mba1, Tim50, Tom20 und Cyc1.

Als nächstes wurde die mitochondriale Lokalisation und Orientierung von Mba1 ^1-275-FLAG und Mba1 ^1-273-FLAG mittels Subfraktionierung untersucht und ihre Membranständigkeit mit Hilfe von Natriumcarbonat-Konzentrationsreihen analysiert. Zu diesem Zweck wurden die isolierten Mito-chondrien den Schilderungen aus den Kapiteln 4.3.3.2 und 4.3.3.3 entsprechend behandelt und die erhaltenen Proteinproben unter Anwendung einer Western-Analyse untersucht.

Mba1 ^1-275-FLAG und Mba1 ^1-273-FLAG wurden bei einem Molekulargewicht von ca. 28,5 kDa detektiert, wofür zunächst der FLAG-Antikörper und für einen zusätzlichen Nachweis der Mba1-Antikörper eingesetzt wurde (Abb. 4.17).

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Abb. 4.17: Mitochondriale Lokalisation, Orientierung und Membranständigkeit von Mba1 ^1-275-FLAG und Mba1 ^1-273-FLAG.

Die isolierten Mitochondrien aus den ∆mba1-Stämmen (BY4741) mit mba1 ^1-275-FLAG- (A, B) bzw. mba1 ^1-273 -FLAG-Plasmid (C, D), die in Galaktosemedium bei 30 °C kultiviert wurden, wurden einer Subfraktionierung (A, C) bzw. einer Natriumcarbonat-Konzentrationsreihe (B, D) unterzogen. (A, C) Für die Analyse der mitochondrialen Lokalisation und Orientierung der Mba1-FLAG-Varianten wurden die Membranen erst mit FLAG-Antikörper dekoriert und danach mit Antikörpern gegen die Proteine Mba1, Atp1, Cyc1 und Tom20. (B, D) Für die Analyse der Membranständigkeit der Mba1-FLAG-Varianten wurden die Membranen zunächst mit FLAG-Antikörper und danach mit Antikörpern gegen die Kontrollproteine Mba1, Tim50, Mrpl4, Mrpl32 und Cyc1 behandelt.

Die Subfraktionierungen zeigen, dass auch Mba1 ^1-275-FLAG (Abb. 4.17, A) und Mba1 ^1-273-FLAG (Abb. 4.17, B), genau wie Mba1-FLAG (Abb. 4.9), in der inneren Membran auf der der Matrix zugewandten Seite lokalisieren, da sie in Fraktionen 2 und 4 vor dem Abbau durch Proteinase K geschützt sind (Spuren 2 und 4). Die Signale der Kontrollproteine Atp1, Cyc1 und Tom20, die mit

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Hilfe des entsprechenden Antikörpers markiert wurden, sind in den erwarteten Fraktionen auf der dem jeweiligen Zielprotein entsprechenden Höhe zu verzeichnen (Abb. 4.17, A und B).

Die Natriumcarbonat-Extraktionen zeigen, dass für Mba1 ^1-275-FLAG (Abb. 4.17, C) und Mba1 ^1-273 -FLAG (Abb. 4.17, D) bei 30 mM Na2CO3 eine leichte Herauslösung aus der Mitochondrienmembran stattfindet, die mit zunehmender Na2CO3-Konzentration ansteigt. Bei 100 mM Na2CO3 ist der Anteil an löslichem Mba1 ^1-273-FLAG ungefähr doppelt so hoch wie der von Mba1 ^1-275-FLAG. Die Behand-lung mit Kontrollantikörpern gegen Tim50, Mrpl4, Mrpl32 und Cyc1, die bei den erwarteten Mole-kulargewichten nachweisbar sind, legt nahe, dass die experimentellen Bedingungen beider Analysen vergleichbar waren (Abb. 4.18, C und D). Im Vergleich zu den in Kapitel 4.3.3.3 charakterisierten Membranständigkeiten fällt auf, dass Wildtyp-Mba1 (Abb. 4.10, A), Mba1-FLAG (Abb. 4.10, B) und Mba1 ^1-275-FLAG (Abb. 4.17, C) ein ähnliches Verhalten zeigen. Im Gegensatz dazu weist Mba1 ^1-273 -FLAG (Abb. 4.17, D) eine leicht reduzierte Assoziation an die innere Membran auf. Da jedoch bei 100 mM Na2CO3 auch mehr als 50 % der Mba1 ^1-273-FLAG-Fusionsproteine in der Sedimentfraktion nachgewiesen werden können, ist anzunehmen, dass die Membranständigkeit von Mba1 ^1-273-FLAG in S. cerevisiae in vivo nicht beeinträchtigt ist.

Aus diesen Daten lässt sich schließen, dass die Fusionsproteine von Mba1 ^1-275 und Mba1 ^1-273 stabil sind, korrekt in der mitochondrialen Innenmembran lokalisiert sind und im Vergleich zu Wildtyp-Mba1 keinen signifikanten Unterschied bezüglich der Membranständigkeit aufweisen.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass mit Hilfe der Konfokalmikroskopie gezeigt werden konnte, dass die Deletionsvariante Mba1 ^1-275 unter fermentativen Wachstumsbedingungen bevorzugt am Rand vergrößerter Mitochondrien vorliegt, wie es bereits für Mba1 dokumentiert wurde (siehe Kapitel 4.2.2 und 4.3.3.4). Im Gegensatz dazu lokalisiert die Deletionsvariante Mba1 ^1-273 im Inneren der vergrößer-ten Mitochondrien, was auf eine Anreicherung in der Cristaemembran hindeutet. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde eine elektronenmikroskopische Analyse durchgeführt. Die Deletion der letzten fünf Aminosäuren des Mba1-Proteins führt zu einer eindeutigen Verlagerung der Mba1-Verteilung, da die Mehrheit der Mba1 ^1-273-Proteine in Mitochondrien mit Wildtypmorphologie in der Cristae-membran zu finden ist. Da mit Hilfe der Elektronenmikroskopie neben Mitochondrien mit Wildtyp-morphologie auch Mitochondrien mit Proteinaggregationsstrukturen beobachtet wurden, wurde geklärt, ob sich die C-terminale Markierung auf die Eigenschaften der Mba1 ^1-273-Fusionsproteine auswirkt und so zu einer Fehllokalisation führt. Unter Einsatz proteinbiochemischer Kontrollanalysen wurde jedoch nachgewiesen, dass sich die Mba1 ^1-273-Fusionsproteine weitestgehend wie Wildtyp-Mba1 verhalten und die dokumentierte Wildtyp-Mba1 ^1-273-Verteilung demnach nicht mit einer Instabilität oder einer gravierend verminderten Membranständigkeit von Mba1 ^1-273 in Verbindung steht. Aus diesen Daten lässt sich schließen, dass es sich bei den fünf Aminosäuren, die in Mba1 ^1-273 deletiert sind, um einen für die Lokalisation von Mba1 kritischen Bereich im C-Terminus handelt.

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4.3.4.3 Auswirkungen von Substitutionsmutationen im MBA1-Gen auf die