5.2 Charakterisierung von Mba1 in S. cerevisiae
5.2.2 Der C-Terminus von Mba1 ist essentiell für die submitochondriale Lokalisation von Mba1
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit lagen keine weitreichenden Kenntnisse bezüglich funktionaler Domänen von Mba1 vor. Aus der Literatur war bisher nur bekannt, dass Mba1 über eine amino-terminale Präsequenz mit einer Länge von 33 Aminosäuren verfügt, über die Mba1 aus dem Zytosol in
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das Mitochondrium importiert wird, und, dass das Mba1-Protein sich durch zwei hydrophobe Aminosäureregionen auszeichnet, mit deren Hilfe es vermutlich peripher an die innere mitochondriale Membran bindet (Rep & Grivell, 1996). Weitere Studien belegten jedoch, dass Mba1 sowohl mit Translationsprodukten als auch mit mitochondrialen Ribosomen interagiert (Preuss et al., 2001; Ott et al., 2006; Gruschke et al., 2010). Darüber hinaus wurde eine Interaktion von Mba1 und Mdm38 nach-gewiesen (Bauerschmitt et al., 2010). Diese Studien geben Grund zu der Annahme, dass das Mba1-Protein noch weitere funktionale Domänen aufweist. Es ist davon auszugehen, dass solche Domänen höchstwahrscheinlich im C-terminalen Bereich von Mba1 lokalisiert sind, da der Mba1-N-Terminus auf Grund der nahe gelegenen hydrophoben Aminosäureregionen deutlich kürzer ist (Abb. 5.1).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals die Auswirkungen von Deletionen und Substitutionen im C-Terminus von Mba1 auf die submitochondriale Lokalisation von Mba1 untersucht. Zu diesem Zweck wurden zunächst alle in dieser Arbeit hergestellten Deletions- und Substitutionsmutanten mit Hilfe der Konfokalmikroskopie unter Verwendung genetisch vergrößerter Mitochondrien hinsichtlich ihrer bevorzugten Lokalisation untersucht. Für die elektronenmikroskopische Lokalisationsanalyse wurden jedoch nur die zwei Varianten Mba1 1-273 und Mba1-I272A ausgewählt, da es sich bei Mba1 1-273 um die Variante mit der kürzesten Deletion und bei Mba1-I272A um die Variante mit der geringfügigsten strukturellen Veränderung des Mba1-Proteins handelt.
Die Lokalisationsanalyse zahlreicher Deletionsmutanten von Mba1 führte zu der Erkenntnis, dass bereits die Deletion der letzten fünf Aminosäuren des C-Terminus von Mba1 in einer Veränderung der Mba1-Verteilung resultiert. So weist die mutierte Variante Mba1 1-273 unter fermentativen Wachstums-bedingungen eine deutliche Anreicherung in der Cristaemembran auf, während für Mba1 eine präferentielle Lokalisation in der inneren Grenzflächenmembran dokumentiert wurde. Interessanter-weise konnte dieser Aminosäureabschnitt im Mba1-C-Terminus zusätzlich durch die Lokalisations-analyse einer Vielzahl von Mba1-Substitutionsvarianten identifiziert werden. So weisen auch die mutierten Varianten Mba1-D271A, Mba1-I272A, Mba1-Y273A und Mba1-R274A eine zu Mba1 gegensätzliche Lokalisation auf, wie es zuvor für die Variante Mba1 1-273 gezeigt wurde.
Diesen Daten zufolge ist der identifizierte C-terminale Bereich, im Speziellen die mit Hilfe der Substitutionsmutationen entdeckte Aminosäuresequenz „Asp-Ile-Tyr-Arg“, essentiell für die korrekte submitochondriale Lokalisation von Mba1 in S. cerevisiae (Abb. 5.1). Es ist anzunehmen, dass es sich bei dem entdeckten C-terminalen Aminosäureabschnitt um eine funktionale Domäne des Mba1-Proteins handelt. In der Literatur wurden für das Mba1-Protein von S. cerevisiae zahlreiche funk-tionale Homologe in verschiedenen Spezies beschrieben, die von weiteren Pilzen über Pflanzen bis hin zu Säugern, wie beispielsweise humanes Mrpl45, reichen (Smits et al., 2007). Um zu untersuchen, ob der in dieser Arbeit identifizierte C-terminale Bereich von Mba1 und vor allem die Sequenz
„Asp-Ile-Tyr-Arg“ in verschiedenen Spezies konserviert ist, wurde ein Aminosäuresequenzvergleich unter Zuhilfenahme des webbasierten Programms „ClustalW“ des SIB ExPASy Bioformatics Resources Portal erstellt. Während der Aminosäuresequenzvergleich des C-terminalen Bereichs von
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Mba1 aus S. cerevisiae mit humanem Mrpl45 keine Übereinstimmung bezüglich der in dieser Arbeit identifizierten Sequenz „Asp-Ile-Tyr-Arg“ ergab (Daten nicht gezeigt), waren beim Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener Pilzarten weitreichende Übereinstimmungen bezüglich der Sequenz „Asp-Ile-Tyr-Arg“ zu verzeichnen (Abb. 5.1). Dieser Erkenntnis zufolge könnte es sich bei der identifizierten Aminosäuresequenz „Asp-Ile-Tyr-Arg“ im C-Terminus von Mba1 zumindest um eine in näher verwandten Pilzen konservierte funktionale Domäne des Mba1-Proteins handeln.
Abb. 5.1: Schematische Darstellung der lokalisationsveränderten Mba1-Varianten im Kontext eines Aminosäuresequenzvergleichs des C-terminalen Bereichs von Mba1-Proteinen verschiedener Spezies.
Im oberen Teil der Abbildung sind die verschiedenen Mba1-Varianten dargestellt, für welche im Rahmen dieser Arbeit eine zu Mba1 gegensätzliche Lokalisation festgestellt wurde. Die Position der letzten Aminosäure der Deletionsmutation und die Positionen der jeweiligen Aminosäuren, die mit Alanin substituiert wurden, sind fett hervorgehoben. Der grüne Bereich markiert die aminoterminale Präsequenz und die violetten Bereiche die zwei hydrophoben Aminosäureregionen. Im unteren Teil der Abbildung ist ein Aminosäuresequenzvergleich des C-terminalen Bereichs von Mba1-Proteinen aus S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus, S. kluyveri, C. glabrata, C. albicans, A. gossypii, K. lactis, N. crassa und S. pombe dargestellt. Weitreichend überein-stimmende Aminosäuren wurden blau hinterlegt. Dieser Sequenzvergleich wurde mit dem webbasierten Programm „ClustalW“ des SIB ExPASy Bioformatics Resources Portal erstellt (Tab. 3.13).
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Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit festgestellt, dass die Deletionsmutante Mba1 1-273 und die Substitutionsmutante Mba1-I272A einen temperatursensitiven Lokalisationsphänotyp aufweisen. So wurde für Mba1 auch bei einer niedrigeren Wachstumstemperatur eine präferentielle Lokalisation in der inneren Grenzflächenmembran beobachtet, während im Fall der mutierten Varianten Mba1 1-273 und Mba1-I272A eine deutliche Lokalisationsverschiebung zu verzeichnen ist. So liegen Mba1 1-273 und Mba1-I272A bei einer niedrigeren Temperatur nicht mehr präferentiell in der Cristaemembran vor, sondern weisen eine Anreicherung in der inneren Grenzflächenmembran auf, welche der submitochondrialen Lokalisation von Mba1 entspricht.
Des Weiteren wurden mit Hilfe der Elektronenmikroskopie Strukturen innerhalb der Mitochondrien beobachtet, bei denen es sich womöglich um Proteinaggregationen handelt, die durch die Expression von mba1 1-273 und mba1-I272A verursacht werden. Die statistische Auswertung der Häufigkeit der Mitochondrien mit Proteinaggregationsstrukturen ergab, dass der prozentuale Anteil an Mitochondrien mit Aggregaten bei der Expression von mba1 1-273 merklich höher ist, als der bei der Expression von mba1-I272A. Dieses Ergebnis könnte darauf zurückgeführt werden, dass sich die Deletion von fünf Aminosäuren im Mba1-C-Terminus stärker auf die Struktur des Mba1-Proteins auswirkt als die Substitution einer einzelnen Aminosäure. Dieser Effekt konnte auch beim Vergleich der GFP- und FLAG-Fusionsproteine beobachtet werden. So waren die prozentualen Anteile an Mitochondrien mit Aggregaten im Fall der GFP-Fusionsproteine merklich höher, als bei den FLAG-Fusionsproteinen.
Auch hier wäre es denkbar, dass sich die Fusionierung mit GFP stärker auf die Struktur der Mba1-Varianten auswirkt als die Fusionierung mit dem FLAG-Peptid. Abschließend stellte sich bei der elektronenmikroskopischen Analyse der mutierten Varianten Mba1 1-273 und Mba1-I272A bei einer niedrigeren Wachstumstemperatur heraus, dass die Expression von mba1 1-273 und mba1-I272A deutlich weniger bzw. gar keine Proteinaggregationen mehr verursacht.
Diese Daten deuten zum einen darauf hin, dass sich die Mutationen mba1 1-273 und mba1-I272A nicht nur auf die Lokalisation, sondern auch auf die Funktion von Mba1 auswirken, und zum anderen, dass eine niedrigere Wachstumstemperatur zu einer Abmilderung der Folgen der Mutationen führt.