8.12.1 Einfluss der Mba1-Fusionsproteine auf die Morphologie und die Funktionalität von Mitochondrien
Abb. 8.22: Epifluoreszenzmikroskopische Analyse der mitochondrialen Morphologie unter dem Einfluss der Expression von MBA1-GFP.
Die Stämme BY4741 WT mit pVT100U-mt-GFP (A), ∆mba1 (BY4741) mit pVT100U-mt-GFP (B) und
∆mba1 (BY4741) mit MBA1-GFP-Plasmid (C) wurden in Galaktose- oder Laktatmedium bei 30 °C kultiviert. Die Expression von MBA1-GFP hat keinen erkennbaren Einfluss auf die Mitochondrienmorphologie oder das Membranpotential. Von links nach rechts sind das Hellfeldbild, das Fluoreszenzbild für GFP und MitoTracker Red CM-H2XRos sowie eine Überlagerung der Fluoreszenzsignale dargestellt. Größenstandard = 10 µm.
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Abb. 8.23: Epifluoreszenzmikroskopische Analyse der mitochondrialen Morphologie unter dem Einfluss der Expression von mba1 1-275-GFP, mba1 1-273-GFP und mba1-I272A-GFP.
Der ∆mba1-Stamm (BY4741) mit mba1 1-275-GFP-Plasmid, mit mba1 1-273-GFP-Plasmid bzw. mit mba1-I272A-GFP-Plasmid wurde in Galaktosemedium bei 30 °C kultiviert. Die Expression der MBA1-GFP-Fusionskonstrukte hat keinen erkennbaren Einfluss auf die Mitochondrienmorphologie oder das Membranpotential. Von links nach rechts sind das Hellfeldbild, das Fluoreszenzbild für GFP und MitoTracker Red CM-H2XRos sowie eine Über-lagerung der Fluoreszenzsignale dargestellt. Größenstandard = 10 µm.
Abb. 8.24: Epifluoreszenzmikroskopische Analyse der mitochondrialen Morphologie unter dem Einfluss der Expression von MBA1-FLAG-Varianten.
∆mba1-Hefen (BY4741), die MBA1-FLAG, mba1 1-275-FLAG, mba1 1-273-FLAG oder mba1-I272A-FLAG vom Plasmid exprimierten, wurden in Galaktose- oder Laktatmedium bei 30 °C kultiviert. Die Expression der MBA1-FLAG-Fusionskonstrukte hat keinen erkennbaren Einfluss auf die Mitochondrienmorphologie oder das Membranpotential. Von links nach rechts sind jeweils das Hellfeldbild, das Fluoreszenzbild für GFP und MitoTracker Red CM-H2XRos und eine Überlagerung der Fluoreszenzsignale dargestellt.
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8.12.2 Lokalisation von Mba1 in Abhängigkeit von Deletions-mutationen im MBA1-Gen in vergrößerten Mitochondrien
Für die Voranalyse der submitochondrialen Lokalisation von Mba1-GFP-Varianten, bei denen Amino-säuren im C-Terminus deletiert waren, wurden ∆mba1-Hefezellen der YKODC verwendet. Die Hefe-stämme exprimierten MBA1 1-277-GFP, MBA1 1-276-GFP, MBA1 1-275-GFP, MBA1 1-274-GFP, MBA1 1-273-GFP oder MBA1 1-272-GFP unter der Kontrolle des nativen MBA1-Promotors von einem Plasmid. Über die Deletion von MDM10 wurden Zellen mit vergrößerten Mitochondrien erzeugt, die auf Agarplatten mit der fermentierbaren Kohlenstoffquelle Glukose bei 30 °C kultiviert wurden. Die konfokalmikroskopische in vivo-Untersuchung zeigt, dass Mba1 1-277-GFP, Mba1 1-276-GFP und Mba1 1-275-GFP am Rand der genetisch vergrößerten Mitochondrien lokalisieren und Mba1 1-274-GFP intermediär. Mba1 1-273-GFP und Mba1 1-272-GFP sind im Inneren der vergrößerten Mitochondrien angereichert (Abb. 8.25).
Abb. 8.25: Konfokalmikrosko-pische Lokalisationsanalyse von Mba1-GFP-Varianten mit C-terminalen Deletionen in ver-größerten Mitochondrien unter fermentativen Bedingungen.
∆mba1-Hefen (YKODC), die mba1 1-277-GFP, mba1 1-276-GFP, mba1 1-275-GFP, mba1 1-274-GFP, mba1 1-273-GFP oder mba1 1-272 -GFP vom Plasmid exprimierten, wurden auf Glukoseplatten bei 30 °C kultiviert. Mba1 1-277-GFP, Mba1 1-276-GFP und Mba1 1-275 -GFP lokalisieren am Rand und Mba1 1-274-GFP intermediär in vergrößerten Mitochondrien.
Mba1 1-273-GFP und Mba1 1-272 -GFP sind im Inneren der ver-größerten Mitochondrien angerei-chert. Von links nach rechts sind jeweils das Hellfeldbild und GFP-Fluoreszenzbild sowie ein Intensi-tätsprofil des Fluoreszenzsignals dargestellt. Weißer Kasten: für die Intensitätsprofilerstellung ver-wendeter Bereich. Größenstan-dard = 2 µm.
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Um die in Abbildung 8.25 beobachteten submitochondrialen Lokalisationen der Mba1-Deletions-varianten zu überprüfen und gleichzeitig einen Hinweis darauf zu erhalten, ob die analysierten Hefe-zellen eine intakte Cristaestruktur aufweisen, wurden doppelmarkierte Stämme (BY4741) eingesetzt.
Diese exprimierten QCR2-mRFP direkt vom Genom und die MBA1-GFP-Varianten unter der Kontrolle des nativen MBA1-Promotors vom Plasmid. MDM10-deletierte Zellen mit vergrößerten Mitochondrien wurden auf Agarplatten mit der fermentierbaren Kohlenstoffquelle Glukose bei 30 °C kultiviert. Die konfokalmikroskopische Untersuchung zeigt, dass Qcr2-mRFP stets im Inneren der vergrößerten Mitochondrien angereichert ist, was auf eine intakte Cristaestruktur der untersuchten Hefezellen hindeutet. Die zuvor beobachteten Proteinverteilungen der Mba1-Deletionsvarianten konnten bestätigt werden (Abb. 4.14, B und Abb. 8.26).
Abb. 8.26: Konfokalmikroskopische Lokalisationsanalyse von Mba1-GFP-Varianten mit C-terminalen Deletionen in vergrößerten Mitochondrien unter fermentativen Wachstumsbedingungen.
QCR2-mRFP-Hefen (BY4741), die mba1 1-277-GFP, mba1 1-276-GFP, mba1 1-274-GFP oder mba1 1-272-GFP vom Plasmid exprimierten, wurden auf Glukoseplatten bei 30 °C kultiviert. Mba1 1-277-GFP und Mba1 1-276-GFP lokalisieren am Rand, Mba1 1-274-GFP intermediär und Mba1 1-272-GFP sowie Qcr2-mRFP im Inneren der ver-größerten Mitochondrien. Von links nach rechts sind das Hellfeldbild, das Fluoreszenzbild für GFP und mRFP, eine Überlagerung sowie ein Intensitätsprofil der Fluoreszenzsignale dargestellt. Weißer Kasten: für die Inten-sitätsprofilerstellung verwendeter Bereich. Größenstandard = 2 µm.
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8.12.3 Lokalisation von Mba1 in Abhängigkeit von Substitutions-mutationen im MBA1-Gen in vergrößerten Mitochondrien
Abb. 8.27: Konfokalmikroskopische Lokalisationsanalyse von Mba1-GFP-Varianten mit C-terminalen Sub-stitutionen in vergrößerten Mito-chondrien unter fermentativen Wachstumsbedingungen.
∆mba1-Hefen (BY4741), die S278A-GFP, P277A-GFP, P276A-GFP, L275A-GFP, R274A-GFP, Y273A-GFP, mba1-D271A-GFP, mba1-G270A-GFP, mba1-N269A-GFP oder mba1-V268A-GFP vom Plasmid exprimierten, wur-den auf Glukoseplatten bei 30 °C kulti-viert. Mba1-S278A-GFP, Mba1-P277A-GFP, Mba1-P276A-Mba1-P277A-GFP, L275A-GFP sowie G270A-L275A-GFP, Mba1-N269A-GFP und Mba1-V268A-GFP lokalisieren am Rand vergrößerter Mito-chondrien. R274A-GFP, Mba1-Y273A-GFP und Mba1-D271A-GFP sind im Inneren der vergrößerten Mito-chondrien angereichert. Von links nach rechts sind jeweils das Hellfeldbild und GFP-Fluoreszenzbild sowie ein Intensi-tätsprofil des Fluoreszenzsignals dar-gestellt. Weißer Kasten: für die Inten-sitätsprofilerstellung verwendeter Be-reich. Größenstandard = 2 µm.
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Abb. 8.28: Konfokalmikroskopische Lokalisationsanalyse von Mba1-GFP-Varianten mit C-terminalen Substitutionen in vergrößerten Mitochondrien unter fermentativen Wachstumsbedingungen.
QCR2-mRFP-Hefen (BY4741), die mba1-S278A-GFP, mba1-P277A-GFP, mba1-P276A-GFP, mba1-L275A-GFP, mba1-R274A-GFP, mba1-Y273A-GFP, mba1-D271A-GFP, mba1-G270A-GFP, mba1-N269A-GFP oder mba1-V268A-GFP vom Plasmid exprimierten, wurden auf Glukoseplatten bei 30 °C kultiviert. S278A-GFP, Mba1-P277A-GFP, Mba1-P276A-GFP, Mba1-L275A-GFP, Mba1-G270A-GFP, Mba1-N269A-GFP und Mba1-V268A-GFP lokalisieren am Rand und Mba1-R274A-Mba1-V268A-GFP, Mba1-Y273A-Mba1-V268A-GFP, Mba1-D271A-Mba1-V268A-GFP und Qcr2-mRFP im Inneren vergrößerter Mitochondrien. Von links nach rechts sind das Hellfeld-, das Fluoreszenzbild für GFP und mRFP, eine Überlagerung sowie ein Intensitätsprofil der Fluoreszenzsignale dargestellt. Weißer Kasten: für die Intensitätsprofilerstellung verwendeter Bereich. Größenstandard = 2 µm.
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Für die Analyse der submitochondrialen Lokalisation von Mba1-GFP-Varianten, bei denen einzelne Aminosäuren im C-Terminus gegen Alanin ausgetauscht wurden, wurden ∆mba1-Hefezellen (BY4741) verwendet. Die Hefestämme exprimierten mba1-S278A-GFP, mba1-P277A-GFP, mba1-P276A-GFP, mba1-L275A-GFP, mba1-R274A-GFP, mba1-Y273A-GFP, mba1-D271A-GFP, mba1-G270A-GFP, mba1-N269A-GFP oder mba1-V268A-GFP unter der Kontrolle des nativen MBA1-Promotors von einem Plasmid. Nachdem das Gen MDM10 deletiert wurde, wodurch Zellen mit vergrößerten Mito-chondrien erzeugt wurden, wurden die Hefestämme auf Agarplatten mit der fermentierbaren Kohlen-stoffquelle Glukose bei 30 °C kultiviert.
Die konfokalmikroskopische Analyse zeigt, dass S278A-GFP, P277A-GFP, Mba1-P276A-GFP, Mba1-L275A-GFP, Mba1-G270A- GFP, Mba1-N269A-GFP sowie Mba1-V268A-GFP, genau wie Mba1-GFP (Abb. 4.11, A), am Rand der vergrößerten Mitochondrien lokalisieren (Abb. 8.27). Im Gegensatz dazu weisen Mba1-R274A-GFP, Mba1-Y273A-GFP und Mba1-D271A-GFP, genau wie Mba1-I272A-GFP (Abb. 4.19, A), eine Anreicherung im Inneren der vergrößerten Mitochondrien auf (Abb. 8.27).
Die in Abbildung 8.27 beobachteten submitochondrialen Verteilungen der Mba1-Substitutions-varianten konnten in QCR2-mRFP koexprimierenden Hefen (BY4741) bestätigt werden (Abb. 8.28).
Die konfokalmikroskopische Analyse zeigt, dass Qcr2-mRFP stets im Inneren der vergrößerten Mito-chondrien angereichert ist (Abb. 8.28), was auf eine intakte Cristaestruktur der untersuchten Zellen hindeutet. Auch für diese konfokalmikroskopische Analyse wurden die verwendeten ∆mdm10-Zellen auf glukosehaltigen Agarplatten bei 30 °C kultiviert.
8.12.4 Lokalisation von Mba1-Varianten in vergrößerten Mitochon-drien bei verschiedenen Wachstumstemperaturen
Um den Einfluss niedrigerer sowie höherer Wachstumstemperaturen auf die submitochondriale Lokalisation von Mba1 1-273 zu analysieren, wurden sowohl mba1 1-273-GFP exprimierende ∆mba1-Hefezellen der YKODC als auch QCR2-mRFP koexprimierende Hefen (BY4741) verwendet. Nach Erzeugung vergrößerter Mitochondrien wurden die Hefezellen auf Glukoseplatten bei 25 °C, 30 °C oder 37 °C kultiviert und konfokalmikroskopisch in vivo analysiert.
Für Mba1 1-273-GFP ist bei 30 °C und 37 °C eine Anreicherung im Inneren der vergrößerten Mito-chondrien und bei 25 °C eine intermediäre Lokalisation zu verzeichnen (Abb. 8.29, A und B). Qcr2-mRFP ist bei allen Temperaturen im Inneren der vergrößerten Mitochondrien angereichert, was auf eine intakte Cristaestruktur hindeutet (Abb. 8.29, B).
Demnach findet bei einer Temperatur von 25 °C, jedoch nicht bei 37 °C, eine Verlagerung der Mba1 1-273-GFP-Verteilung vom Inneren zum Rand der vergrößerten Mitochondrien statt.
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Abb. 8.29: Konfokalmikroskopische Lokalisationsanalyse von Mba1 1-273-GFP in vergrößerten Mitochondrien unter dem Einfluss der Wachtumstemperatur.
∆mba1-Hefen (BY4741) (A) bzw. QCR2-mRFP-Hefen (BY4741) (B) mit mba1 1-273-GFP-Plasmid wurden auf Glukoseplatten bei 25 °C, 30 °C bzw. 37 °C kultiviert. Bei 30 °C bzw. 37 °C lokalisiert Mba1 1-273-GFP im Inneren der vergrößerten Mitochondrien, wohingegen es bei 25 °C eine intermediäre bis randständige Lokalisation aufweist (A, B). Qcr2-mRFP ist stets im Inneren der vergrößerten Mitochondrien angereichert (B). Von links nach rechts sind das Hellfeldbild (A, B), das Fluoreszenzbild für GFP (A, B) und mRFP (B), eine Überlagerung der Fluoreszenzsignale (B) und ein Intensitätsprofil der Fluoreszenzsignale (A, B) dargestellt. Weißer Kasten: für die Intensitätsprofilerstellung verwendeter Bereich. Größenstandard = 2 µm.
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