Durchschnittsgrößen von Oxa1-enthaltenden Komplexen

In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass Oxa1 eine zentrale Rolle bei der Biogenese mitochon-drialer Membranproteine spielt, wobei die molekulare Funktion von Oxa1 bei diesem Prozess weitest-gehend unverstanden ist (Hell et al., 1998; Hell et al., 2001; Bohnert et al., 2010; Hildenbeutel et al., 2012). Es wird vermutet, dass Oxa1 in vivo in homooligomeren Komplexen vorkommt und möglicher-weise eine Art Importpore formt (Reif et al., 2005; Kohler et al., 2009; Krüger et al., 2012).

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In den Studien von Nargang et al. und Reif et al. wurde für Oxa1 von N. crassa und S. cerevisiae berichtet, dass Oxa1 in Form von Homotetrameren vorliegt, während die Daten von Kohler et al. auf ein Homodimer, das eine Pore formt, hindeuten (Nargang et al., 2002; Reif et al., 2005; Kohler et al., 2009). Eine neuere Studie schlägt vor, dass Oxa1 als Protein-translozierender Kanal fungiert, wobei jeweils vier Oxa1-Proteine miteinander kooperieren und eine homotetramere Einheit bilden, die sich aus zwei funktional gekoppelten Oxa1-Dimeren zusammensetzt (Krüger et al., 2012).

Analysen bezüglich der durchschnittlichen Größe von Oxa1-Komplexen der dieser Arbeit voraus-gegangenen Doktorarbeit (Stoldt, 2010) haben gezeigt, dass die Mutation oxa1-W128F zu einer Ver-kleinerung der Oxa1-enthaltenden Komplexe führt. Wie auch für Oxa1-W128F, wurde für Oxa1 bei Wachstum mit der nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle Laktat eine Verschiebung der Lokalisation von der inneren Grenzflächenmembran zur Cristaemembran beobachtet. Es ergibt sich die Frage, ob es einen Zusammenhang zwischen der präferierten Lokalisation von Oxa1 und der Größe von Oxa1-enthaltenden Komplexen gibt und sich demzufolge die Größen der Oxa1-Oxa1-enthaltenden Komplexe unter fermentativen Bedingungen von denen unter respiratorischen Bedingungen unterscheiden. Für die Bearbeitung dieser Fragestellung wurde die Methode der Blau-Nativen-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE) angewandt, da sie den Nachweis von natürlich vorkommenden Protein-komplexen ermöglicht (Wittig et al., 2006).

4.1.1.1 Stabilität von Oxa1-FLAG-Varianten

In der vorliegenden Arbeit wurde die durchschnittliche Größe von Oxa1- bzw. Oxa1-W128F-enthaltenden Komplexen mit Hilfe der BN-PAGE analysiert. Hierfür kamen die Stämme zum Einsatz, die in der vorausgegangenen Doktorarbeit (Stoldt, 2010) verwendet wurden. Bei diesen Stämmen ist die genomische Kopie von OXA1 deletiert und die Fusionsgene OXA1-FLAG und oxa1-W128F-FLAG werden unter der Kontrolle des nativen OXA1-Promotors von einem Plasmid exprimiert. In dieser Arbeit wird auf diese Stämme mit folgender Bezeichnung Bezug genommen: „∆oxa1 (für BN-PAGE) mit OXA1-FLAG-Plasmid bzw. mit oxa1-W128F-FLAG-Plasmid“ (siehe Tab. 3.8).

Auf Grund der Verwendung von Fusionskonstrukten wurde zunächst überprüft, ob diese korrekt exprimiert werden und ob sie stabil sind. Sind Fusionsproteine instabil, werden sie proteolytisch verdaut und entstandene Abbauprodukte können zu verfälschten Ergebnissen der BN-PAGE führen.

Zu diesem Zweck wurden Mitochondrien aus dem Wildtyp BY4741 WT mit Vektor2, der als Kontroll-stamm diente, sowie aus den ∆oxa1-Stämmen (für BN-PAGE) mit OXA1-FLAG- bzw. mit oxa1-W128F-FLAG-Plasmid isoliert, die in Galaktose- oder Laktatmedium bei 30 °C kultiviert wurden. Die mitochondrialen Lysate wurden mittels Western-Analyse untersucht. Dazu wurden die Proteine über ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, mittels Nassblot-Verfahren auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und unter Anwendung einer Immundetektion visualisiert.

Das Molekulargewicht der maturierten Form von Oxa1 beträgt ungefähr 40 kDa (Tab. 8.4) und das der Oxa1-FLAG-Varianten etwa 41 kDa (Tab. 8.3). Laut den Angaben des mitgeführten Größenstandards

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für Proteine „Page Ruler™ Plus Prestained Protein Ladder“ (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) (Abb. 8.18) und durch den Einsatz eines FLAG-Antikörpers können Oxa1-FLAG und Oxa1-W128F-FLAG bei etwa 40 kDa nachgewiesen werden (Abb. 4.1, A). Bei den weiteren sichtbaren Protein-banden (Abb. 4.1, A: Markierung mit dem Sternsymbol) handelt es sich höchstwahrscheinlich nicht um Abbauprodukte der Oxa1-FLAG-Varianten, sondern um vom FLAG-Antikörper unspezifisch markierte Proteine, da diese Proteinsignale auch in der Gelspur des Wildtypstamms, der gar kein FLAG-Fusionskonstrukt exprimierte, zu verzeichnen sind.

Weiterhin fällt auf, dass Oxa1-W128F-FLAG unter Verwendung des FLAG-Antikörpers ein schwächeres Proteinsignal als Oxa1-FLAG aufweist. Durch einen zusätzlichen Nachweis mit Hilfe eines Oxa1-Antikörpers kann jedoch gezeigt werden, dass die Mengen des Wildtyp-Oxa1 und der Oxa1-FLAG-Varianten vergleichbar sind (Abb. 4.1, A). Die mit dem Kreissymbol (Abb. 4.1, A) gekennzeichneten Proteinsignale sind möglicherweise Abbauprodukten der Oxa1-FLAG-Varianten oder Proteinen zuzuordnen, die vom Oxa1-Antikörper unspezifisch erkannt wurden.

Abschließend wurde die Membran mit Antikörpern gegen die Ladekontrollen Tim50, Tom20 und Cyc1 dekoriert. Diese Proteine sind bei den erwarteten Molekulargewichten nachweisbar (Tab. 8.4) und zeigen, dass vergleichbare Mengen an Mitochondrien eingesetzt wurden (Abb. 4.1, A).

Da für die Analyse von Oxa1-enthaltenden Komplexen mittels BN-PAGE die Mitochondrien mit dem Detergens Digitonin (2,6 % (w/v)) solubilisiert werden sollten, wurde die Stabilität von Oxa1-FLAG und Oxa1-W128F-FLAG auch unter dem Einfluss von Detergentien überprüft. Hierfür wurden die isolierten Mitochondrien für 30 min mit 0,5 % (w/v) SDS bei RT bzw. mit 2,6 % (w/v) Digitonin bei 4 °C inkubiert. SDS fungierte als Positivkontrolle für eine erfolgreiche Solubilisierung. Anschließend wurden die Lysate bei RT bzw. bei 4 °C zentrifugiert und die Proteine der Überstands- und Sediment-fraktionen mittels Western-Analyse untersucht.

Der Oxa1-Antikörper markiert Oxa1-FLAG und Oxa1-W128F-FLAG wie erwartet bei ca. 40 kDa und Wildtyp-Oxa1 bei einem etwas geringeren Molekulargewicht (Abb. 4.1, B). Neben den Oxa1-Signalen sind noch weitere Proteinbanden zu erkennen (Abb. 4.1, B: Markierung mit dem Kreissymbol), bei denen es sich möglicherweise um Oxa1-Abbauprodukte handelt. In den Gelspuren der Oxa1-FLAG-Proben sind die Signalintensitäten dieser Banden im Verhältnis zu denen der Oxa1-FLAG-Varianten vergleichbar und im Vergleich zu den sichtbaren Signalen in der Gelspur des Wildtyps nicht erhöht.

Deshalb wird angenommen, dass die Detergentien keinen erkennbaren Einfluss auf die Stabilität der Fusionsproteine Oxa1-FLAG oder Oxa1-W128F-FLAG ausüben.

Tim50, Tom20 und Cyc1 sind mit Hilfe der entsprechenden Antikörper bei den erwarteten Molekular-gewichten nachweisbar. Die Signale der Kontrollproteine zeigen zum einen, dass sich die Mengen der aufgetragenen Mitochondrien nur geringfügig unterscheiden, und zum anderen, dass die Mitochon-drien mittels SDS vollständig solubilisiert werden, während bei der Behandlung mit Digitonin ein geringer Proteinanteil in der Sedimentfraktion zurückbleibt (Abb. 4.1, B).

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Abb. 4.1: Überprüfung der Stabilität der Oxa1-FLAG-Varianten.

Die Kultivierung des Wildtyps BY4741 WT mit Vektor2 und der ∆oxa1-Stämme (für BN-PAGE) mit OXA1-FLAG- bzw. oxa1-W128F-FLAG-Plasmid erfolgte in Medium mit Galaktose (G) oder Laktat (L) bei 30 °C (A, B).

(A) Die Lysate isolierter Mitochondrien wurden mittels Western-Analyse untersucht, wobei die Membran zunächst mit FLAG-Antikörper und danach mit Antikörpern gegen Oxa1, Tim50, Tom20 und Cyc1 dekoriert wurde.

(B) Isolierte Mitochondrien wurden mit 0,5 % (w/v) SDS bzw. mit 2,6 % (w/v) Digitonin solubilisiert. Mit Hilfe der Western-Analyse wurden die Proteine des Sediments (S) bzw. des Überstands (Ü) untersucht. Die Membran wurde erst mit Oxa1-Antikörper und danach mit Tim50-, Tom20- und Cyc1-Antikörpern dekoriert.

(A) Unspezifische Proteinsignale ( ). (A, B) Oxa1-Abbauprodukte oder unspezifische Proteinbanden ( ).

Oxa1-FLAG bzw. Oxa1-W128F-FLAG weisen unabhängig von der verwendeten Kohlenstoffquelle oder dem eingesetzten Detergens im Vergleich zum Wildtyp-Oxa1 keinen siginifikanten Unterschied bezüglich der Proteinstabilität auf. Die ∆oxa1-Stämme (für BN-PAGE) mit OXA1-FLAG- bzw. mit oxa1-W128F-FLAG-Plasmid konnten für die BN-PAGE eingesetzt werden.

4.1.1.2 BN-PAGE zur Analyse von Oxa1-enthaltenden Komplexen

Um die durchschnittlichen Größen von Oxa1-Komplexen zu untersuchen, wurden die ∆oxa1-Stämme (für BN-PAGE) mit OXA1-FLAG- bzw. mit oxa1-W128F-FLAG-Plasmid in Galaktose- bzw. in Laktatmedium bei 30 °C angezogen. Des Weiteren kamen der Wildtypstamm BY4741 WT und der ∆oxa1-Stamm (für BN-PAGE), die beide Vektor2 enthielten, zum Einsatz. Sie fungierten als Kontrollen und wurden ebenfalls in Galaktosemedium bei 30 °C kultiviert. Isolierte Mitochondrien wurden mit 2,6 % (w/v) Digitonin solubilisiert und über ein 4 → 16 % iges (w/v) BN-Polyacryl-amidgel (Novex, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) aufgetrennt. Die Proteine wurden mittels Nass-Blot-Verfahren auf eine PVDF-Membran übertragen und die Oxa1-FLAG-Varianten über eine Markierung mit FLAG-Antikörper visualisiert.

In den Gelspuren der Oxa1-FLAG-Proben wurden spezifisch Oxa1-enthaltende Komplexe markiert, da in der des Wildtyps BY4741 WT mit Vektor2 und der des ∆oxa1-Stamms (für BN-PAGE) mit Vektor2, wie erwartet, kein signifikantes Proteinsignal sichtbar ist (Abb. 4.2, A).

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Die Größen der Oxa1-FLAG-enthaltenden Komplexe variieren sowohl unter fermentativen als auch respiratorischen Bedingungen über einen relativ großen Bereich. Laut den Angaben des mitgeführten Größenstandards für native Proteinkomplexe „Native Mark™ unstained Protein Standard“) (Novex, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) (Abb. 8.18) erstreckt sich dieser Größenbereich schätzungs-weise von 150 kDa bis 600 kDa. Bei Wachstum mit der fermentierbaren Kohlenstoffquelle Galaktose sind zwei starke Proteinsignale bei ca. 300 kDa und 400 kDa sowie ein schwächeres Signal bei etwa 500 kDa sichtbar. Im Vergleich dazu sind bei Wachstum mit der nicht-fermentierbaren Kohlenstoff-quelle Laktat drei relativ gleich starke Signale bei ungefähr 200 kDa, 300 kDa und 450 kDa sowie ein schwächeres Signal bei etwa 150 kDa zu erkennen. Im Gegensatz dazu betragen die durchschnittlichen Größen der Oxa1-W128F-FLAG-enthaltenden Komplexe zwischen 80 kDa und 450 kDa, wobei die zwei höchsten Signalintensitäten bei etwa 80 kDa und 160 kDa zu verzeichnen sind, die in ihren apparenten Größen im Bereich von Oxa1-Dimeren bzw. Oxa1-Tetrameren liegen (Abb. 4.2, A und B).

Abb. 4.2: Analyse der durchschnittlichen Größe von Oxa1-enthaltenden Proteinkomplexen.

(A) Der Wildtyp BY4741 WT mit Vektor2 und die ∆oxa1-Stämme (für BN-PAGE) mit Vektor2, mit OXA1-FLAG- bzw. oxa1-W128F-FLAG-Plasmid wurden in Galaktose- oder Laktatmedium bei 30 °C kultiviert. Isolierte Mito-chondrien wurden mit 2,6 % (w/v) Digitonin solubilisiert, die Lysate über BN-PAGE aufgetrennt und mittels Western-Analyse unter Verwendung des FLAG-Antiköpers untersucht. Die höchsten Signalintensitäten, die in einer Gelspur sichtbar sind, wurden mit Pfeilen markiert und entsprechen den Peaks des in (B) abgebildeten Graphen, der die normalisierten Intensitätsprofile der Chemilumineszenzsignale gesamter Gelspuren aus (A) darstellt: ∆oxa1-Stamm (für BN-PAGE) mit OXA1-FLAG-Plasmid (Galaktose) (blaue Kurve), mit oxa1-W128F-FLAG-Plasmid (Galaktose) (grüne Kurve) und mit OXA1-oxa1-W128F-FLAG-Plasmid (Laktat) (rote Kurve).

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Zusammenfassend ist festzuhalten, dass ausschließlich die Mutation oxa1-W128F zu einer deutlichen Verringerung der durchschnittlichen Komplexgrößen führt. Auch wenn die Oxa1-enthaltenden Komplexe bei Wachstum mit Galaktose tendenziell geringfügig größer sind als bei Wachstum mit Laktat ist kein deutlicher Unterschied in den Komplexgrößen erkennbar. Sowohl unter fermentativen als auch respiratorischen Bedingungen liegt der Großteil von Oxa1 in größeren Komplexen als die Variante Oxa1-W128F vor. Demnach scheint die Lokalisationsveränderung von Oxa1, die aus der Verwendung der nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle Laktat resultiert, einem anderen Regula-tionsmechanismus als die Verlagerung der Oxa1-Verteilung, die durch die Einführung der Mutation oxa1-W128F induziert wird, zu unterliegen.